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昨天母亲节，网上看到一位选美冠军及其妈妈的照片。据说她们2003年就开始用护花呤，还一直建议我开发小孩用的护肤品，没想到转眼间，小孩都已经长大成人，而妈妈依然年轻。 我一直有读医学论文的爱好，今天读到2024年4月12日《国际分子科学杂志》发表的一篇论文（doi:10.3390/JMS 25084282），将冬虫夏草菌的另一种抗皱纹原理解释得更清楚，与护花呤的发明专利的解释相辅相成。
参考《谈成分：肌肤减龄20岁的核心成分？冬虫夏草菌能提取到什么？》，这说明了：冬虫夏草菌应该有更强大的抗皱纹效果才对，所以，50岁眼部没有皱纹一点不奇怪。 我并不是做研究的人，年轻时凭灵感获得了一个国家发明专利，但一直弄不清楚它的原理。这篇论文虽然解答了我一些疑问，但仍然不够充分。说实在话，我不太认同西方人的方法论，并不认为像屠呦呦那样，遵守西方的游戏规则获诺贝尔奖就能做出更好的药物。 因为，这样精确提取有效成分的方法，忽略生物体内各种成分的协同，可能更容易造成耐药。屠呦呦提取的青蒿素已经耐药了。单独使用虫草素与腺苷会不会也更容易耐药呢？要知道，我做的产品起码可以用23年以上不产生耐药的。 同样一种中药，可能有几百种不同的品种类别，哪一种更好？中药还讲究组方，让药物更有效更安全……咱们东方人可能更喜欢研究这些。 我认为结合东方人与西方人的方法论，能做出更好的产品。参考《从护花呤谈国产替代，设计媲美世界顶尖产品的方法论》。 kimi论文综述这篇综述文章探讨了冬虫夏草菌丝体水乙醇提取物（CsEx）的潜在抗衰老特性。以下是对文章内容的概述：
以下论文的软件翻译： 论文：冬虫夏草提取物NAD驱动的Sirtuin激活:探索促进皮肤长寿的适应原潜力摘要：近年来，人们越来越关注利用传统中药和天然生物活性化合物来对抗与年龄相关的疾病并延长寿命。A虫草菌丝体水乙醇提取物（CsEx）使用UHPLC-DAD对虫草素和腺苷进行了标准化，通过体外试验和一项涉及40名受试者的双盲、安慰剂对照临床试验研究了其适应原性。CsEx在0.0006%的浓度下表现出活性，显著增加了sirtuin的表达（SirT1: +33%，SirT3: +10%，SirT6: +72%，与CTR相比，p < 0.05) and NAD+ synthesis in HaCat cells (+20% vs. CTR, p < 0.001). Moreover, the CsEx boosted ATP production by 68% in skin cells, correlating with higher skin energy values (+52.0% at D28, p < 0.01) in the clinical trial. Additionally, CsEx notably reduced cytosolic reactive oxygen species (ROS) by 30% in HaCaT cells (p < 0.05) and enhanced collagen production both in vitro (+69% vs. CTR, p < 0.01) and in vivo (+10% vs. D0, p < 0.01), confirmed by ultrasound examination. Furthermore, CsEx’s stimulation of fibroblasts, coupled with its antioxidant and energizing properties, led to a significant reduction in wrinkles by 28.0% (D28, p < 0.001). This study underscores 虫草水乙醇提取物在调节皮肤细胞能量代谢和积极影响皮肤寿命控制相关机制方面的潜力。 关键词:皮肤能量、虫草素、长寿、sirtuins、适应原 1.介绍衰老过程是一个多方面的现象，包括随着时间的推移在生物体内发生的无数生理、心理和生物化学变化。随着个体年龄的增长，他们的各种身体功能会逐渐衰退，导致对与年龄相关的疾病的易感性增加，以及整体生活质量下降。尽管医学取得了重大进步，但老龄化的复杂性仍然是一个艰巨的挑战，因此有必要采取综合措施来减轻其影响。 传统中医提供了一个整体框架，将衰老视为受身体系统平衡与和谐影响的自然过程。中医的根源可以追溯到几千年前，它强调在保持健康和幸福方面精神、身体和心灵的相互联系。 近年来，人们越来越有兴趣利用中医原理和天然生物活性分子的治疗潜力来解决与年龄有关的疾病并促进健康老龄化。来源于植物、草药和其他自然资源的天然生物活性分子具有多种药理学特性，可以调节与衰老相关的细胞过程，如氧化应激，炎症和细胞衰老。 长期以来，中医依靠来自植物、动物和矿物的天然产品来促进健康和治疗各种疾病。在这些自然资源中，真菌由于其有效的治疗特性，特别是作为适应原而显得尤为重要。适应原是帮助身体适应压力并提高其表现的物质，通过促进平衡和弹性而不引起明显的副作用。