尽管可用的空间转录组学工具数量有所增加，但它们的高成本可能会限制用户对它们使用。这些技术的主要数据集数量有限，也限制了我们对其优缺点的了解，以及在考虑组织、保存和处理方法的情况下，就哪种技术最适合特定应用做出明智决定的能力。在分析方法的选择以及与蛋白质组学等其他模式的整合方面也存在挑战。对于这些工作以及提高人们对利用空间转录组学获得的结果的信心至关重要的是，需要建立质量保证和控制标准，并实现各种检测方法之间的协调统一，以生成可查找和可互操作的数据集。
尽管空间转录组学领域的技术进步、采用和数据生成正在增加，但分析、数据存储和共享方面的挑战越来越明显。以单细胞分辨率覆盖整个基因组的能力即将实现，但由于转录水平从罕见到高表达的动态范围，这仍然是一个挑战。商业工具提供了优于为个人实验室内部使用而开发的工具的优势，因为它们提供了标准化和质量控制的产品；然而，大规模采用商业工具可能会使单个实验室的成本过高。相反，单个实验室开发基于FISH的分析可以降低这些成本，但这些工具受到其有限的通量、缺乏标准化、缺乏改进技术的资源、训练有素的人员的流动以及可能影响互操作性的技术变化的限制。值得注意的是，需要进行基准测试来评估非商业性测定的性能，因为尚未进行对照实验来比较不同空间转录组平台的性能，这些平台在相同组织类型上使用相同的探针组，具有不同的保存方法或组织厚度。这些数据对于描述不同方法最好覆盖的条件和目标以及提供关于每种方法的优点和缺点的信息至关重要。HuBMAP倡议正在与几个肾脏图谱项目合作，解决成人肾脏的一些问题。
尽管有针对性，但空间分辨技术将越来越多地获得亚细胞分辨率和更高的多重性。需要解决的一个限制是有限的成像区域。当前技术的成像面积＜3 cm2，因此不适合于较长的组织切片。此外，每次成像运行的通量很低（在同一次运行中只能对几张切片进行成像），但仍需要数天的成像时间。这里的额外挑战是，每个样本的成像数据可能是几百GB，因此可能需要专用的主动存储和分析计算能力（例如几百MB的快速访问存储器和快速处理器）。空间转录组技术的分析工具仍处于早期阶段，用户可能必须测试不同的工具（例如分割、邻域和邻近度分析），以确定对给定任务最有用的工具。例如关于分割，在定义细胞边界、捕获缺失的细胞和分离高细胞密度区域中的细胞方面仍然存在相当大的挑战。在探针设计中，高表达基因（如UMOD）可能使信号饱和，必须省略，在设计靶区期间，必须降低其浓度或使用较低数量的探针来靶向该基因。需要改进的其他限制是在生成空间转录组数据的同一切片上进行组织学的共同配准，因为在空间转录组实验完成后可能无法保留形态学，以及每张切片的成本。对于基于测序的技术，公开共享原始数据需要纳入控制访问和保护患者机密的措施。其他基于探针的平台，如Visium FFPE、CosMx和Xenium，不直接读取RNA序列，可能对数据共享有较低的障碍。一个主要挑战是如何以简化的方式使数据可供领域使用，以便以交互方式用于假设生成和测试。需要考虑的一个重要点是，大多数概念验证数据都是在2D中进行分析的。与2D相比，3D空间转录组学提供了更准确、更深入的细胞邻域和亚细胞定位信息，但数据存储、分析、共享和可用性越来越复杂。预计近期的进展将促进空间转录组学的发展，并能够在细胞水平上同时询问蛋白质、染色质和基因表达。然而，临床应用的进展需要与组织病理学家密切合作，将颗粒分子途径与异常组织学区域联系起来。此外，还需要与临床医生合作，为异常分子病理学确定合适的药物靶点，并从空间转录组数据中生成证据，以优化现有药物的治疗选择，类似于肿瘤学家如何将生物或化疗选择建立在肿瘤活组织检查的基础上。
考虑到数据集和工具的技术复杂性、可变性以及空间转录组实验中的分析挑战，建议制定指南，以确保空间转录组数据集符合FAIR数据原则（即，它们可被人类和机器发现、可访问、可互操作和可重复使用），并受到质量控制。在预分析步骤中，建议保持细致的元数据记录，特别是有关分析试剂盒版本、组织保存方法和组织处理流程的信息。如果无法进行联合配准的组织学染色，鼓励研究人员使用自体荧光获得伪组织学图像。至少，组织学需要相邻的切片。还建议采用解剖结构、细胞类型和生物标志物的标准化命名法（ASCT+B），具有清晰的本体术语，领域内可以很容易地解释，以促进单细胞转录组数据与空间转录组学的整合。强烈建议在每批中运行一个对照组织样本，最好是在与查询样本相同的载玻片上运行一个小组织样本，以监测测定漂移和测定性能，并为技术和生物再现性建立可接受的参数。应通过公共数据存储库向领域提供ROI或视野的图像，并应清楚地表明所使用的标记基因和阈值。最后，应免费提供用于分析的代码，包括分割和插补等。
