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题目：CwJAZ4/9 negatively regulates jasmonate-mediated biosynthesis of terpenoids through interacting with CwMYC2 and confers salt tolerance in Curcuma wenyujin 刊名：Plant, Cell & Environment 作者： Cheng-xi Jiang, Zhi-gang Wu et al. 单位：Wenzhou Medical University, Wenzhou 日期：28 April 2024    01 摘要  植物JASMONATE ZIM-DOMAIN（JAZ）基因在调节特殊代谢产物的生物合成和应激反应中发挥着至关重要的作用。 在这里，我们发现温郁金的两个叶特异性CwJAZ4/9基因被茉莉酸甲酯（MeJA）强烈诱导，并与萜类生物合成呈负相关。 酵母双杂交、萤光素酶互补成像和体外下拉分析证实，CwJAZ4/9蛋白与CwMYC2相互作用，形成CwJAZ4/9-CwMYC2-调节级联。 此外，转基因毛状根表明，CwJAZ4/9通过抑制萜类途径和茉莉酸反应，作为MeJA诱导的萜类生物合成的阻遏物，从而减少萜类积累。 我们发现CwJAZ4/9通过抑制盐介导的茉莉酸盐反应，降低盐敏感性，并在盐胁迫下维持毛状根的生长。 对MeJA介导的转基因毛状根系的转录组分析进一步证实，CwJAZ4/9对萜类途径基因进行负调控，并大量改变与盐胁迫信号传导和反应以及多种植物激素的串扰相关的基因的表达。 我们的研究结果建立了一个遗传框架，以了解CwJAZ4/9如何抑制萜类化合物生物合成并赋予其耐盐性，这为生产高价值的药用萜类化合物和通过遗传方法提高温育金品种的抗性提供了一个潜在的策略。 02 技术路线  The cotton (G. hirsutum) lines 84021 (HT tolerant) and H05 (HT sensitive) used in this study were grown in a greenhouse vector construction and plant transformation Phylogenetic analyses Measurement of JA contents Tissue sectioning, staining, and imaging ChIP-seq、Histone modification data analysis RNA-seq data analysis and GO term analysis 03 主要结果 3.1 CW中推定JAZ蛋白的鉴定 考虑到JAZ家族中高度保守的ZIM和Jas结构域，我们使用HMM搜索程序预测了总共62个全长CwJAZ蛋白。这些序列后来被称为CwJAZ1-CwJAZ62。 为了确定CwJAZ蛋白的分类和进化史，我们基于62种CwJAZ蛋白的氨基酸序列和其他物种的已知JAZ构建了一个未展开的系统发育树。如图1所示，所有JAZ序列被分为五个主要组（第一组-第五组）。第V组仅包含单子叶植物的JAZ，并扩展了CwJAZ的大多数成员，这些成员与OsJAZ紧密聚集。相反，第I组构成了一个具有最少CwJAZ成员的独特组（CwJAZ11/27/55），当比较较低苔藓植物的JAZ时，这些成员被认为是最早的进化成员。 与先前的结果一致，CwJAZ蛋白可以用已知的VvJAZ、AtJAZ和OsJAZ蛋白来表征，这表明CwJAZ蛋白可能经历与先前在其他被子植物中所表征的JAZ平行的进化过程。