真菌，比如灵芝（灵芝），虫草（曹霞），香菇（香菇），黑木耳（木耳），云芝云志）和银耳（银耳），富含生物活性化合物，如多糖，三萜类化合物、类黄酮和酚类化合物，几个世纪以来一直被中医用于增强身体抵抗力、增强活力和恢复平衡，通过支持长寿和活力对衰老过程产生有益影响。 其中，虫草是属于子囊菌科的一种寄生真菌麦角菌科。更准确地说，冬虫夏草是一个真菌属，包括400多个不同种类，包括C.中国虫草, C.蛹虫草，以及C.蛇舌草，具有不同的特性和潜在的健康益处。 在中医里，虫草因其适应原性而受到高度重视。先前的研究已经证明了其改善线粒体功能的潜力并增强能量代谢，同时提高细胞中的氧气利用率，这可能有助于其抗衰老作用。仅见于中国、尼泊尔、不丹和西藏海拔3000至5000米的山区。 此外，C.中国虫草含有生物活性化合物，如多糖、虫草素、腺苷和许多其他有助于其药理活性的植物化学物质。在…期间C.中国虫草传统上在中医中用于各种健康目的，包括促进长寿和活力，但专门针对其对人类皮肤衰老的影响的研究仍然相对稀少，仅归因于其对紫外线的光保护活性。本文通过将中医的古老智慧与现代科学进步相结合，探索了天然生物活性分子在治疗与年龄相关的疾病方面的潜力。更准确地说，在佛罗伦萨大学中药组成员的指导下，我们从冬虫夏草菌丝体中制备了一种含有知名中药生物活性分子的提取物（CsEx）。为了探索CsEx的潜力，使用体外试验研究了其对几种年龄相关标志物的活性。具体来说，为了确定其促进SirT1、SirT3和SirT6等寿命标志物的能力，研究了ATP和前胶原I的产生以及压力屏蔽效应，通过TLR3表达、胞质ROS消耗和NAD恢复评估了压力屏蔽效应。SirT1、SirT3和SirT6是称为sirtuins的蛋白质，与调节细胞过程和延长各种生物体的寿命有关。这些蛋白质表现出抗炎和抗氧化特性，有助于细胞健康和抗衰老损伤的能力。三磷酸腺苷（ATP）是细胞的能量来源，对维持细胞功能和整体健康至关重要。最佳ATP水平与寿命相关，反映了高效的细胞能量代谢。胶原蛋白前体I，胶原蛋白的前体，保持皮肤的完整性和水合作用，这两者对年轻的外表和整体活力至关重要。这些标记共同标志着细胞健康和衰老过程的关键方面，突出了它们在长寿研究和抗衰老干预中的重要性。 在这项研究中，a虫草菌丝体水乙醇提取物（CsEx）使用which达德法对虫草素和腺苷进行了标准化，通过对皮肤细胞的体外分析和一项双盲、安慰剂对照临床试验研究了其适应原分子机制，该试验涉及40名患有各种皮肤衰老相关疾病的受试者，如缺乏紧致和松弛、皱纹以及皮肤疲劳和暗淡。在通过封闭斑贴试验验证其皮肤耐受性后，这些受试者用含有CsEx的局部制剂治疗28天。这种全面的方法旨在阐明CsEx适应原性的分子机制，并评估其在缓解常见皮肤衰老症状方面的功效。 这项研究代表了抗衰老干预措施的重大进步，将传统中医与现代科学相结合。通过调查虫草菌丝体提取物（CsEx）由于其在治疗与年龄相关的疾病方面的潜力，该研究率先探索了长寿标志和抗衰老效果之间的关系。它还首次揭示了线粒体ATP产生和皮肤能量之间的相关性，为皮肤衰老机制提供了新的见解。这项研究为在传统知识和当代科学理解的基础上制定有针对性的抗衰老策略奠定了基础。此外，经临床试验验证的研究结果表明虫草通过利用其适应特性促进健康老化来解决皮肤老化问题。 2.结果2.1.冬虫夏草提取物的制备及化学表征 众所周知，C.中国虫草富含多种活性成分，主要包括虫草素、腺苷、甾醇和多种多糖。虫草素（3′-脱氧腺苷）是一种核苷类似物，由嘌呤分子连接到核糖上组成，是虫草中最具代表性的生物活性成分和质量标志C.中国虫草子实体。然而，用特定的生长补充剂喂养也可以提高菌丝体培养物中生物活性代谢物如虫草素的产量C.中国虫草。研究发现，在超声波作用下和使用乙醇浓度为50%的水提取溶剂时，虫草素的提取率增加。 具体而言，虫草素被鉴定为提取物的主要成分，其浓度为6247±20g/g冻干样品。相反，腺苷含量等于470±55克/克冻干样品。图1显示了冻干样品获得的色谱图C.中国虫草UHPLC-达德分析的水乙醇提取物（表1).  图1 冻干样品在254 nm处的UHPLC-达德色谱图C.中国虫草水乙醇提取物。 表1 通过UHPLC-爸爸分析在CsEx中鉴定和定量的腺苷和虫草素（n= 3).结果表示为平均标准偏差（鉴定化合物的克数/冻干样品的克数）。
此外，如表2，对CsEx中存在的生物活性代谢物进行了全面分析，以突出影响测试结果的其他成分。具体而言，计算出每克冻干样品的总多酚、蛋白质和肽浓度分别为21.2±0.4、23.6±0.1和9.4±0.4毫克。此外，CsEx显示了丰富的糖含量，葡萄糖、果糖和蔗糖是主要成分，其浓度分别为每克冻干提取物15.9±0.8、4.7±0.2和1.4±0.1毫克。 表2 CsEx的生物活性代谢物分析。结果表示为平均值±标准偏差（毫克鉴定化合物/克冻干样品）。
2.2.生物活性测定 2.2.1.CsEx对细胞寿命的影响 Sirtuins也称为“长寿蛋白”，与细胞的生命周期密切相关。它们是NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶，通过参与DNA修复、防止端粒磨损和维持基因组完整性来防止细胞衰老。 通过使用半定量PCR监测SirT1、SirT3和SirT6的表达来研究基于寿命的皮肤细胞健康，该半定量PCR在用0.0006%处理6小时的HaCaT细胞上进行w/vCsEx和白藜芦醇，用作阳性对照。如所示图2a，0.0006% CsEx使SirT1、SirT3和SirT6的表达分别增加了约33%、10%和72%。为了验证CsEx是否影响了NAD的诱导，使用特定的分析方法测量了用CsEx或白藜芦醇作为阳性对照处理的HaCaT细胞中NAD的量。如所示图2b，CsEx使NAD的合成增加了20%，阳性对照白藜芦醇使NAD增加了50%以上。
