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题目：Cotton BLH1 and KNOX6 antagonistically modulate fiber elongation via regulation of linolenic acid biosynthesis 刊名：Plant Communications 作者：Hongbing Li, Guanghui Xiao et al. 单位：Shaanxi Normal University, Xi’an 日期：March 26, 2024    01 摘要 
02 技术路线  The cotton (G. hirsutum) lines 84021 (HT tolerant) and H05 (HT sensitive) used in this study were grown in a greenhouse vector construction and plant transformation Phylogenetic analyses Measurement of JA contents Tissue sectioning, staining, and imaging ChIP-seq、Histone modification data analysis RNA-seq data analysis and GO term analysis 03 主要结果 3.1 GhBLH1通过促进亚麻酸生物合成正向调节棉花纤维伸长 我们之前的研究表明，转录因子GhBLH1在棉花纤维细胞伸长期间高度表达。在不同的纤维发育阶段测量GhBLH1的相对表达，GhBLH1表达在花后15天达到峰值。 经过严格的系谱筛选和转基因PCR扩增，我们获得了6个GhBLH1过表达的转基因棉花品系（GhBLH1-OE）和6个GhBLH1-RNAi干扰的转基因棉花株系。与野生型植物相比，15-DPA纤维中GhBLH1的相对表达水平在GhBLH1 OE系中显著增加，在GhBLH1-RNAi系中显著降低。选择三个具有相对高表达水平的GhBLH1-OE系和三个具有较低表达水平的GhBLH1-RNAi系进行后续分析（图1A）。与野生型植物相比，GhBLH1 OE系产生更长的纤维，GhBLH1-RNAi系产生更短的纤维（图1B-1E）。纤维长度分析表明，该性状在GhBLH1转基因棉花的多代中稳定遗传。与野生型相比，马克隆值在GhBLH1 OE系中增加，在GhBLH1-RNAi系中减少。 然而，GhBLH1转基因系的纤维强度、均匀性和成熟度与野生型相同。GhBLH1转基因系的棉铃长宽比、成熟种子重量或营养生长没有变化。这些结果表明，GhBLH1与棉花纤维细胞的伸长有关。
为了表征GhBLH1介导纤维细胞伸长的分子机制，我们对野生型和GhBLH1转基因棉花植物的纤维细胞进行了RNA测序（RNA-seq）分析。使用了三个GhBLH1-OE系和三个GhBLH1-RNAi系，与野生型相比，在GhBLH1-OE和GhBLH1-RNAi转基因系中分别鉴定出2745个上调基因和947个下调基因（图2A-2C）。KEGG富集分析显示，差异表达基因（DEG）中富集了多种不饱和脂肪酸（FA）途径（图2D，2E）。 接下来，我们分析了纤维在不同发育阶段的不饱和脂肪酸特征。在10、15和20 DPA条件下比较纤维样品中亚麻酸（C18:3）的含量，在15 DPA条件下亚麻酸（0.18:3）含量显著较高（图2F）。与野生型植物相比，GhBLH1-OE系中亚麻酸（C18:3）的积累显著更高，而GhBLH1-RNAi系中的积累更低（图2G）。然而，其他不饱和脂肪酸的含量在GhBLH1转基因和野生型植物中是相同的。 脂肪酸去饱和酶3（Δ15FAD）是参与C18:3生物合成的关键酶。在DEG中鉴定出两个负责亚麻酸生物合成的脂肪酸去饱和酶3基因GhFAD7A-1和GhFAD3-1。qRT-PCR分析表明，GhFAD7A-1和GhFAD3-1在快速伸长的纤维中优先表达。我们还研究了不同发育阶段纤维中参与不饱和脂肪酸代谢途径的其他DEG的相对表达水平。 