此外，我们使用MEME网络服务器确认了两个保守的基序，其中一个Tify结构域（TIFYSG）位于N末端，另一个Jas结构域位于C末端。与上面构建的未展开树的拓扑结构类似，CwJAZ蛋白被分为五大类。Jas结构域中氨基酸残基的变化导致JAZ功能分化。 为了表征这种变异，我们对多个序列进行了比对分析，发现23种CwJAZ蛋白的Jas区显示出典型的降质LPIAR（R/K）序列，该序列可以在JA-Ile存在的情况下通过与F盒蛋白COI1蛋白结合来组成共受体COI1-JAZ复合物。在第一个和第三个残基处频繁地出现德隆变异。此外，Jas基序最保守的序列被认为是HSLQRFLEKRKDR，占42.4%（14种蛋白质）。与degron和Jas基序相比，CwJAZs中的NLS是变化最大的基序，并共享基本的XXXXPY序列。 在这项研究中，62种CwJAZ蛋白中的56个成员具有NLS基序，除了CwJAZ26/30/31/42/43/49。其中，主要的NLS基序被识别为V（H）S（P）KAPY残基（12种蛋白质）。有趣的是，我们在CwJAZ中没有发现与两亲性抑制（EAR）结构域相关的LxLxL型乙烯反应因子，这表明这些CwJAZ成员可能不会募集TOPLESS来介导茉莉酸盐反应的转录抑制
图1 JAZ蛋白的系统发育分析。 3.2 CwJAZ转录物的组织特异性图谱及其与萜类代谢产物的相关性 考虑到植物特化代谢产物通常以组织特殊的方式产生，因此，我们使用我们之前报道的来自不同CW组织（花、叶、根茎和块茎）的转录组学和代谢组学数据集，分析了CwJAZ转录谱，以联系萜类化合物的空间积累。在上述鉴定的62个CwJAZ中，55个转录物在至少一个组织中表达，在不同组织中具有不同的表达模式。 在这里，我们使用了组织特异性（TS）表达的评分算法，如之前所描述的，来识别TS基因集。该分析产生了29个TS表达的CwJAZ，TS得分>0.5。聚类分析显示，这些TS-CwJAZ转录物在其相应组织中表现出较强的组织特异性和峰值表达（图2a）。特别是，我们注意到TS CwJAZ转录物在花（11个TS基因）和叶（10个TS基因，其中萜类化合物的积累水平低于根茎和块茎。 此外，我们随机选择了10个TS JAZ，并使用RT-qPCR分析重新验证了其组织特异性表达谱。为了更好地了解CwJAZ对TBS的贡献，我们对CwJAZ转录物的表达水平与CW不同组织中萜类化合物的丰度之间进行了相关性分析。如图2b所示，25个CwJAZ（大多数为TS基因）的表达与15个CW主要萜类化合物的积累呈负相关。 值得注意的是，包括CwJAZ2/3/4/7/9/14/15/16/21/23/26/38/48在内的几个CwJAZ与CW中的一些主要生物活性成分（curdione、呋喃二烯、枯烯醇、germacrone等）表现出显著的负相关，这可能意味着它们在负调控TBS中的关键作用。总之，这些缩小的CwJAZs基因集是控制萜类化合物产生的潜在候选者。
图2 CwJAZ基因的组织特异性分析及其与CW组织（花、叶、根茎和块茎）中萜类代谢产物的相关性。 （a） 热图显示CwJAZ基因的组织特异性（TS）图谱， （b） CwJAZ基因表达水平与萜类化合物相关性的热图。 3.3 参与JA信号传导的推定CwJAZ基因的鉴定 JAZ通过JAZ-MYC信号级联作为下游核心调节因子MYC2的阻遏。因此，参与JA途径的相关候选JAZ基因将是那些抑制MYC2表达的基因。先前的研究报告称，一些JAZ蛋白（AtJAZ1/10）N末端的神秘MYC相互作用结构域（CMID）被认为对与MYC-TF的相互作用具有特异性，并且基本FxxxCxxLxxY基序是高等植物中CMID的高度保守氨基酸。基于这一推测，我们将上述获得的这些CwJAZ候选者的片段与AtJAZ1作为参考进行比对，发现只有CwJAZ4/9/15/16/21/23/48在N末端具有典型的CMID区域（图3a）。 