(a的影响C.中国虫草提取物（CsEx）对角质细胞中Sirtuins 1、3和6表达的影响。角质细胞用0.0006% CsEx或白藜芦醇作为阳性对照刺激6小时，然后进行RT-PCR分析。（b）在用CsEx或白藜芦醇处理24小时后，在HaCaT细胞中测定NAD/NADH比率。报告值代表三个独立实验的平均值；控制设置为100%。条形代表标准偏差，星号表示p-根据学生的价值t测试(*p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001). 2.2.2.CsEx对体外ATP生成和体内皮肤能量增加的影响 线粒体是控制细胞代谢的重要细胞器41].线粒体的典型作用是产生三磷酸腺苷（ATP），这是大多数细胞过程的能量来源。我们测量了用CsEx处理的角质细胞中ATP的产生。如所示图3CsEx刺激ATP产生约68%和25%（浓度为0.0006%）w/v和0.002%w/v并具有与白藜芦醇相当的效率。  图3 的影响C.中国虫草提取物（CsEx）对角质细胞ATP生成的影响。角质细胞用0.0006%刺激w/v和0.002%w/v然后诱导裂解。报告值代表三个独立实验的平均值；控制设置为100%。条形代表标准偏差，星号表示p-根据学生的价值t测试(*p < 0.05, ** p < 0.01). 皮肤细胞像身体中的所有细胞一样，进行细胞呼吸以产生代谢过程所需的能量。因此，在这个过程中，它们确实会释放出一些热量。 为了测量用CsEx制剂治疗的志愿者的热损失，我们使用了Tewameter TM Hex(Courage+Khazaka electronic GmbH，Koln，Germany)，这是一种具有30个传感器的新设备，其进一步测量TEWL并检测其他参数，如以W/m表示的热损失2。该参数与局部皮肤能量平衡有关，而皮肤能量平衡与细胞呼吸直接相关，因此与ATP产生直接相关。在临床试验期间，在用含有6mg/L CsEx的局部化妆品制剂治疗7、14和28天后记录皮肤能量，所述CsEx是在溶解22 mL后获得的虫草在75毫升甘油和3毫升1，2-己二醇中的含水乙醇提取物，因此对应于0.0006%的最终CsEx浓度w/v，与体外试验中使用的相同。结果报告于图4 (表S2和S3)显示CsEx在整个治疗期间显著增加了皮肤能量(在D7；D时为25.5%14，两者都有p < 0.001), leading up to 52.0% at the end of the study (D28, p < 0.01). Thus, the CsEx exhibited good efficacy in stimulating skin metabolism, leading to more energized skin, while the placebo showed no significant action as a skin energizer.  图4 的影响C.中国虫草接受治疗的志愿者与安慰剂相比，提取物(CsEx)对皮肤能量的促进作用。（a)皮肤能量平均值SD；（b)皮肤能量平均百分比变化对D0。星号表示相对于D的统计显著值0 (*** p-值介于0.0001和0.001之间)。这$表明与安慰剂相比具有统计学意义的值($ p < 0.05, $$$ p < 0.001). 2.2.3.CsEx对抗氧化活性的影响 抗氧化复合物和内源性免疫系统是皮肤抵御氧化损伤和外部侵害的第一道防线[7,43].保护皮肤免受氧化反应的能力是通过测量与CsEx或抗坏血酸一起温育然后用H2O2. 如所示图5CsEx处理显著减少了胞质ROS的产生(浓度为0.0006%时为30%和22%w/v和0.002%w/v以及用作阳性对照的抗坏血酸。  图5 的影响C.中国虫草提取物(CsEx)对角质细胞中胞质ROS产生的影响。角质形成细胞受到H2O2(450 M)，然后用0.0006%和0.002% CsEx处理2小时，然后诱导裂解。条形代表标准偏差，星号表示p-根据学生的价值t测试(*p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001). 2.2.4.CsEx对胶原蛋白生成的影响 根据CsEx对细胞代谢和氧化保护的作用，为了分析其在胶原诱导中的作用，我们测定了用CsEx或用TGFβ作为阳性对照处理的人真皮成纤维细胞(HDFs)中新合成的I型胶原。 如所示图6，CsEx在两个浓度下都显著刺激了前胶原I的产生，类似于阳性对照TGFβ，表明该提取物在维持正确的真皮色调(图5).  图6 的影响C.中国虫草提取物(CsEx)对皮肤成纤维细胞中前胶原I产生的影响。用0.0006%和0.002%的CsEx刺激细胞24小时。报告值代表三个独立实验的平均值。星号表示统计上的显著值(*)p-值介于0.001和0.01之间)。 为了证实关于促进成纤维细胞中胶原蛋白的有希望的体外结果，研究了配制的CsEx增加登记受试者中胶原蛋白产生的能力。