GhSTAD、GhSDR1、GhKCR2、GhM5XA18、GhTECR、GhKCR1和GhKDSR的相对表达水平在10DPA时更高；GhFAD12-1和GhACOX2-2在20DPA时表现较高；GhACOX3-1、GhFAD12-2、GhACOX4和GhACOX3-2在5DPA时的含量较高；而GhACOX2-1在15DPA和20DPA时更高。与野生型植物相比，GhFAD7A-1和GhFAD3-1在GhBLH1 OE系的纤维中显著上调，在GhBLH1-RNAi系的纤维中显着下调（图2H和2I）。参与不饱和脂肪酸代谢的其他DEG的表达模式与GhFAD7A-1和GhFAD3-1的表达模式相似。总之，这些结果表明亚麻酸参与了GhBLH1介导的棉花纤维细胞伸长。
3.2 GhFAD7A-1是GhBLH1的靶基因 为了测试GhFAD3-1和GhFAD7A-1是否直接受GhBLH1的调节，我们进行了系统酵母单杂交（Y1H）和瞬时体内表达测定。Y1H测定显示，GhBLH1可以直接与GhFAD7A-1启动子结合，但不能与GhFAD3-1启动子结合（图3A），这表明GhFAD7A-和GhFAD3-分别是GhBLH1的直接和间接下游靶标。烟草中的瞬时体内表达测定显示，与对照载体相比，当GhBLH1与GhFAD7A-1启动子共转染时，由GhFAD7A-1-启动子驱动的LUC报告基因活性显著增强（图3B和3C），这意味着GhBLH1显著激活GhFAD7A-1的转录。BLH1蛋白具有两个保守结构域，即POX和HOX结构域。 为了确定哪个结构域对GhBLH1与GhFAD7A-1启动子的结合至关重要，我们进行了体外表达测定。结果显示，GhBLH1的POX结构域直接与GhFAD7A-1启动子结合（图3D），这一结果通过发现POX结构区显著激活由GhFAD7A-启动子驱动的LUC报告子的转录得到验证（图3E和3F）。这些结果表明，POX结构域对于GhBLH1与GhFAD7A-1启动子的结合是必不可少的。 靶基因启动子中的TGGA顺式元件用作BLH1的结合位点。我们发现四个TGGA顺式元件位于GhFAD7A-1启动子中。根据TGGA顺式元件的分布，我们将GhFAD7A-1启动子分为三个片段，分别命名为P1、P2和P3。Y1H测定显示，GhBLH1与P2片段结合，P2片段含有一个TGGA顺式元件（图3G）。类似地，瞬时体内表达测定显示，GhBLH1的共表达显著激活了烟叶中由GhFAD7A-1启动子的P2片段驱动的LUC报告基因的转录，而不是由P1或P3片段驱动的转录（图3H，3I）。 此外，使用与His标签融合的纯化GhBLH1重组蛋白的电泳迁移率偏移测定（EMSA）显示，GhBLH1在体外对GhFAD7A-1启动子的P2片段具有显著的结合亲和力（图3J）。染色质免疫沉淀qPCR（ChIP–qPCR）分析使用在C末端具有HA标签的过表达GhBLH1的转基因植物（35S:：GhBLH1-HA），结果显示GhFAD7A-1启动子的P2片段特异性富集（图3K）。 为了进一步证实GhFAD7A-1启动子的P2片段中的TGGA顺式元件对于GhBLH1蛋白的结合是必不可少的，我们进行了Y1H测定、瞬时体内表达测定和EMSA。P2m序列见补充数据7。GhBLH1与含有一个TGGA顺式元件的P2片段特异性结合，并激活LUC报告基因的转录，但当P2片段中的TGGA顺性元件发生突变时，这种结合被消除（图3L-3N）。此外，通过添加越来越多的未标记的天然片段探针（冷探针），结合亲和力逐渐降低，但不受添加未标记的突变探针（P2m）的影响（图3O）。总之，这些结果强烈表明，GhBLH1通过与启动子区的第四个TGGA顺式元件结合，正向调节GhFAD7A-1的转录。
