【文献阅读|灵芝多糖通过调节肠道菌群和免疫细胞功能抑制结肠炎症和肿瘤发生】

汇报人：田王琪 研究生三年级

今天跟大家分享的是浙江中医药大学王兴亚老师课题组2021年2月发表在Carbohydr Polym的一篇文章，题目为灵芝多糖通过调节肠道菌群和免疫细胞功能抑制结肠炎症和肿瘤发生。该杂志影响因子11.20。全文链接https://www./science/article/abs/pii/S0144861721006184?via%3Dihub.

作者简介

王兴亚，女，浙江中医药大学药学院研究员。浙江省“钱江学者”特聘教授，浙江省“151人才工程”第一层次培养人士。2000年至2007年在美国俄亥俄州立大学(OSU)先后取得食品营养硕士和营养医学博士学位。2007年至2013年在美国国立卫生研究院国立环境卫生研究所（NIEHS, NIH)从事博士后、研究员工作。在此期间获得美国杜克大学(Duke)临床医学研究硕士学位。

研究方向：脂肪代谢在肿瘤、糖尿病、动脉粥样硬化、衰老等慢性病的发生发展机理研究；营养物质和中药对以上慢性病的防治研究。在《Carcinogenesis》、《Cancer Prevention Research》、《Molecular Carcinogenesis》、《Journal of Nutritional Biochemistry》、《Obesity》、《Cell death and disease》、《International Journal of Obesity》《Aging》等国际知名杂志上以第一作者和通讯作者发表学术论文。已发表国际SCI文章20篇。近年来主持三项国家自然科学基金项目， 并以第一合作单位参与两项浙江省重点研发项目。

摘要

本研究探究了去除灵芝孢子外壁后提取的水溶性多糖（GLP）对AOM/DSS诱导的炎症、肿瘤发生和肠道菌群改变的影响。结果表明，GLP（200和300 mg/kg）降低了AOM/DSS诱导的结肠炎和肿瘤发生，表现为显著减少的疾病活动指数评分，肿瘤的大小。GLP改善了AOM/DSS诱导的菌群失调，增加了短链脂肪酸产生，并通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号传导减轻了内毒素血症。GLP显著改善了肠道屏障功能，表现为高级别的腺细胞数量增加，MUC2分泌增加和紧密连接蛋白表达。GLP治疗抑制了巨噬细胞浸润并下调了IL-1β、iNOS和COX-2的表达。此外，GLP抑制了大肠杆菌（LPS）诱导的炎症标志物以及巨噬细胞RAW264.7、肠道HT-29和NCM460细胞中MAPK（JNK和ERK）的活化。这些结果表明，GLP是治疗结直肠癌的一种有前景的益生元。

研究背景

结直肠癌（CRC）是一种常见的恶性肿瘤，影响全球人民，是全球第三大癌症死因。CRC受多种因素影响，包括环境因素，如饮食、大量饮酒、肥胖、缺乏运动以及遗传和表观遗传因素。越来越多的证据表明，肠道菌群失调可能引发和促进慢性炎症介导的疾病。有研究发现健康个体和CRC患者之间的肠道菌群组成存在差异。肠毒素产生的弯曲菌、核泰克克菌、厌氧链球菌、粪肠球菌和大肠埃希氏菌等都有可能促进CRC的疾病进展。

灵芝（G. lucidum）是一种药用蘑菇，在亚洲已经使用了数个世纪，用于激发免疫系统，促进健康和长寿。灵芝多糖（GLP）是灵芝中最重要的生物活性化合物之一，具有多种药理活性，如免疫调节、降糖、抗氧化、抗衰老和抗癌作用。最近，发现GLP可以调节肠道菌群组成，这可能与疾病预防有关，如癌症、糖尿病和肥胖。

AOM/DSS小鼠模型已被广泛用于CRC致癌和干预研究，因为在该模型中发展的肿瘤准确重现了人类CRC中观察到的病因学。

因此，本研究的目的是确定来自去除灵芝孢子外壁的多糖（GLP）在AOM/DSS处理的小鼠中抑制结肠炎和结肠炎相关CRC肿瘤发生中的作用，进一步探究肠道菌群是否可以影响CRC进展。此外，还检查了GLP在LPS诱导的炎症和RAW264.7巨噬细胞以及肠上皮HT-29和NCM460细胞中的巨噬细胞激活中的作用。研究可能为GLP作为预防和治疗CRC的有前景的候选药物提供科学依据。