在所有随访中使用超声波检测检查胶原蛋白水平，如所示图5，CsEx能够在14和28天后显著诱导10.5%和10.0%的胶原(餐桌S4)与安慰剂相比(表S5)，这表明对胶原蛋白的产生没有作用。尽管如此，如中报道的回波图所示图7，CsEx通过增加胶原蛋白量和改善真皮束来致密皮肤。  图7 的影响C.中国虫草提取物(CsEx)在28天的局部应用中对胶原蛋白产生的影响。胶原指数平均百分比变化与D0在整个研究期间(治疗7、14和28天后)记录20名志愿者的CsEx和安慰剂组内差异t-测试**p < 0.01, *** p < 0.001), and inter-group difference ANOVA test $ p < 0.05, $$$ p < 0.001). The echo-graphic images were obtained with a 20 MHz HFUS ultrasound probe (DermaScan®c，丹麦奥尔堡的Cortex Technology Aps)，将它放在测试对象的脸上之后。 2.2.5.CsEx对减少皱纹外观的作用 老化过程改变了皮肤的结构和机械性能；因此，皮肤会出现更多皱纹。显微镜下，随着年龄的增长，皮肤表面的精细网格逐渐减少，每条皱纹都变得突出。因此，CsEx对成纤维细胞的刺激作用及其抗氧化和增强活性，以及合理的预测性，在皮肤老化的表型表现中具有关键作用，如皱纹和细纹外观。正如所证明的，我们的研究表明CsEx治疗减少了最明显的面部皱纹。具体而言，使用VISIA 7th（美国新泽西州帕西帕尼市坎菲尔德科学公司）检测T区皱纹（额头和皱眉线），结果显示，随着时间的推移，D区皱纹在统计学上显著减少12.5、19.0和28.0%7，D14、和D28与基线（图8），与安慰剂治疗组的观察结果相反（表S6和S7).这些结果证明了CsEx在治疗最典型的皮肤老化现象中的有效性。  图8 的影响C.中国虫草提取物(CsEx)在28天的局部应用中对胶原蛋白产生的影响。胶原指数平均百分比变化与D0在整个研究期间(治疗7、14和28天后)记录20名志愿者的CsEx和安慰剂组内差异t-测试*p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001), and inter-group difference ANOVA test $ p < 0.05, $$ p < 0.01). The images of forehead wrinkles over a 28-day treatment with 6 mg/L CsEx vs. placebo were obtained with a Visia 7th (Canfield Scientific Inc., Parsippany, NJ, USA). 3.讨论这项研究深入研究了衰老的多方面过程，特别是侧重于皮肤衰老，皮肤衰老受到内在和外在因素的严重影响。衰老是一个基于逐渐衰退的不可避免的过程，身体的许多过程都会发生根本变化。 这项研究的核心是sirtuins，它是参与细胞过程的重要蛋白质，对长寿和抗氧化保护至关重要。Sirtuins是一个依赖NAD+的组蛋白脱乙酰酶家族，参与葡萄糖和脂质代谢等过程，线粒体生物发生，DNA修复、氧化应激、凋亡和炎症。因此，sirtuins被认为是控制寿命的关键蛋白。已经使用不同的策略来增加它们的表达和活性，以延长寿命并保证更好的抗氧化保护和改善代谢；其中之一是使用植物化学物质，这是一种容易获得的化合物。这项研究探索了虫草菌丝体提取物（CsEx）通过将其掺入局部制剂中，靶向sirtuin表达来治疗与年龄相关的疾病。C.中国虫草在传统中医中有着悠久的使用历史，因其明显的适应原性而受到重视。最近，人们非常关注具有适应原活性的天然化合物的个性化，以增强身体对压力的恢复力并支持整体活力和耐力。具体而言，众所周知虫草素这种蘑菇的特征分子是一种具有多靶点药妆潜力的天然化合物。特别是虫草素和腺苷的含量是虫草质量的标志C.中国虫草子实体和特定的生长补充剂可以提高这些生物活性代谢物的产量，甚至在菌丝体中也是如此。该研究中使用的CsEx是标准化的，以达到6247±20克/克的虫草素浓度和470±55克/克的腺苷含量 最近，报道了不仅诱导sirtuins表达而且诱导其可用性对sirtuins酶活性产生真正影响的重要性。通过体外和体内试验，CsEx证明了其增强sirtuin表达的能力（SirT1: +33% vs. CTR，p < 0.05; SirT3: +9% vs. CTR, p < 0.05; SirT6: +72% vs. CTR, p < 0.001) in cultured keratinocytes, which is crucial for cellular energy metabolism and parallelly to induce NAD+ synthesis (+20% vs. CTR, p < 0.001), giving a double effort in sirtuin activation. 通过检查NAD+在细胞能量代谢调节中的关键作用，该研究进一步揭示了CsEx对ATP合成的显著影响，这表明其对细胞能量动力学的潜在影响，细胞能量动力学是皮肤健康和长寿的重要因素。