图3 GhBLH1蛋白直接与GhFAD7A-1启动子结合并激活其表达。 （A） 酵母一杂交分析显示GhBLH1直接结合GhFAD7A-1启动子。pLacZi和JG4-5空载体作为阴性对照。 （B） 烟草瞬时表达测定显示了GhBLH1对LUC报告基因的转录激活（在GhFAD7A-1启动子的控制下）。 （C） LUC表达的量化如（B）所示。使用pGreenII 62-SK和pGreenII 0800-LUC空载体作为对照。 （D） 酵母一杂交分析显示GhBLH1蛋白的POX结构域与GhFAD7A-1启动子结合。 （E） 烟草瞬时表达测定显示通过GhBLH1的POX结构域对LUC报告基因的转录激活（在GhFAD7A-1启动子的控制下）。 （F） LUC表达的量化如（E）所示。使用pGreenII 62-SK和pGreenII 0800-LUC空载体作为对照。 （G） 酵母一杂交测定显示GhBLH1蛋白与GhFAD7A-1启动子的P2片段结合。 （H） 烟草瞬时表达测定显示了GhBLH1对LUC报告基因的转录激活 （I） LUC表达的量化如（H）所示。使用pGreenII 62-SK和pGreenII 0800-LUC空载体作为对照。 （J） 电泳迁移率转移测定（EMSA）显示GhBLH1蛋白在体外结合GhFAD7A-1启动子的P2片段。 （K） ChIP–qPCR结果显示，GhBLH1蛋白在体内与GhFAD7A-1启动子的P2片段结合。 （L） 酵母一杂交分析显示GhBLH1蛋白的POX结构域与GhFAD7A-1启动子的P2片段结合。 （M） 烟草瞬时表达测定显示GhBLH1蛋白的POX结构域与GhFAD7A-1启动子的P2片段结合。 （N） LUC表达的量化如（M）所示。使用pGreenII 62-SK和pGreenII 0800-LUC空载体作为对照。 （O） 将来自GhFAD7A-1启动子的生物素标记的P2片段与重组GhBLH1孵育，以与不同浓度的冷探针（未用生物素标记）竞争完整或突变的GhBLH1结合位点（P2m）。 3.3 GhFAD7A-1正调控棉花纤维细胞伸长 为了表征GhFAD7A-1在棉花中的作用，我们产生了GhFAD7A-1-过表达（GhFAD7A-OE）和GhFAD7A-2-knockout（GhFAD7A-1-Cas9）转基因棉花植物。经过严格的系谱筛选和转基因PCR扩增，获得了六个过表达系。与野生型植物相比，四个GhFAD7A-1-OE系显示出GhFAD7A-1转录显著增加（图4A）。通过Sanger测序鉴定了三个CRISPR-Cas9介导的GhFAD7A-1-knockout品系，但没有改变基因表达（图4B）。最后，选择三个具有相对高表达水平的GhFAD7A-1-OE系和三个CRISPR-Cas9介导的GhFAD7A-1-knockout系进行后续分析（图4A和4B）。我们观察并比较了GhFAD7A-1转基因系和野生型植物的纤维表型。与野生型植物相比，GhFAD7A-1-OE品系产生更长的纤维，而GhFAD7A-Cas9品系产生更短的纤维（图4C和4D）。纤维长度分析表明，该性状在GhFAD7A-1转基因棉花植株的多代中稳定遗传。GhFAD7A-1转基因品系和野生型之间的纤维强度、马克隆值、均匀性和成熟度没有差异。GhFAD7A-1转基因株系和野生型植物在棉铃长宽比、成熟种子重量或营养生长方面没有发现差异。这些结果表明，GhFAD7A-1参与了棉花纤维细胞的伸长。
3.4 GhBLH1蛋白与GhKNOX6蛋白相互作用 BLH蛋白与KNAT蛋白形成功能性异二聚体，以调节植物生长发育。为了探索棉花纤维发育的GhBLH1调控是否需要KNAT基因，我们首先分析了棉花中的所有KNAT家族成员。棉质KNAT成员可分为两类：一类和二类。据报道，BEL1不与拟南芥中的II类蛋白KNAT3、KNAT4和KNAT7相互作用。先前的研究发现，BEL1可以与KNAT1、KNAT2和KNAT6形成交互网络。VAAMANA（VAN）是一种类似BEL1的同源结构域蛋白，与I类KNOX蛋白SHOOT MERISTEMLESS（STM）、BREVEDICELLUS（BP）和KNAT6（K6）特异性相互作用，并调节拟南芥的花序茎生长。因此，我们从一级中选择了KNAT成员，包括KNAT1和KNAT6，作为潜在候选。 酵母双杂交（Y2H）测定显示，GhBLH1蛋白与GhKNAT6-2A和GhKNAT6-3A（GhKNOX6）强烈相互作用，但与GhKNAT1-A或GhKNAT6-1D不相互作用（图5A）。GhKNOX6在早期快速伸长阶段的纤维中特异性表达，而在整个发育阶段的纤维细胞中检测到GhKNAT6-2A的转录物。因此，我们选择GhKNOX6作为后续工作的靶基因。通过双分子荧光互补（BiFC）和下拉分析证实了GhBLH1和GhKNOX6的相互作用（图5B和5C）。 为了进一步证实GhBLH1-GhKNOX6在植物中的相互作用，我们进行了共免疫沉淀（coIP）测定，其中GhKNOX6-GFP和GhBLH1-FLAG在烟叶中瞬时共表达。结果显示，抗GFP抗体成功沉淀了GhBLH1 FLAG蛋白（图5D）。总之，这些结果支持了GhBLH1和GhKNOX6在植物中的物理相互作用。