研究结果

小鼠经过1周适应性喂养后，根据初始体重随机分为四组（对照组（CON），模型组（MOD），GLP低剂量组（GLPL，200 mg/kg），GLP高剂量组（GLPH，300 mg/kg）；每组12只）。将模型组和GLP治疗组的小鼠腹腔注射10 mg/kg的AOM。AOM注射后1周，小鼠在饮水中加入2.75%的DSS，饲养5天，然后给予正常饮水2周，此步骤重复两次。两个剂量的GLP（GLPL和GLPH）每天一次通过灌胃给予，从实验的第14天开始，如图1A所示，模型组和对照组小鼠用生理盐水灌胃。

利用苯酚-硫酸法测定多糖组成，从去除灵芝孢子外壁的粗提GLP中提取的总碳水化合物含量为89.32%。利用BCA法测定，GLP中的蛋白质含量为4.56%。HPGPC分析显示，GLP的重均分子量为25.0 kDa。GC-MS分析显示，粗提GLP主要由阿拉伯糖（4.19%）、甘露糖（15.69%）、葡萄糖（78.15%）和半乳糖（1.97%）组成。

本研究首次报道了GLP对AOM/DSS诱导的结肠炎的影响。AOM/DSS处理的模型小鼠显示出明显的慢性结肠炎临床特征，如体重减轻、腹泻和便血，在3个DSS处理周期期间的DAI评分显著增加（图1B）。然而，与模型组相比，GLP治疗表现出较小的体重减轻、腹泻和便血，DAI评分显著降低（图1B）。图1C是整个实验期间的小鼠体重变化，在所有接受AOM/DSS处理的小鼠组中，每个DSS给药周期期间都观察到体重减轻，但是GLP有效缓解了实验期间DSS诱导的体重减轻，但未呈现明显的剂量依赖性。图1D显示，模型组小鼠的存活率是所有组中最低的（12只小鼠中有4只死亡），而GLP的两个剂量（GLPL组中有1只小鼠死亡，GLPH组中有2只小鼠死亡），GLP可以提高小鼠的存活率。结肠短缩或萎缩是DSS诱导的结肠炎严重程度的重要指标。如图1E、F所示，与对照组相比，模型组的结肠长度显著较短。相反，GLP治疗显著增加了AOM/DSS处理小鼠的结肠长度。

组织病理学检查进一步确认了AOM/DSS诱导的结肠炎在结肠组织中的病理学。如图2A所示，H&E染色显示对照组基本正常，表现为完整的结肠黏膜和腺体细胞在小窝中有序排列。然而，在模型组中表现出表皮上皮脱落、小窝破坏、肌黏膜破坏、粘膜下水肿和炎性细胞浸润。相反，在GLP治疗小鼠中，这些症状显著减轻。组织病理学评分也显示，与模型组相比，GLP治疗小鼠的炎症损伤呈剂量依赖性显著减少（图2B）。

接下来检查了GLP对AOM/DSS处理小鼠的肿瘤发生的影响。小鼠结肠组织被纵向切开，肿瘤主要发生在远端结肠和直肠区域，这是AOM/DSS小鼠模型的典型特征。接受AOM/DSS处理的三组小鼠100%都发生了肿瘤。然而，与模型组相比，GLP治疗组的肿瘤数量和大小均呈剂量依赖性显著减少（图2C-E）。病理学分析显示，AOM/DSS处理的模型组小鼠发生了腺癌或高级别上皮内瘤变。然而，GLP治疗主要引起了表面肿瘤或管状腺瘤的不典型增生病变（图2F）。这些结果表明，GLP能够显著抑制AOM/DSS诱导的结肠炎和肿瘤发生。

接下来使用16S rRNA测序探究了GLP是否通过改善AOM/DSS小鼠模型中的肠道微生物组结构来改善结肠炎和肿瘤发生。稀释曲线和等级丰富度曲线表示样本测序数据是合理的，并且大多数的菌群多样性已经在所有样本中被捕获（图3A）。α多样性分析是物种丰富度（Chao和ACE指数）和多样性（Shannon和Simpson指数）的综合指标。如图3B和C所示，除Shannon指数外，Chao1、ACE和Simpson指数显示，与对照组相比，细菌种群明显减少，而种类多样性和丰富度在GLP给药后与模型组相比增加。特别是，Simpson指数表明，与模型组相比，两个剂量的GLP治疗显著增加了肠道微生物组的多样性（图3C）。主成分分析（PCA）显示，对照组和AOM/DSS诱导的模型组之间肠道菌群的相似性明显不同，GLP治疗显著改变了AOM/DSS影响的微生物组结构（图3D）。这些结果表明，GLP给药能够调节肠道微生物组的结构，并缓解AOM/DSS处理引起的细菌种群减少和多样性降低。