通过在角质细胞上进行的体外测试，我们观察到与未处理的细胞相比，ATP产量显著增加(+68% vs. CTR)，强调了CsEx对细胞能量动力学的潜在影响。在对健康受试者进行的仪器临床试验中证实了这种效果，这些受试者使用创新系统Tewameter TM Hex(Courage+Khazaka electronic GmbH，kln，Germany)用基于CsEx的局部制剂(6 mg/L)治疗了28天，该创新系统是一种能够测量热损失的装置，该参数与局部皮肤能量平衡密切相关。 值得注意的是，用CsEx治疗的个体在该参数上表现出显著的增加，提供了制剂对皮肤能量影响的具体证据。这一有希望的结果可能主要是由于与CsEx相关的虫草素和腺苷的标准化含量。在这方面，从分子的角度来看，虫草素可以激活AMP蛋白激酶(AMPK ),一种调节能量代谢的细胞能量传感器。具体而言，据报道，虫草素通过腺苷转运蛋白进入细胞，并通过细胞代谢转化为单-、二-和三磷酸，在高虫草素浓度下，其几乎可以取代细胞腺嘌呤核苷酸。这解释了为什么虫草素可以激活AMPK，导致线粒体生物合成增加和氧化代谢增强，从而通过模拟其天然激活剂腺苷一磷酸(AMP)的多重效应来促进能量产生。众所周知，ATP的产生是细胞呼吸的最后一步，这是一个涉及多个步骤的整体过程，每个步骤都有助于以ATP的形式释放能量。细胞呼吸是一个费力的过程。这意味着它释放细胞用于各种代谢过程的能量，其中一些能量以热的形式释放出来40].这在吸热生物中尤其明显，如哺乳动物和鸟类，这意味着它们保持恒定的内部体温。在这些生物中，细胞呼吸是产热的主要来源，有助于调节体温和维持代谢功能。我们的临床试验证实了这些发现，表明使用基于CsEx的配方治疗的受试者的皮肤能量平衡显著改善(+52%比D028天后，p < 0.001). As another consequence of the mitochondrial activity stimulation, the CsEx improved the ability of dermal fibroblasts to synthesize new collagen. Notably, a reduction in skin wrinkles (−28.0% vs. D0, p < 0.001) and an increase in collagen (+10% vs. D028天后，p < 0.001) production were observed, affirming the CsEx’s potential as an effective anti-aging solution. 这些发现阐明了a虫草提取物调节皮肤细胞内的能量代谢，从而积极影响皮肤寿命控制。 此外，该研究强调了将传统智慧与现代科学理解相结合以开发具有切实临床益处的靶向抗衰老疗法的重要性。最后，体外和临床结果之间的比较强调了基于CsEx的化妆品配方在将分子发现转化为皮肤健康和外观的切实改善方面的有效性。 4.材料和方法4.1.试剂和人类细胞培养 使用的所有化学品、试剂和标准品都是分析或LC-MS级试剂。水在使用前在Milli-Q水净化系统(Millipore，Bedford，Burlington，MA，USA)中处理。葵花籽油在当地市场购买。虫草素(纯度≥ 95.0% HPLC)和腺苷(纯度≥ 99% HPLC)购自适马-奥尔德里奇公司(意大利米兰)。对于o/w局部制剂，使用化妆品级成分，例如卡波姆、葡萄糖酸钠、硬脂酸甘油酯、PEG-100硬脂酸酯、辛酸/癸酸甘油三酯、鲸蜡硬脂醇、蓖麻油酸十六酯、苯氧基乙醇和乙基己基甘油。所有列出的辅料均购自ACEF公司(意大利Fiorenzuola D'arda)。 从Addexbio Technologies (San Diego，CA，USA)购买的永生化人角质细胞(HaCaT)保存在Dulbecco改良的Eagle培养基(Diego适马·奥尔德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)，其补充有10%胎牛血清(FBS美国密苏里州圣路易斯市适马-奥尔德里奇，95%空气，5%一氧化碳2人真皮成纤维细胞(HDFs)保存在Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM；适马-奥尔德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)补充10%胎牛血清(FBS美国密苏里州圣路易斯市适马-奥尔德里奇，95%空气，5%一氧化碳2和37℃的潮湿空气。 4.2.冬虫夏草的制备及虫草素组分的提取 C.中国虫草菌丝体由位于Genova(意大利)的农场维尔图斯蘑菇从来自西藏的子实体中分离，其在含有葡萄糖(10 g/L)、麦芽糖(5 g/L)、酵母提取物(1.5 g/L)、蛋白胨(1.5 g/L)、硫酸镁的琼脂培养基中培养和分离4(0.5克/升)，和KH2邮局（post office)4(0.5克/升)。然后将分离的菌丝体在由磨碎的小米、米糠和稻壳组成的培养基上在特定的培养袋中在20℃下繁殖，控制湿度和温度。这些条件保持70天，以保证虫草素的完全发育和最高合成。最后，菌丝体在48℃风干，然后粉碎。 