为了进一步确定这些含有CMID的CwJAZ基因是否对JA信号有反应，我们使用RT-qPCR检测了它们在MeJA处理的叶片中的表达变化。通过持续的MeJA处理，所有分析的CwJAZ基因的表达水平都被上调到不同程度。特别是，在MeJA处理后1小时，CwJAZ4/9转录水平分别快速升高109倍和113倍以上（图3b），然后急剧下降。相反，CwJAZ15/16//21/23/48水平逐渐上调，在4小时或6小时达到最大值，其表达变化相对低于CwJAZ4/9。 此外，CwMYC2与CwJAZ4/9表现出相同的表达模式（图3b），其丰度在MeJA处理1小时后比对照（0小时）增加了167倍以上，表明其在早期对JA处理有巨大反应。有趣的是，CwJAZ4/9表现出高度的叶特异性表达谱，在很大程度上逆转了生物活性萜类物质的积累（图2b，图S4）。因此，我们推测CwJAZ4/9可能在通过JA信号抑制CW中萜类化合物的生物合成中发挥重要作用。
图3 CwJAZ4/9蛋白通过与CwMYC2的相互作用参与JA信号通路。 （a） 典型CwJAZ蛋白N末端区域的序列标志和各种CMID （b） MeJA诱导CW叶片中CwJAZs和CwMYC2表达的时间过程，表明CwJAZ4/9基因被MeJA快速诱导。 （c） 酵母细胞中CwJAZ4/9-CwMYC2相互作用的Y2H测定。 （d） 本氏N.benthamiana叶片中CwJAZ4/9-CwMYC2相互作用的LCI测定。 （e） CwMYC2和CwJAZ4/9蛋白之间的体外下拉测定，证实了WB检测到的CwMYC2-GST，而不是GST本身捕获His-CwJAZ4/9。符号“–”和“+”表示相应蛋白质的缺失和存在。 （f） CwJAZ4/9-GFP融合蛋白在烟草叶肉原生质体中的亚细胞定位。 3.4 CwJAZ4/9形成异二聚体并直接与CwMYC2相互作用 由于叶特异性CwJAZ4/9在MeJA处理的早期表现出最高的表达变化，并且具有典型的CMID结构域，因此选择它们进行功能实验。为了确定CwJAZ4/9是否通过与CwMYC2的相互作用参与JA信号传导，我们在pGBKT7载体中表达了CwJAZ4/9基因，在pGADT7载体中也表达了Cw MYC2基因。所有研究蛋白质的自激活测试证实，它们在Y2H系统中没有自激活特性。Y2H筛选显示，当与CwMYC2和CwJAZ4/9载体共转化时，酵母可以在选择性合成培养基（SD‐Trp/‐Leu/‐His/‐Ade）上生长，这表明CwJAZ4/9与酵母细胞中的CwMYC2蛋白相互作用（图3c）。同样，LCI分析表明，当融合蛋白具有相同的定位和直接相互作用时，CwJAZ4/9-cLUC和CwMYC2-nLUC的共转化在烟叶中产生LUC信号（图3d）。 为了证实上述观察结果，进一步进行了体外下拉实验，其中His-CwJAZ4和His-CwJAZ9重组蛋白均被GST‐CwMYC2下拉（图3e）。相反，在对照中没有捕获His-CwJAZ4/9蛋白（没有GST‐CwMYC2作为诱饵）。这些结果表明，CwJAZ4/9蛋白在体外和体内与CwMYC2发生物理相互作用，表明两种CwJAZ4/9蛋白都是CwMYC2-的上游共阻遏物。另一方面，CwJAZ4和CwJAZ9之间的相互作用也通过Y2H和LCI测定来检测。结果显示，CwJAZ4/9在酵母和烟叶中相互作用（图3c，d），强烈表明它们形成异二聚体以行使生物功能。 另一方面，MYC2可能影响JAZ蛋白的定位。为了确定CwJAZ4/9的亚细胞定位，将CwJAZ4/9‐GFP融合构建体和35S:GFP对照载体分别与核NLS‐mKate标记物共同引入烟草原生质体中。