接下来，分析了肠道微生物组的结构。如图4A所示，在门水平上，所有样本中最主要的细菌是拟杆菌门、厚壁菌门、疣微菌门、变形菌门和放线菌门。与对照组相比，模型组中拟杆菌门的丰度较高，而厚壁菌门的丰度较低（图4B）。然而，GLP治疗后，拟杆菌门与厚壁菌门（F/B）比值增加，但没有显著差异。热图显示了在属水平上肠道微生物组结构的差异（图4C）。AOM/DSS组中乳杆菌和双歧杆菌的相对丰度显著低于对照组，然而GLP治疗显著增加了它们的丰度（图4D）。相反，与对照组相比，AOM/DSS组中梭菌属、脱硫弯菌属、变形菌属、无花果梭菌属和泛希泰属的相对丰度增加。GLP治疗部分甚至完全逆转了AOM/DSS处理引起的这些细菌相对丰度的上调（图4D）。此外，GLP治疗显著降低了乳杆菌-葛氏乳杆菌和假长双歧杆菌的相对丰度，并增加了酸性拟杆菌和菲内高变形菌的相对丰度，这些都与结直肠癌的发展有关联。

LEfSe分析被用来确定在所有组中占主导地位的粪便微生物分类单元。当LDA分数设定为4.0时，数据显示，与对照组相比，AOM/DSS处理的模型组有十个显著变化的分类单元，包括属水平的脱硫弯菌属和变形菌属（图5A）。将模型组与GLPL组进行比较，每种治疗都受到两个分类单元的影响，包括属水平的脱硫弯菌属和变形菌属，这两者在模型组中显示出相对较高的丰度，与GLPL组相比（图5B）。将模型组与GLPH组进行比较，模型组有六个变化的分类单元，GLPH组有四个变化的分类单元（图5C）。在这些分类单元中，乳杆菌和双歧杆菌在模型组和GLPH组中显著不同。相对于模型组，GLPH组中的脱硫弯菌属和变形菌属的相对丰度更低（图5C）。此外，在属水平上，乳杆菌是GLPH组中显著存在的物种。总的来说，这些结果进一步证明了GLP在AOM/DSS处理的结肠炎和与结肠炎相关的肿瘤小鼠模型中塑造肠道微生物组的作用。

微生物及其代谢产物如短链脂肪酸（例如乙酸、丙酸和丁酸等）在维持肠道稳态中发挥着重要作用。为了探究肠道微生物组与结肠癌之间的关系，研究检测了粪便中的短链脂肪酸水平。如图6A所示，乙酸是粪便中最丰富的短链脂肪酸。在模型组中，粪便中乙酸、丙酸和丁酸的含量显著降低，然而，GLP治疗显著增加了丙酸和丁酸的含量，但只略微增加了乙酸的浓度（图6A）。由于短链脂肪酸被G蛋白偶联受体（包括GPR41和GPR43）所识别，通过qRT-PCR和Western blotting研究了结肠组织中这些受体的表达模式。如图6B、D、E所示，与对照组相比，模型组的GPR43表达在mRNA和蛋白水平上均显著降低，而GLP给药显著增加了其表达。但所有组的GPR41 mRNA水平相同。此外，Western blotting未能检测到结肠组织中GPR41的表达。以上结果表明，GLP可能通过激活结肠细胞中的GPR43，以应对肠道微生物组成的变化和短链脂肪酸的增加产生抗炎和抗肿瘤作用。