通过使用Thanh等人采用的提取方案实现了腺苷和虫草素的同时提取。具体地说，将2000毫升乙醇/水(50/50，v/v)溶液加入到20 g干燥的菌丝体中。使用Grindomix GM300刀磨机(Retsch GmbH，Haan，Germany)将混合物在1500 rpm下均化3分钟，在3800 rpm下均化6分钟。将所得悬浮液在25℃下以400 rpm搅拌2小时，避免光照。然后，将悬浮液在4℃下以6300 rpm离心30分钟。除去上清液，过滤，然后在设定为25℃的旋转蒸发器(IKA RV8，IKA-韦克有限公司，施陶芬，德国)中真空浓缩至起始体积的20%。最后，用10 N NaOH将pH调节至7.0，将提取物冷冻干燥用于化学表征。使用UHPLC-DAD分析来定量腺苷和虫草素的量。提取过程一式三份进行。 具体地说，从冷冻干燥的样品中提取腺苷和虫草素C.中国虫草水醇提取物是通过使用黄等人修改的以下程序进行的，在15 mL Falcon试管中精确称量约20–40mg样品。向每个样品中加入1毫升甲醇/水溶液(50∶50)。使用超声波浴(37 KHz，室温，30分钟)进行超声波辅助提取。在提取过程结束时，样品在4℃下以4500 rpm离心10分钟。收集上清液，并进一步在4℃下以17，850 rpm离心10分钟。在通过Phenex-RC 0.20 m注射器过滤器后，样品被注射用于色谱分析。最后，在C.中国虫草在所示浓度下，将水乙醇提取物用于体外分析。然后，将22克CsEx加入到75克甘油和3克1，2-己二醇中作为防腐系统，以获得用于临床试验的化妆品活性成分。 4.3.虫草素和腺苷的鉴定和定量分析 使用Vanquish Flex UHPLC系统(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技有限公司)对腺苷和虫草素进行UHPLC分析，该系统配备有设置为254 nm的VF-D11-A二极管阵列检测器(DAD)(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技有限公司)。该系统由一个VF-P10-A二元泵、一个VF-10A-A恒温自动进样器(4°C)和一个VC-C10-A恒温色谱柱室(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)组成。色谱分离通过Hypersil Gold Vanquish C18柱(150 mm × 2.1 mm，1.9微米)实现，该柱配有Hypersil Gold security guard并恒温在30°C(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)。流动相由水/甲醇(92∶8，v/v).流速设置为200 μL/min，注射体积为2.5 μL。使用Chromeleon软件7.2.10 (Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)评估数据。通过使用腺苷和虫草素的真实标准获得定量的校准曲线。分析一式三份进行。 4.4.CsEx生物活性代谢物含量分析 使用Box等人描述的Folin–Ciocalteu分光光度法测定酚类化合物的含量，一式三份，以没食子酸为对照品；取而代之的是，用布拉德福德试剂(Biorad Laboratories，Hercules，CA，USA)在提取物上测量总蛋白。 蔗糖、果糖和葡萄糖水平根据Waleckx等人的程序使用酶测定法(爱尔兰Bay的Megazyme有限公司)进行测定。最后，使用测量总肽o-根据Zahir等人的方法进行的邻苯二甲醛分析(美国密苏里州圣路易斯市适马-奥尔德里奇公司)。 4.5.Sirtuin表达分析 为了分析基础条件下的基因表达，1.2 × 105将HaCaT细胞接种在6孔板中，生长20小时，然后用提取物(0.0006%)处理w/v)或白藜芦醇(100 M，0.002%w/v用Pure link RNA mini试剂盒(Invitrogen-Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)提取总RNA。使用通用引物对18S primer/compe timer(Invitrogen-Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)作为内标进行半定量RT-PCR分析。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上分离，并用iBright仪器(Invitrogen-Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)观察。用于扩增的引物序列如下:sir t1-F ATACCCCATGAAGTGCCTC；sir t1-R:CGTCATCTTCAGAGTCGTA；sir T3-F:ttggccaaggctgtacc；sir T3-3:tggcaaaaaggctccacct；sirt 6-F:ATCACGCTGGGTACATCG；以及Sirt6-R: ACCTCGTCAACGTAGCCAT。 