为了确定哪些结构域对GhKNOX6和GhBLH1的相互作用至关重要，我们将GhBLH1分为两个保守结构域（POX结构域和HOX结构域），并将GhKNOX6分为四个保守结构区，即KNOX1结构域（K1）、KNOX2结构域（K2）、ELK结构域和同源盒KN结构域（HOX）（补充图10）。Y2H测定显示，只有GhBLH1的POX结构域能够与GhKNOX6相互作用（图5E），并且GhKNOX6的K2和K1K2结构域，而不是ELK结构域和HOX结构域，能够与GhBLH1相互作用（见图5F）。为了进一步验证这种相互作用，我们用GhBLH1的POX结构域以及GhKNOX6的K2和K1K2结构域进行了Y2H测定。结果表明，GhBLH1的POX结构域可以与GhKNOX6的K2和K1K2结构域相互作用（图5G）。BiFC和下拉分析证实了这种相互作用（图5H-5J）。为了进一步证实植物中POX结构域与K2和K1K2结构域之间的相互作用，我们进行了coIP测定，其中K2-GFP或K1K2-GFP和POX-FLAG在烟叶中瞬时共表达。抗GFP抗体成功沉淀了POX-FLAG蛋白（图5K和5L）。总之，这些结果表明GhBLH1的POX结构域和GhKNOX6的K2结构域是GhBLH1和GhKNOX6相互作用的必需结构域。 3.5 GhKNOX6通过抑制GhFAD7A-1的转录活性负调控纤维生长 为了表征GhKNOX6的生物学功能，我们开发了四种GhKNOX6过表达（GhKNOX4-OE）和五种GhKNOS6敲除（GhKNOS6-Cas9）转基因棉花植物。经过严格的系谱筛选和转基因PCR扩增，获得了四个过表达系（图6A）。选择三个具有相对高表达水平的GhKNOX6 OE系和通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑获得的三个GhKNOX6敲除系进行后续分析（图6A和6B）。与野生型植物相比，GhKNOX6 OE系的GhKNOX6转录显著增加，导致纤维明显更短（图6C-6F）。尽管敲除GhKNOX6不会影响其表达，但GhKNOX6-Cas9植物显示出比野生型植物长得多的纤维。纤维长度分析表明，该性状在GhKNOX6转基因棉花的多代中稳定遗传（补充图11C–11H）。GhKNOX6转基因品系和野生型之间的纤维强度、马克隆值、均匀性和成熟度没有差异。 此外，GhKNOX6 OE系的棉铃重量、花朵大小和起始纤维数量显著低于野生型。与野生型相比，GhKNOX6-OE品系中成熟种子的重量较低，GhKNOS6-Cas9品系中的成熟种子重量较高。有趣的是，尽管敲除GhKNOX6不会影响棉铃、花朵大小或起始纤维的数量，但GhKNOX6-Cas9转基因植物的成熟种子重量略高于野生型植物。GhKNOX6转基因植物的营养生长没有变化。qRT–PCR证明GhBLH1在GhKNOX6转基因植物中的表达与野生型植物中的相同（图6G）。然而，与野生型植物相比，GhKNOX6 OE转基因植物的纤维中GhFAD7A-1的转录显著下调，亚麻酸含量降低，而GhKNOX6-Cas9系的纤维中GhFAD7A-1转录和亚麻酸含量增加（图6H和6I）。这些结果表明，GhKNOX6是棉花纤维细胞伸长的阻遏物。
