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自闭症谱系障碍（ASD）是一种病因不明的异质性神经发育障碍，每100-150人中就有1人患病。诊断基于三类行为标准：异常的社交互动、沟通障碍和重复行为。异常的社交互动，包括对同伴的兴趣降低和难以维持社交互动，以及无法使用眼睛凝视和面部表情进行有效沟通；交流障碍，通常表现为语言延迟、语言理解和对声音的反应不足、词语和短语的刻板或字面使用、语用能力差（知道如何和何时使用语言）和缺乏韵律，导致单调或夸张的言语模式；以及重复行为，包括运动刻板印象、重复使用物体、强迫行为、坚持相同、对变化感到不安以及不寻常或非常狭隘的兴趣。ASD 患者还常伴有其他临床症状和共患病，包括癫痫、多动、焦虑、智力较低、反应迟钝、对感官刺激的高反应性和低反应性、睡眠障碍和胃肠道不适等。主要指标涉及病史、生理发育、神经系统发育、孤独症样行为、生化指标、并发疾病等方面。  慢性社交失败模型的建立 （Chronic Social Defeat Stress, CSDS）  评估社交等级的行为范式，攻击性CD1小鼠的筛选选用CD1退役种小鼠，购买回来后单笼饲养一周让起适应实验环境再进行筛选。选用WT型C57BL/6J小鼠测试退役种CD1小鼠攻击性。测试用小鼠体重和体形小于受试CD1退役种小鼠，增加CD1小鼠对测试小鼠的攻击欲望。攻击性CD1小鼠的筛选进行三天。每天将不同的WT型C57BL/6J小鼠放入笼中与待筛选的CD1小鼠共同饲养，观察3min。判定攻击性CD1小鼠标准有两条：第一，攻击潜伏期在60s以内；第二，3天筛选中连续2天有攻击行为。筛选出的攻击性CD1小鼠完成一次标准的10天慢性社交失败造模后，如要进行给新的一批实验鼠造模，需从新按以上步骤进行攻击性筛选。2.慢性社交失败造模将C57BL/6J小鼠放入攻击性CD1小鼠笼中，观察5min。CD1小鼠对入侵其领地的C57BL/6J小鼠进行观察和试探后，对其发起连续猛烈的攻击。被攻击实验C57BL/6J小鼠会表现出明显的僵直、平躺和躲在角落等抑郁样行为，并且在其受到CD1小鼠攻击时出现放弃抵抗的行为。接着，使用透明有孔的有机玻璃板将笼子一分为二，使得C57BL/6J小鼠与CD1小鼠完全隔开，但同时保证该小鼠与CD1小鼠视觉和嗅觉的接触，如此这般隔离饲养24h，维持对其视觉和嗅觉的应激。第二天将前天受攻击的小鼠放入全新陌生攻击性CD1小鼠笼中，按前一天流程造模。如此这般持续进行10天的造模，并且每天接受不同的CD1小鼠攻击。造模期间特别注意防止受攻击小鼠后背、后腿及生殖器受伤，以免影响后续行为学实验。造模结束后，将CSDS小鼠独笼饲养，一天后再进行其它行为学测试。对照组小鼠不接受任何处理，每笼饲养2两只小鼠且用透明有孔有机玻璃板隔离饲养，使其不能产生触觉上交流，饲养10天。每天将小鼠饲养鼠笼进行轮换，使其每天和陌生的小鼠隔离饲养。 钻管实验（tube test）