4.6.NAD/NADH比率分析 为了分析NAD/NADH比率的增加，1.5 × 105将HaCaT细胞接种在6孔板中并生长20小时。然后将细胞与0.0006%的w/vCsEx或白藜芦醇(100微米，0.002%)w/v)，用作阳性对照，持续24小时。NAD/NADH比率根据供应商说明(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)使用NAD/NADH定量试剂盒测定。使用Victor Nivo仪器(PerkinElmer公司，新加坡)测量吸光度值。 4.7.ATP生成分析 为了评估ATP产量，1.2 × 104将HaCaT细胞接种在96孔板中并生长20小时。然后将细胞与提取物(0.0006%和0.002%)一起孵育w/v处理后，在加入等体积的CellTiter-Glo试剂(Promega Corporation，Milano，Italy)以诱导细胞裂解之前，将细胞在培养基中室温孵育30分钟。因此，在15分钟后，通过仪器Victor Nivo (PerkinElmer Inc .)测量样品的发光信号。 4.8.胞质ROS分析 为了分析胞质ROS的减少，1.5 × 104将HaCaT细胞接种在96孔板中，生长20小时，然后与提取物(0.0006%和0.002%)一起孵育w/v孵育后，在PBS中洗涤细胞并与染料CM-DCFDA（5-6）-氯甲基-2，7-二氯-二氢荧光素二乙酸酯（Invitrogen-Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）在37℃孵育45分钟。在PBS中再次洗涤后，用H2O2450微米并孵育30分钟。因此，使用Victor Nivo仪器（PerkinElmer公司）在535 nm处测量样品的荧光（激发485 nm）。 4.9.胶原生成分析 为了确定前胶原I的产生，8 × 104将HDF接种在96孔板中，用提取物或转化生长因子β（TGFβ；2.5纳克/毫升）作为阳性对照。在磷酸盐缓冲盐水（PBSThermo FisherScientific，Waltham，MA，USA），将细胞固定在4%中w/v多聚甲醛10分钟，用ELISA缓冲液（PBS 1X，0.5 mM CaCl21毫米MgCl20.1% Triton X100），并在ELISA缓冲液中用3% BSA处理30分钟。在室温下与第一抗体（sc-166，572，Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，USA）孵育2小时后，洗涤细胞，与抗小鼠第二抗体（Biorad，Hercules，CA，USA）孵育1小时，然后使用0.35 mg/mL的OPD溶液（适马-阿尔德里奇，米兰，意大利）和0.012%的2O2在50 mM柠檬酸盐缓冲液中。 4.10.临床前研究中的统计分析 所有报告的值都是三个独立实验的平均值，每个实验重复三次。星号表示计算的统计显著性与t-测试:*表示p-值为0.05，**表示p-值为0.01，***表示p-值为0.001。 4.11.基于CsEx的局部制剂 化妆品o/w乳液是用化妆品级成分制备的。第一，相A，含有油性成分如硬脂酸甘油酯和PEG-100硬脂酸酯（4.00%）w/w）、辛酸/癸酸甘油三酯（10.00%w/w）、鲸蜡硬脂醇（0.50%w/w）和蓖麻油酸十六酯（2.00%）w/w），使用磁力搅拌器以200±25 rpm混合并加热至70±5℃ 一旦发生熔化，将A相与包含去离子水（81.30%）的B相（水相）混合w/w）、葡萄糖酸钠（0.10%w/w）和卡波姆（0.60%w/w），之前在与a相相同的温度下加热。使用机械搅拌器Silverson L5T实验室混合器（中国上海SBL）以5000–5500 rpm进行相混合，直到温度达到45±5°C。然后，让混合物冷却，一旦温度达到35±2℃，含有防腐剂体系的最终相（相C）如苯氧基乙醇和乙基己基甘油（0.90%）的溶液w/w），被添加到组合中。对于临床试验，制备了两个批次的局部制剂:安慰剂和基于CsEx的批次；在用NaOH（20%溶胶）中和之前，在C相中富含活性成分CsEx（6毫克/升）。）最高pH值为5.30。 化妆品配方的质量控制和灌装 24小时后，粘度（27.197-28.076兆帕；22℃，主轴64，20 rpm）使用Brookfield DV-E粘度计（美国宾夕法尼亚州伯温的AMETEK公司）测量，并用GPL20pH计（西班牙巴塞罗那克里森仪器有限公司）。安慰剂乳剂以类似方式制备，含有除CsEx以外的所有列出的成分。准备好之后，一名技术人员将化妆品霜放入未贴标签的30毫升广口瓶中。 4.12.临床研究 那不勒斯大学费德里科二世药学系的研发化妆品部门开展了这项随机、双盲、双平行臂功效研究，该部门拥有由IMQ公司（意大利米兰）根据ISO 9001标准认证的化妆品临床试验质量管理体系【64].该研究从2023年9月至2023年11月进行，旨在评估CsEx与安慰剂相比，作为补充能量和抗皱成分加入局部制剂时的皮肤功效。由于本研究的美容性质和健康成人受试者的参与，不需要向相关伦理委员会提交报告[65].所有受试者提供书面知情同意书后，临床研究开始。然而，这项研究是根据赫尔辛基宣言体现的原则进行的[66]并遵循欧洲化妆品协会的化妆品功效评估指南[67].