肠道微生态失衡导致LPS分泌增加和肠道屏障功能紊乱。研究发现模型小鼠循环血浆中LPS水平显著升高（图6C），表明肠道上皮通透性增加。然而，低剂量和高剂量的GLP均以剂量依赖的方式显著减少了AOM/DSS诱导的循环LPS上调，表明GLP在维护肠道屏障功能方面具有保护作用。肠道上皮紧密连接蛋白（TJ）在肠粘膜屏障中起着重要作用，形成相邻上皮细胞之间的密封，并维持粘膜上皮屏障的完整性。与循环LPS水平增加相一致，结肠组织中关键的TJ蛋白occludin和ZO-1在模型组中显著降低（图6D,E）。相反，GLP治疗，特别是高剂量的GLP，显著逆转了AOM/DSS诱导的occludin和ZO-1表达减少（图6D,F）。肠道上皮抗菌肽Lyz1在AOM/DSS处理后与对照组相比在结肠组织中的表达显著增加，而GLP治疗明显逆转了其上调（图6D,E）。腺泡细胞丧失是结肠炎的一个标志，它会导致粘液分泌减少，并与肠道通透性增加相关。H&E染色显示，在AOM/DSS处理后，腺泡细胞数量严重减少，而GLP治疗显著保护了其免受AOM/DSS处理的损失（图6F）。此外，还观察到四组腺泡细胞分泌的MUC2的表达模式相似（图6G）。

已经确定LPS诱导的肠道上皮通透性增加是通过TLR4及其下游结合蛋白MyD88介导的，然后激活NF-κB诱导炎症基因的转录。如图6H,I所示，与对照组相比，AOM/DSS处理的小鼠中TLR4、MyD88和磷酸化NF-κB p65蛋白的表达显著增加，而GLP干预显著降低了TLR4、MyD88和NF-κB p65的磷酸化水平。综上所述，这些结果表明GLP在改善肠道屏障功能方面发挥重要作用，并且可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路来抑制AOM/DSS诱导的炎症反应和肿瘤发生。

由于LPS在介导结肠炎和CRC中的系统性和肠道炎症反应中发挥重要作用，首先通过ELISA检测了血清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。如图7A所示，与对照组相比，这些细胞因子的血清水平在模型组中均显著上调，然而，GLP治疗显著抑制了这些细胞因子的血清水平。与对照组相比IL-1β、IL-6和TNF-α在mRNA水平上在模型小鼠的结肠组织中显著上调（图7B）。相反，GLP治疗显著降低了AOM/DSS诱导的这些炎性细胞因子在mRNA水平上的上调（图7B）。Western blotting证实，与AOM/DSS处理相比，IL-1β在蛋白水平上的表达显著诱导，而GLP治疗显著抑制了结肠组织中的IL-1β表达（图7C）。与CRC相关的iNOS和COX-2的活性与CRC相关，且在AOM/DSS小鼠模型中上调。如图7B所示，AOM/DSS处理显著诱导了iNOS和COX-2基因在mRNA水平上的表达，而这些基因的表达受到GLP治疗剂量依赖性地下调。Western blotting进一步证实，GLP显著抑制了AOM/DSS诱导的iNOS和COX-2的过表达。

已经证实了分泌细胞因子和趋化因子的免疫细胞，如中性粒细胞和巨噬细胞在CRC发生过程中发挥重要作用。与中性粒细胞浸润相关的MPO水平在结肠组织中作为炎症的替代标志物，并已报道在AOM/DSS小鼠模型中上调。通过比色法测定，AOM/DSS处理后血清中MPO水平和结肠组织中MPO活性显著增加，而GLP治疗则显著降低了它们的上调（图7E,F）。过多的巨噬细胞浸润促进了慢性炎症的发展，并增加了CRC的风险。与对照组相比，AOM/DSS显著上调了巨噬细胞浸润标志物CD11b、CD11c、F4/80和CD68以及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达，在mRNA水平上，GLP治疗均显著抑制了这些基因的表达（图7G）。免疫组化染色进一步验证了CD68和F4/80的表达均在AOM/DSS处理组中显著上调，而GLP治疗组显示的染色明显少于AOM/DSS组，表明巨噬细胞浸润减少（图7H,I）。总的来说，这些结果表明，GLP通过调节AOM/DSS小鼠中的免疫细胞功能，在抑制系统性和结肠炎症方面具有显著作用，这可能是其抗肿瘤作用的原因。