3.6 GhKNOX6抑制GhBLH1介导的纤维细胞伸长 因为GhKNOX6是一种转录因子，我们进行了Y1H测定来研究它是否可以调节GhFAD7A-1。我们的结果表明，GhKNOX6不会直接与酵母中的GhFAD7A-1启动子结合（图7A）。然后，我们进行Y1H测定以测试GhKNOX6对GhBLH1诱导的GhFAD7A-1的转录激活的影响。GhKNOX6蛋白的添加显著削弱了GhBLH1激活的GhFAD7A-1基因的转录（图7A）。 为了进一步研究GhKNOX6–GhBLH1相互作用对GhFAD7A-1表达的影响，我们在本氏烟草叶片中进行了瞬时表达测定。GhBLH1激活了GhFAD7A-1驱动的LUC报告基因的表达，而GhKNOX6与GhBLH1的共表达导致LUC表达的诱导显著降低（图7B和7C）。EMSA还显示，GhBLH1，而不是GhKNOX6，对GhFAD7A-1启动子的P2片段具有结合亲和力（图7D）。这种亲和力通过添加越来越多的GhBLH1蛋白而增加，并随着GhKNOX6蛋白数量的增加而逐渐降低（图7D和7E）。总之，这些结果表明GhKNOX6抑制GhBLH1诱导的GhFAD7A-1转录。 上述结果表明，GhKNOX6与GhBLH1相互作用形成异二聚体，从而干扰GhFAD7A-1的转录激活，从而负调控棉花中的纤维细胞伸长。为了进一步检验GhKNOX6和GhBLH1之间的遗传关系，我们将GhBLH1转基因株系和GhKNOX6转基因株系杂交，产生GhKNOX4-OE和GhBLH1-RNAi双转基因株系，GhKNOX-Cas9和GhBLH1-OE双转基因株，GhKNOS6-Cas9和GhBLH1-RNAi双转基因系，以及GhKNOX3-OE和GhBLH1-OE双基因株系。在转基因PCR扩增和相对表达水平分析后，选择每个杂交后代的三个品系进行后续研究。与野生型植物相比，GhKNOX6 OE和GhBLH1-RNAi双转基因系产生的纤维要短得多，而GhKNOX6 OE和GhBLH1-OE双转基因系以及GhKNOX-Cas9和GhBLH1 OE双转基因系则产生的纤维更长（图7F和7G）。与GhKNOX6 OE植物相比，GhKNOX6 OE和GhBLH1-OE双转基因系的纤维长度明显更大（图7H）。相反，与GhBLH1 OE植物相比，GhKNOX6 OE和GhBLH1-OE双转基因系的纤维长度显著减少。类似地，GhKNOX6-Cas9和GhBLH1-RNAi双转基因植物产生的棉花纤维比GhBLH1-LNAi植物长得多。 GhKNOX6-Cas9和GhBLH1-RNAi双转基因植物的纤维比GhKNOX6-Cas9植物的纤维短得多。我们还测量了GhBLH1和GhKNOX6双转基因系中的GhFAD7A-1转录物丰度。结果显示，GhFAD7A-1转录物在GhKNOX6-OE和GhBLH1-OE双转基因系以及GhKNOX6-Cas9和GhBLH1-OE双基因系中大量积累（图7I）。然而，与野生型植物相比，GhKNOX6-OE和GhBLH1-RNAi双转基因系中的GhFAD7A-1表达略有下降，并且GhKNOX6-Cas9和GhBLH1-RNAi双重转基因系中GhFAD7A-的转录与野生型中的转录相同。亚麻酸积累在GhKNOX6-Cas9和GhBLH1-OE双转基因系以及GhKNOX6-OE和GhBLH1-OE系中增加，但在GhKNX6-OE和GhBLH1-RNAi双转基因系中减少（图7J）。纤维长度分析显示，该性状在GhBLH1和GhKNOX6双转基因棉花的多代中稳定遗传。总之，这些结果表明GhKNOX6负调控GhBLH1介导的脂肪酸对纤维伸长的促进。
 04 结论 在本研究中，我们使用最具代表性的植物单细胞模型棉花纤维来阐明GhBLH和GhKNOX在植物细胞伸长中的作用。 我们发现GhBLH1通过激活亚麻酸生物合成来正向调节棉花纤维细胞的伸长。 GhBLH1通过与启动子区的TGGA顺式元件结合，直接调节脂肪酸去饱和酶7A-1（GhFAD7A-1）的转录，以增强亚麻酸的积累，从而促进纤维细胞的伸长。 GhKNOX6与GhBLH1相互作用形成功能性异二聚体，干扰GhFAD7A-1的转录激活，从而负调控棉花纤维细胞的伸长。 总之，这些结果表明，BEL1-样同源结构域转录因子GhBLH1在控制棉花纤维细胞伸长中起着重要作用；它们使我们能够更全面地了解在单细胞水平上通过亚麻酸影响植物细胞伸长的调控网络。 05 原文获取 原文链接： https://www./plant-communications/fulltext/S2590-3462(24)00129-9#%20 PDF获取： https://www./h-nd-335.html |
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