适应：把管子用双面胶粘在台子上固定好，把小鼠放在实验台子上，让它在管子周围自由活动，这样适应 3 天。 训练：让小鼠熟悉测试流程和环境。行为房应安静且灯光微弱，温度适宜。准备塑料棒、75% 酒精、纸巾、白纸、笔，计数器和计时器。把小鼠放在桌子上探索 1 min，然后让它通过管子，如果小鼠在里面很久不动或者撤退，就用塑料棒拨拨它的尾巴。所有鼠需通过管子每天 10 次，其中每一端各通过 5 次。训练 3 天，每只鼠每天 10~15 min。 测试：小鼠在管中两两对抗测试至少持续 4 天，每天上下午各一次；画出管子中线，测试前每只鼠再训练通过管子一次。两只小鼠分别放置在两个管口，两个人同时将小鼠头送进管口，同时释放并开始计时和拍照。测试顺序随机，每笼 4 只小鼠应比 6 次才能比完，每只小鼠都比了两次，每只小鼠的这两次测试应该从不同的管口钻进去，每次测试时长通常少于 30 秒或1分钟，特殊情况在 2 min 内两只鼠都没撤退应停止测试；把其他小鼠推出管外的小鼠获胜，撤退出管外的小鼠失败，失败小鼠四只爪子都退出管外停止计时；记录小鼠每次胜败结果和决出胜负花费的时间，每笼的 4 只小鼠，根据它们相互的胜败情况进行排名并统计。小鼠等级由它与其他 3 只小鼠的次数评估出，一般认为同笼 4 只鼠若在连续 4 天都保持了相同等级则等级固定；每次测试完让两只鼠在桌子上自由探索 1 min，然后放回原笼和其他鼠一起休息 2 min，来减少当前胜利或失败可能带来的影响。 重复刻板行为 将测试大鼠单独放置在一个80×80厘米的开放箱体中，使其自由活动20分钟，测量后10分钟内大鼠自我梳理的总时间和总次数，自我梳理的特征包括：舔爪子、洗鼻子和脸或者用爪子抓毛。 小鼠具有梳理毛发的天性，在梳理行为中，揭示了小鼠复杂的固定梳理动作模式，将其仪式化为一种刻板的展示，随后梳理毛发作为反应重复刻板行为的指标广泛适用于孤独症小鼠模型中。常见的捋毛动作包括前肢梳理、摩擦清洗颜面、身体腹侧、尾部和生殖器清理用于分析大鼠的刻板、重复行为。实验大鼠被放置在一个矩形盒子（40cm×34cm×40cm）内，先适应10min，然后使用红外摄像机记录10min内大鼠在黑暗中的自我梳理行为。自我梳理行为包括大鼠舔舐自己的身体和头发、用前爪擦脸、抓挠躯干等。 弹珠埋藏实验(marble-burying tests)：挖掘和掩埋是小鼠的一种典型行为，实验最初用于评估啮齿类动物的焦虑行为，但更偏向于其为测量重复性或强迫性挖掘行为的测试，并可以定量地检测 ASD 小鼠模型中重复刻板行为。实验前预处理和实验环境与三厢社交实验相同。实验时将新鲜无味的垫料加入到崭新的饲养笼中(30 cm×17 cm×16 cm)，深度为 5 cm，并将垫料压平压实；将标准玻璃弹珠(各种款式和颜色，直径约为2 cm，重量约为 5 g)，按 5 排每排 4 弹珠等距离地轻放在垫料上；打开摄像头，记录 30 min 内小鼠的运动情况。每次实验之间，更换鼠笼和垫料，并用温和的洗涤剂清洗弹珠，蒸馏水彻底冲洗，使用前晾干。 自发探索性活动和焦虑 测试装置由正方形上部为开放结构的自发运动箱组成，规格为50cm×50cm×50cm。使用小鼠行为学视频追踪分析软件将自发运动箱底部区域划分成9个等面积的正方形区域。将待测试小鼠移至测试房间适应1h。适应结束后将小鼠轻轻放入自发运动箱正中间，记录15min运动状态。分析不同小组间测试后15min中每隔5min的运动距离和不动时间的连续变化和后15min总运动距离和总不动时间的变化。 小鼠出生后 54d，将待测小鼠放入旷场箱中，适应性活动10 min。适应结束后，接下来 10 min 内，测其受测小鼠跨中央格数、跨周围格数、直立数、攀墙数、大便数和小便数。 