如图3f所示，CwJAZ4/9-GFP融合蛋白的GFP信号仅在细胞核中观察到，并与NLS‐mKate的RFP信号完全共定位，而对照35S:GFP在细胞质和细胞核中均显示荧光。这些结果有力地表明，CwJAZ4/9蛋白作为转录系统中的调节因子被靶向细胞核。基于这些发现，我们认为CwJAZ4/9基因是参与JA信号传导并通过抑制CwMYC2调节TBS的候选者。 3.5 CwJAZ4/9通过调节JA诱导的基因表达抑制萜类化合物的生物合成 为了确定CwJAZ4/9是否通过JA信号传导调节TBS，我们分别在CaMV35S启动子的控制下，用空载体（EV）对照产生了过表达和RNA干扰（RNAi）毛状根系（CwJAZ1_Ox、CwJAZ9_Ox、CwJAZ4_Ri和CwJAZ9_Ri）。通过特异性引物验证阳性转基因系，并选择两个独立系进行进一步实验。因此，相对于对照（EV），过表达系（CwJAZ4/9_Ox）中CwJAZ4/9的丰度显著升高，增加了50倍以上，而在RNAi系（Cw JAZ4/9_Ri）中，它们的表达显著降低了15倍以上（图4a），表明转基因操作的有效性。 为了确定CwJAZ4/9是否影响MeJA诱导的JA信号传导，使用RT-qPCR测定量化转基因系中参与JA生物合成的标记基因（CwAOS1、CwJAR1）和信号传导（CwMYC2、CwCOI1）的表达水平。正如预期的那样，作为对MeJA的反应，所有研究的基因在CwJAZ4/9_Ox系中都被显著抑制，在CwJAZ4/9_Ri系中增加（图4b）。这表明CwJAZ4/9降低了JA的敏感性，并且可能是控制JA信号通路的负调控环的组成部分。 此外，我们分析了我们先前鉴定的TBS途径基因在转基因系中的表达水平。在MeJA处理下，CwJAZ4/9的过表达显著抑制了CwFPS2、CwTPS5和CwTPS10的表达，而CwJAZ4/9的沉默显著提高了这些基因的转录水平（图4b）。通过GC‐MS进一步监测了CwJAZ4/9的转录调节对过表达和沉默毛状根系中萜类化合物谱的影响（图4c）。因此，与对照（EV）相比，与CwJAZ4/9（图2b）呈负相关的几种重要药物代谢产物的浓度，包括吉马酮、姜黄醇、姜黄二酮、呋喃二烯、姜黄烯、β-榄香烯，在MeJA诱导的Ox系中显著下调30%-70%，在MeJA诱导的RNAi系中上调2-3.5倍。萜类化合物的这种积累模式与TBS途径基因的表达变化一致。总之，这些结果表明CwJAZ4/9通过抑制JA信号传导来负调控TBS。
图4 CwJAZ4/9改变了参与JA信号传导和萜类生物合成的基因的表达，并调节萜类化合物的产生。 （a） CwJAZ4/9在转基因和对照（EV）毛状根系中的相对表达。 （b） 在100µm MeJA处理48小时的转基因和EV系中，与JA信号传导和萜类生物合成相关的基因的相对表达。 （c） 用100µm MeJA处理48小时的转基因毛状根系中代表性萜类化合物的测量。 3.6 CwJAZ4/9基因抑制盐介导的JA反应 当受到各种非生物胁迫时，JAZ蛋白通常通过JA信号在调节植物发育和防御过程中发挥重要作用（。在本研究中，我们用盐（100 mM NaCl）处理对照毛状根（EV），以研究CwJAZ4/9基因是否调节应激诱导的反应。与MeJA诱导的表达谱一致（图3b），CwJAZ4/9基因的表达在早期被盐高度诱导，在盐处理后2小时增加>40倍，然后迅速减少（图5a）。同时，我们分析了JA和JA-Ile积累对盐胁迫的响应时间过程（图5b）。在盐处理后2小时内，JA和JA-Ile的水平分别急剧增加了8.4倍和5.6倍。随后，这些水平随着治疗时间的延长（从2小时到12小时）缓慢下降，但仍相对高于对照组（0小时）。这表明盐诱导的CwJAZ4/9的快速激活与JA和JA-Ile的积累密切相关。 