采用了LPS刺激的细胞模型进一步研究GLP对免疫细胞功能的影响。首先，通过MTT实验确定GLP（0.2–1.6 mg/mL）对RAW264.7细胞没有细胞毒性和形态学影响。如图8A所示，LPS激活了RAW264.7巨噬细胞，从一般的圆形细胞形态转变为特定的树突形态。然而，GLP剂量依赖性地逆转了LPS诱导的RAW264.7细胞形态学变化（图8A）。接下来，确定了GLP在LPS处理的RAW264.7细胞中的抗炎活性。在LPS处理后，与对照相比，促炎介质IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1、iNOS和COX-2在mRNA水平上的表达显著增加，而GLP治疗显著降低了这些因子的上调（图8B）。相应地，Western blotting确认了在LPS处理后，iNOS、COX-2和IL-1β在蛋白水平上的表达均显著上调（图8C,D）。相反，GLP剂量依赖性地降低了这些蛋白的LPS诱导上调（图8C,D）。免疫荧光实验进一步验证了GLP能够抑制RAW264.7细胞中LPS诱导的COX-2和iNOS过表达（图8E）。此外，TLR4、MyD88和NF-κB p65信号通路在LPS刺激下均被激活，而GLP干预剂量依赖性地降低了TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的蛋白表达（图8F）。这些结果表明，GLP通过抑制RAW264.7细胞中巨噬细胞的激活来调节免疫反应。

此外，使用正常肠上皮细胞NCM460和CRC HT-29细胞来检查GLP对LPS诱导炎症的影响。MTT实验显示GLP（0.2–1.6 mg/mL）对NCM460细胞没有细胞毒性影响，而GLP在0.4–0.8 mg/mL对HT-29细胞没有细胞毒性影响，但在1.6–3.2 mg/mL浓度下会引起HT-29细胞的细胞毒性。为了更好地了解GLP对HT-29细胞中LPS诱导炎症的影响，研究了两个剂量范围（细胞毒性或非细胞毒性）。与在RAW264.7细胞中观察到的类似，GLP显著抑制了HT-29和NCM460细胞中LPS诱导的促炎介质IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS和COX-2在mRNA水平上的表达。相应地，Western blotting确认了在LPS处理后，iNOS、COX-2、IL-1β和NF-κB p65的表达在HT-29和NCM460细胞中蛋白水平上均显著上调（图8G,H）。相反，GLP减少了这些蛋白在两种细胞中LPS诱导的上调（图8G,H）。这些数据表明，GLP还可以抑制肠上皮细胞中LPS诱导的炎症。

MAPK已被证明在LPS诱导的巨噬细胞活化和前炎症介质释放中起重要作用。Western blotting结果显示，LPS在15分钟内显著诱导RAW264.7细胞中ERK和JNK的磷酸化（Fig. 9A,B）。JNK的激活在30分钟时达到最大值，而ERK在60分钟时达到峰值。0.8 mg/mL的GLP在几乎所有检测时间点显著抑制了LPS诱导的JNK和ERK激活。此外，GLP以剂量依赖的方式抑制了LPS诱导的JNK和ERK磷酸化（Fig. 9C,D）。

接着检测了AOM/DSS处理小鼠结肠组织中JNK和ERK磷酸化的表达。Western blotting显示，在模型组中，ERK和JNK的磷酸化水平显著增加，而GLP处理显著抑制了JNK和ERK蛋白的磷酸化（Fig. 9E,F）。此外，结果还显示，GLP显著下调了LPS诱导的HT-29和NCM460细胞中炎症信号通路MAPK（ERK和JNK）的表达（Fig. 9G,H）。综上所述，这些结果表明，GLP可能通过抑制MAPK JNK和ERK在体内外的激活来发挥其抗癌和抗炎活性。

研究结论

本研究首次报道了GLP能够减轻AOM/DSS诱导的小鼠结肠炎和肿瘤发生。如图10所示，GLP的抗炎和抗肿瘤活性可能与其调节肠道菌群失调、内毒素血症、结肠上皮完整性、粘液细胞功能、SCFAs产生以及调节免疫细胞功能相关。研究还证明了GLP在体外LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞和肠上皮细胞中具有潜在的抗炎活性。此外，GLP可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB和MAPK（ERK和JNK）信号级联来发挥其抗肿瘤和抗炎活性。

总的来说，本研究表明GLP在缓解AOM/DSS诱导的结肠炎方面具有良好的前景，支持GLP在治疗炎症性肠病和结肠癌患者中具有潜在的药用价值。然而，GLP在改善肠道炎症和肠道菌群方面的更详细机制仍有待进一步探讨。未来需要进一步研究GLP处理后改变的肠道菌群如何精确影响结肠癌的进展。