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结果： 首先，如图1A所示，作者对全癌症进行了CPA4表达的差异分析，发现CPA4在14种恶性肿瘤中表达较高，如膀胱尿路上皮癌（BLCA）和肾透明细胞癌（KIRC）（p < 0.05）。在配对的全癌症样本中，包括KIRC在内的多种恶性肿瘤中，CPA4的表达增加（图1B）。在TCGA-KIRC数据库的配对样本和非配对样本中（图1C、D），与正常组织相比，肿瘤组织中CPA4的表达水平显著增加（p < 0.05）。随后，作者结合了GEO数据库中GPL570平台的GSE53757和GSE66271数据集，发现KIRC中的CPA4表达也高于正常组织（图1E）。在GSE105261数据集中，显示CPA4在转移性ccRCC中的表达明显升高，如图1F所示。同时，如图2A所示，在CTPAC数据库中，作者发现KIRC中CPA4蛋白的表达比正常组织更强烈染色。免疫组化染色的代表性图像如图2B所示。ccRCC的癌组织中，CPA4的免疫组织化学染色评分高于癌旁组织（p < 0.05，图2C，表S1）。
经过CPA4单基因差异表达分析，作者筛选出符合标准的1477个基因，在这些标准下，有1119个基因表达强烈（正logFC）。有358个基因表达低（负logFC）。作者使用火山图来描述单基因差异分析结果（图3B）。作者利用上述1477个基因构建了不同的蛋白质相互作用网络。在所有网络中发现了36个HUB基因（TROAP，IF18B，MYBL2，GTSE1，DEPDC1，ANLN，AURKB，CDCA3，CENPF，CENPA，KIF14，CCNB2，KIF2C，PTTG1，FOXM1，CDCA8，RRM2，KIF20A，KIF4A，DLGAP5，CEP55，BIRC5，TPX2，UBE2C，BUB1，PLK1，NUF2，CDC20，HJURP，UHRF1，PIMREG，E2F7，NEIL3，TICRR，QGAP3和CDCA7）（图3A）。然后，作者选取与CPA4关系最密切的30个基因进行相关性分析，生成共表达热图（图3D）。共表达热图展示了HUB基因和CPA4的共表达情况（图3C）。
对CPA4和差异基因进行了GO富集分析（图4A-C）。结果显示，与CPA4相关的基因参与了外部包膜结构组织、细胞外基质组织、内质网腔、细胞外基质结构成分、丝氨酸型内切酶活性等功能。随后进行了KEGG富集分析（图4D）。结果显示，CPA4与金黄色葡萄球菌感染、蛋白消化和吸收等功能相关。
CPA4表达与巨噬细胞、Th2细胞、Treg、B细胞、Th1细胞和其他免疫细胞呈正相关，但与Th17细胞和中性粒细胞呈负相关（图5B，p < 0.05）。此外，在巨噬细胞、Th2细胞、Treg、B细胞、Th1细胞、DC、T细胞、iDC、TFH、aDC、NK CD56亮细胞、细胞毒性细胞、Th17细胞、辅助T细胞和中性粒细胞的高表达水平组和低表达水平组之间存在统计学上显著差异的免疫浸润评分（p < 0.05，图5A）。接下来，作者绘制了每个免疫细胞浸润评分与CPA4表达的散点图。在图S1中给出了具有显著相关性（p < 0.001）的结果。作者基于CPA4表达和每个免疫细胞浸润评分绘制了相关和弦图（图5C）。上述结果显示了肿瘤免疫激活状态与CPA4高表达之间的强相关性。
临床基线信息表（表1）是从TCGA数据库中获取的613个KIRC样本，用于检查CPA4表达和临床病理特征。图6A-F显示，在TNM分期中，CPA4表达和临床数据的相关性没有发生显著变化。T3和T4期仍然比T1和T2期表达更多（p < 0.05）。N1和M1患者在N和M期中的CPA4表达较N0和M0患者更高（p < 0.001）。
CPA4高表达组显示了相对较低的总生存率（HR = 1.93，p < 0.001，图6G）。DSS（HR = 2.57，p < 0.001）和PFI（HR = 1.80，p < 0.001）的生存结果（图6H，I）显示高CPA4表达的肿瘤患者存在风险。图S2显示了各个亚组的生存分析结果。CPA4高表达亚组与较差的生存率相关。最后，作者对常见临床病理因素进行了单变量和多变量Cox回归分析（图7A，D）。TNM分期、年龄、病理分期、组织学分级、侧别、血清钙和CPA4在单变量分析中具有统计学差异。选择具有统计学显著性的结果进行进一步研究，进行多变量Cox回归分析。该分析结果显示T分期、M分期、年龄和CPA4仍然具有统计学显著性（p < 0.05），表明高CPA4表达独立地增加了KIRC患者总体生存风险。
根据多元Cox回归分析，作者利用TNM分期、年龄和CPA4创建了一个预后评分表，用于量化KIRC患者的预后情况，C-指数为0.773（0.750-0.796），表示中等准确性（图7B）。随后，作者绘制了图7C中的校准曲线，以测试模型的预测准确性。偏差修正线接近理想曲线（45°），预测值与实际值相匹配。上调CPA4增强了KIRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力在两个细胞系中，经过沉默后，CPA4表达明显下降（图8A）。然后，通过CCK-8测试，作者发现当CPA4被沉默时，细胞增殖显著减少（图8B，C）。此外，作者进行了Transwell实验来评估CPA4沉默对细胞侵袭能力的影响，结果显示明显且具有统计学意义的减少（图8E-H）。此外，作者进行了伤口愈合的研究，并观察到与对照组相比，抑制CPA4表达的细胞的转移潜力在研究期间显著减少（图8I-L）。最后，克隆形成实验显示，在细胞中沉默CPA4表达后，它们的克隆形成能力减弱（图8D，F，G）。
总结 这项研究存在一定的限制。虽然该研究提供了重要的初步发现，但其样本量相对较小，需要在更广泛的患者群体中对这些结果进行进一步验证。目前尚不确定单一生物标志物的使用是否能提供足够的准确性进行预测和诊断。因此，未来的研究需要关注多个不同生物标志物的组合。此外，CPA4 调节 ccRCC 细胞行为的分子机制仍需进一步探索。
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