为了深入了解CwJAZ4/9基因通过JA信号影响盐介导的反应的作用，进一步进行了RT-qPCR分析，以揭示盐胁迫期间参与JA反应的基因的表达。盐处理4d后，诱导所有品系中CwMYC2、CwCOl1、CwJAR1和CwAOS1的表达；然而，不同转基因系的诱导程度有显著差异。与正常环境（MS）相比，盐胁迫略微介导了CwJAZ4/9_Ox系中JA反应基因的表达，或者没有显著变化。相反，这种盐介导的JA相关基因的表达在CwJAZ4/9-Ri系中显著增加，变化最大（图5c）。另一方面，所有研究的基因在EV中的表达都是由盐适度诱导的。这些结果表明，CwJAZ4/9抑制了JA信号通路下游的盐介导作用。
图5 CwJAZ4/9抑制盐介导的JA反应。 （a） 盐诱导CW毛状根中CwJAZ4/9的表达变化。 （b） 盐诱导的JA/JA‐IIe在毛状根中积累的时间过程。 （c） CwJAZ4/9转基因和EV系中参与JA反应的基因的盐介导表达。 3.7 CwJAZ4/9赋予CW毛状根耐盐性 为了进一步探讨CwJAZ4/9基因在盐胁迫下调节毛状根生长的作用，我们测量了转基因CW毛状根在盐处理下的长度。如图6a所示，转基因和EV系毛状根的生长长度在正常情况下没有明显变化，但在盐处理4天后明显受到抑制。有趣的是，EV和RNAi系的长度比过表达系的长度受到更严重的抑制。此外，我们检测了脯氨酸的积累，脯氨酸是激活防御和存活机制的关键信号分子，以及所有研究品系的总抗氧化能力。盐显著介导过表达和EV系中的脯氨酸积累，但CwJAZ4/9_Ox系的脯氨酸相对增加剂量高于EV系。令人惊讶的是，在CwJAZ4/9_Ri系中没有观察到盐介导的脯氨酸积累。脯氨酸含量显著降低（图6b）。在正常条件下，与EV相比，CwJAZ4/9_Ox系的TEAC水平增加了1.4–2.0倍，而RNAi系则减少了43%–77%（图6c）。盐处理4天后，EV和RNAi系中的TEAC水平显著降低。然而，在CwJAZ4/9_Ox系中，盐诱导的显著减少并没有预期实现，这意味着即使在盐胁迫下，CwJAZ4/9基因也保持着高抗氧化能力。这些结果表明，CwJAZ4/9降低了CW毛状根中应激介导的敏感性，并赋予其耐盐性。
图6 CwJAZ4/9提高了盐胁迫下的适应性。 （a） 转基因毛状根（CwJAZ4/9_Ox和CwJAZ4/9_Ri系）和对照（EV）的生长表型。 CwJAZ4/9转基因品系在4 d盐处理后脯氨酸含量（b）和Trolox等效抗氧化能力（TEAC）（c）的变化。 3.8 转录谱鉴定CwJAZ4/9依赖性基因表达 为了进一步了解在CwJAZ4/9控制下MeJA介导的基因表达变化，我们进行了RNA测序，以比较在MeJA存在下生长的EV（对照）、CwJAZ4/9_Ox和CwJAZ4/9_Ri毛状根的转录谱。我们在这里使用了严格的统计标准来定义CwJAZ4/9依赖性基因。首先，候选基因在过表达系和RNAi系之间表现出反向表达模式，并且在过表达株系与EV以及RNAi系与EV中都有差异表达。其次，在这些鉴定的DEG中，我们选择了CwJAZ4和CwJAZ9转基因株系之间的重叠候选基因作为最终基因列表。基于这一分析，我们鉴定了1201个在CwJAZ4/9_Ox系和EV之间差异表达的CwJAZ4/9依赖性基因，以及994个在CwJAZ4/9_Ri系和EV间表现出显著表达差异的基因（图7a）。 对CwJAZ4/9_Ox系中1201个DEG的GO分析表明，GO包括防御反应、对氧化应激的反应、细胞壁、ATP代谢过程等，是显著富集的生物过程（图7a）。同样，RNAi系中的CwJAZ4/9-依赖性994基因集与GO术语相关，包括茉莉酸生物合成过程、对激素刺激的反应、对乙烯刺激的反应和萜类生物合成过程。接下来，我们重点研究了参与这些富集生物过程的过度表达基因。