在整个研究期间保持良好的临床实践。 4.12.1.研究设计和参与者 共有40名年龄在40至65岁之间的受试者(包括在内)参与了这项研究，他们的皮肤类型为Fitzpatrick I-III型，面部因衰老而出现皱纹和细纹。只有一般健康的受试者被招募并随机分配到两个治疗组，并根据他们所属的测试组接受测试样品: 第一组:含6毫克/升CsEx的局部配方； 第二组:安慰剂。 在参与之前，每位受试者签署了一份书面知情同意书，其中包含研究的目的和类型、所用化妆品级成分的列表、应用规则以及使用测试产品可能导致的任何已知或潜在的不良反应。每次体检时，受试者都会被问及是否遵守所有就诊前的说明和限制，以确定他们是否有资格继续研究。记录方案偏差，以确定哪些受试者、终点和时间点应排除在后续数据分析之外。 其他纳入标准包括从初始筛查开始直到最终随访，停止使用所有用于治疗衰老相关疾病的化妆品。然而，研究者批准的清洁制剂和化妆品的使用是允许的。排除标准包括任何皮肤病、以前使用过类视黄醇，以及最近在12周或5个筛选半衰期内使用过医学美容程序，如生物刺激、填充物注射或肉毒杆菌。此外，在筛选的8周内接受面部射频治疗或在筛选的4周内口服补充抗衰老/抗氧化剂的患者被排除在外。进一步的排除标准包括并发的局部和全身病理或疾病。研究人群的特征详见表3. 表3 研究参与者的特征。
a标准差。 在登记访视之后，在参与者可以进入研究之前，规定了7天的洗脱期。在基线(第0天)和随访期间，参与者接受了监测皮肤参数的评估，并被随机分配到治疗组。向他们提供测试样品并指导他们使用方法。要求参与者在28天内每天两次(早上和晚上)将大约2 mg的指定产品涂抹到他们的脸上。研究设计和方案概述见图9.  图9 研究设计方案。D0:基线皮肤状况和用指定的测试样品开始局部治疗；D7:每天两次局部施用测试样品后7天；D14:在每天两次测试样品局部施用后14天；D28:每天两次局部施用测试样品后的第28天。 该研究的主要目的是在确保其耐受性后评估提取物的能量活性。次要结果包括评估皮肤老化相关参数的改善情况，如皮肤粗糙度和张力，这是提取物抗氧化和代谢刺激的结果。 4.12.2.随机化和掩蔽 实验室人员利用一个系统来管理研究登记并确保每个参与者的匿名性。该系统为每个入组受试者分配了一个唯一的患者研究编号，该编号是根据在记录志愿者的通用面板上建立的预定义参数进行随机分配的，同时还保持了治疗屏蔽。参与者来自不同的社会背景，自愿加入研究，在登记之前，他们接受了临床皮肤检查。 该系统采用了一种可定制的算法，对患者年龄（≤40岁和》65岁）和皮肤状况（真皮较薄和存在皱纹）进行了限定。小组成员被随机分配接受基于CsEx的面霜（0.5%w/w）或安慰剂，每天两次，比例为1:1。在整个研究过程中，小组成员和调查人员（不包括主要终点分析数据监测小组的成员）对每个患者的治疗分配保持盲法。只有在出现副作用的情况下，研究者需要了解受试者的治疗组时，才会进行紧急揭盖。 在研究结束时，要求每个治疗组的20名患者严格遵守方案，没有任何可能影响研究结果的重大偏差。 4.12.3.局部能量平衡评估 使用Tewameter在重复施用所研究的局部制剂后评估皮肤能量®德国科隆C + K电子有限公司。所有参数均在基线时进行评估（D0）在使用指定产品（D）每日两次治疗7、14和28天后7，D14、和D28). 4.12.4.抗衰老功效评估 在7、14和28天后评估胶原蛋白生成和粗糙度降低（D7，D14、和D28）使用基于CsEx的乳剂或安慰剂使用Dermascan进行治疗®c级（丹麦奥尔堡的Cortex Technology Aps）和VISIA 7级（美国新泽西州帕西帕尼的坎菲尔德科学公司）。 4.12.5.皮肤耐受性试验 为了评估CsEx的耐受性，使用在完整人体皮肤上进行的48小时闭塞性斑贴试验评估了CsEx的潜在刺激性，特别是在前臂掌侧进行的试验，因为该试验具有良好的特性。该试验旨在根据EEC指令76/768【68].芬恩·钱伯斯®按照之前制定的公布程序，使用AQUA贴剂给药系统进行测试【8].结果(图S1和表S1）基于国际接触性皮炎研究小组推荐的形态学标准进行评估【69】，视觉评分在0-3分的范围内，刺激性限值设定为1.5。 4.13.临床试验中的统计分析 随机分配的40名小组成员的样本量（每组约20名受试者）被认为足以确保具有足够的统计学功效来检测CsEx面霜和安慰剂之间的差异。对于主要终点和次要终点，使用方差分析测试评估组间差异（表S7-S10），而组内差异用与基线相比的平均百分比变化表示，使用学生进行评估t-测试。所有分析的显著性水平被设定为总体双侧p-值为0.05。使用SAS软件版本9.4进行统计分析。 5.结论总之，目前的研究揭示了a。虫草菌丝体提取物（CsEx）。该研究表明，在CsEx治疗后，sirtuin表达、NAD+合成、ATP生成、ROS清除和胶原合成显著增加，这为通过利用天然适应原源促进皮肤寿命提供了令人兴奋的前景。我们未来的研究方向可以专注于促进对CsEx作用机制的理解，确定其他相关分子靶点，优化其疗效，并延长相对较短的临床试验的持续时间，以克服目前研究的局限性。 感谢作者要感谢佛罗伦萨大学的安娜·丽塔·比利亚对该提取物的中药特性的咨询。 |
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