可固定线粒体超分辨探针的实验步骤及染料光学性能

可固定线粒体超分辨探针/PK Mito Orange Fix 线粒体探针是用于固定样本的线粒体内膜荧光染料，能够特异性结合到各类细胞的线粒体内膜上，继而利用醛类固定液固定后成像。与传统染料相比，PKMITO 系列线粒体染料光毒性大幅度降低，使用更加简便，只需染色30分钟后按普通方式固定，就能获得稳定的高亮度荧光信号，并能在成像时Z大程度保持线粒体状态，是J佳的超分辨及长时程线粒体成像染料，本产品在固定后可达到高于100nm的成像分辨率，并向下兼容各种荧光显微镜。每份可固定线粒体超分辨探针/PKMITO Orange Fix染料足够10-50次成像。  

可固定线粒体超分辨探针（#PKMOF-1）实验步骤：

1.在 PK Mito Red/ Orange/ Deep Red 中加入 100 μL（25 nmol）/ 20μL（5 nmol）新鲜干燥的 DMSO，混合均匀，得到 250 μM 母液。

2.将培养基预热至 37 ℃，将 PK Mito Red/ Orange/ Deep Red 母液按照1000- 5000倍稀释比例加入到预热的培养基中，稀释后的染液建议尽快使用，久置后可能导致部分染料分解或沉淀。

3.吸去细胞原有的培养基，更换为稀释好的培养基染液，在培养箱中孵育15 分钟。

4.用预热的培养基清洗细胞一至两次，即可用于荧光成像。

注：我们建议对大多数细胞系和原代细胞使用 200-300 nM，如HeLa、COS7、U-2OS、Vero细胞、原代神经元、脂肪细胞和肝细胞；对组织染色使用500-600 nM。不同样品染色条件有所差异，建议起始染色方法为 1000 倍稀释，15 分钟染色，请根据实际染色效果进行调整。

固定细胞线粒体染料可参考以下步骤：

5.在 PK Mito Orange Fix 中加入 100μL（50 次）/ 20 μL（10 次）新鲜干燥的DMSO，混合均匀，得到 250 μM 母液。

6.将培养基预热至 37 ℃，将 PK Mito Orange Fix 母液 500 倍稀释加入到预热的培养基中，得到 500nM 的染色工作液，稀释后的染液建议尽快使用，久置后可能导致部分染料分解或沉淀。

7.吸去细胞原有的培养基，更换为稀释好的培养基染液，在培养箱中孵育20 分钟至90分钟。

8.用预热的培养基清洗细胞一至两次，即可用于活细胞荧光成像。

9.用预热的 PBS 缓冲液清洗细胞两次，加入预热的 2.5%戊二醛或4%多聚甲醛等醛类固定液固定 15 分钟。用 PBS 缓冲液清洗细胞后，即可用于固定细胞成像。

注：我们建议对大多数细胞系和原代细胞使用 500 nM 浓度染液作为起始点优化染色条件，如HeLa、COS7、原代神经元、心肌细胞等。不同样品染色条件有所差异，建议起始染色方法为 500 倍稀释，20 分钟染色，请根据实际染色效果进行调整。维拉帕米（Verapamil）可以在染色中加入，有助于得到更明亮均匀的染色线粒体。

可固定线粒体超分辨探针染料光学性能：

可固定线粒体超分辨探针文献参考：

1. Yang, Zhongtian, et al. "Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimizephototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging." Chemical Science (2020).

2. Liu, Tianyan, et al. "Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentleinnermembrane stain." Proceedings of the National Academy of Sciences 119.52 (2022): e2215799119.

3. Chen, Jingting, et al. "An aldehyde-crosslinking mitochondrial probe for STED imaging infixedcells."Proceedings of the National Academy of Sciences 121.19 (2024): e2317703121.