我们发现，大多数与应激信号传导和防御反应相关的基因在CwJAZ4/9_Ox系中显著上调，在CwJAZ4/9_Ri系中下调，包括编码质膜Na+/H+反转运蛋白（SOS1）、CBL相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（SOS2）、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK6）、水通道蛋白（PIP）、K+外排反转运蛋白、谷胱甘肽合成酶（GSH）、甜菜碱醛脱氢酶（BADH）、脯氨酸生物合成酶（P5CS、P5CR、OAT）和应激反应蛋白的已知基因。（富含脯氨酸的蛋白，PEK；热休克蛋白，HSP），发病机制相关蛋白（PR）（图7b）。此外，大多数参与JA生物合成和反应、TBS和调节的基因在CwJAZ4/9_Ox系中被抑制，在CwJAZ4/9_Ri系中被增强（图7b），这与RT-qPCR证实的结果一致（图4b）。 值得注意的是，编码乙烯响应转录因子1（ERF1）、AP2结构域转录因子PLETHORA1（PLT1）的多个基因整合JA和乙烯信号以调节各种防御反应和SM生物合成，在CwJAZ4/9_Ox系中高表达，在Cw JAZ4/9_Ri系中被抑制（图7b）。重要的是，在CwJAZ4/9_Ox系中，通过上调编码玉米黄质环氧化酶（ZEP）、PYL2/6/8、SNF1相关蛋白激酶2型（SnRK2）等的ABA响应基因，也激活了ABA应激相关过程。我们还观察到，赤霉素（GA）信号通路的几种DELLA阻遏物在CwJAZ4/9_Ox系中被强烈抑制。这些发现表明，CwJAZ4/9在CW中作为MeJA诱导的TBS的负调节因子和应激反应的正调节因子具有潜在作用，并进一步强调了JA信号和其他植物激素信号之间的复杂交叉作用。
 04 结论 基于这些发现，我们得出结论，CwJAZ4/9通过与CwMYC2的相互作用负调控MeJA诱导的TBS，并通过改变与应激信号和反应、激素信号相关的基因表达，赋予毛状根生长耐盐性。我们提出了一个假定的分子框架来揭示这些生物过程（图8）。 在MeJA处理下，CwJAZ4/9被快速诱导然后降解，从而进一步释放CwMYC2以促进萜类化合物的产生。在CwJAZ4/9转基因系中的证据（图3和4）表明，CwJAZ4/9通过CwJAZ4/9‐MYC2级联强烈抑制参与MVA和MEP途径以及JA生物合成和反应的许多基因的表达。 对于耐盐性，CwJAZ4/9作为上游核心调节因子，通过多种激素（JA、ET和ABA）的交叉作用来调节应激防御。该机制可描述如下： （i）CwJAZ4/9削弱JA反应并触发对CwMYC2的抑制，从而进一步消除PLT的MYC2抑制反应，促进毛状根生长。 （ii）CwJAZ4/9诱导ABA激活的SnRK2，其进一步控制ROS和渗透稳态。 （iii）CwJAZ4/9与CwMYC2相互作用并抑制其，被抑制的CwMYC2进一步促进EIN3活性，从而增强ERF1的表达；而CwJAZ4/9也能抑制EIN3的表达。同时，CwJAZ4/9至少部分通过上调与SOS1/2和MAPK6应激信号传导、细胞壁渗透调节、抗氧化生物合成和应激反应蛋白相关的基因来介导耐盐性。 总的来说，我们的研究结果为了解CwJAZ4/9-MYC2级联如何控制TBS和调节耐盐性提供了一个遗传框架。然而，未来研究的挑战将是识别与CwJAZ4/9相互作用的其他特异性转录因子，以揭示CwJAZ蛋白与CW下游生理反应之间的联系。
05 原文获取 原文链接： https://onlinelibrary./doi/10.1111/pce.14930 PDF获取： https://www./h-nd-336.html |
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