高架十字迷宫实验箱体主要由两条开放臂( 28 cm ×5.8 cm) 和两条闭合臂(28 cm × 15.5 cm × 5.8 cm)组成，互相垂直呈“十”字交叉，它们交汇的地方为中央区( 5.8 cm × 5.8 cm) ，装置置于离地面 50 cm 处。实验开始后，将小鼠面朝开臂方向放入中央区，记录5 min 内小鼠的运动轨迹，观察其总进臂次数、开放臂内停留时间百分比和开放臂进入次数百分比。实验期间，保持安静，避免小鼠看到实验人员的活动。每只动物实验后用 75% 酒精彻底擦拭迷宫，以防止残留气味干扰之后的实验动物。 采用100ｃｍ×100ｃｍ×30ｃｍ立方体明暗穿梭实验箱， 箱体的一半为明箱、 另一半为黑色暗箱，配有黑色盖板。明箱与暗箱之间用一黑色的电门隔开，电门上有一上下活动的小门可以自动打开，实验时实验箱放置在实验柜内避光和隔音。实验持续5.5min，前0.5min为适应阶段，适应结束后中间小门自动打开开始正式实验。使用实时视频行为学分析系统记录大鼠穿梭明箱情况。 社交能力和兴趣偏好 （1）小鼠出生后 50 d，将待测小鼠从中间腔室轻轻放入三箱社交实验箱中适应性活动 10 min ，拿出待测小鼠。（2）社会交往实验阶段，测试小鼠的社会交往能力，在腔室1 金属圈内放置与受测小鼠不同窝的同品系同性别同龄的陌生小鼠 1，将受测小鼠从中间腔室放入，观察 10 min 内受测小鼠的活动情况，记录与陌生鼠1 的触嗅交互时间。（3）新事物偏好实验阶段，测试小鼠对新事物的偏好程度，将待测小鼠拿出，在腔室 2 空鼠笼放入与待测小鼠同龄同性别的陌生小鼠2，再次将受测小鼠从中间腔室放入，观察第二个 10min 内待测小鼠的活动情况，记录与陌生鼠1(这时视为熟悉小鼠) 和陌生鼠 2 的触嗅交互时间。 小鼠出生后 52 d，放入约 3 cm 厚的垫料于旷场实验箱中，将待测小鼠置于旷场箱适应性活动 10 min。取出受测小鼠，同时放入受测小鼠和与受测小鼠同品系同性别同龄的不同窝的互动陌生小鼠，记录接下来的10 min 内，互动小鼠与受测小鼠发生的社交行为及挖掘行为的时间。 正常情况下小鼠好奇心强并且乐于社交，但经过CSDS应激小鼠表现出明显的社交回避行为（Social Avoidance）。社交接触测试环境在一个50cm×50cm×50cm上部为开放箱型场地进行，场地一侧箱壁中间处紧贴着放置10cm×6.5cm×50cm小隔笼。小隔笼由透明有机玻璃制成，使受试小鼠能够与笼内陌生CD1小鼠进行视觉和嗅觉上的交流。小隔笼向外24cm×14cm的矩形设置为社交接触区。社交接触测试分为两个阶段，每个阶段2.5min。第一个阶段，即No target阶段，小隔笼内不放任何小鼠。受试小鼠放入测试箱内任其自用活动并记录。第二阶段，即Target阶段，将小鼠取出，清理遗留下的排泄物并使用75%酒精去除受试遗留下的气味，再将放有内陌生CD1小鼠的小隔笼放入箱中，接着再将该受试小鼠再次放入测试箱内记录。每只小鼠测试完后均清除箱中遗留排泄物并使用酒精去除受试遗留气味，防止对其它受试对象的影响。使用上海欣然公司提供的动物行为学视频分析系统，分析记录不同阶段下受试小鼠在社交区域逗留的时间。最后，计算每次受试小鼠的社交接触比（Social Interaction Ratio，SI ratio），公式如下：社交接触比（IS Ratio）=No target阶段社交接触时间/Target阶段社交接触时。慢性社交失败应激小鼠与陌生CD1小鼠社交接触时间会明显低于对照组与陌生CD1小鼠社交接触时间。因此，对于慢性社交失败应激小鼠来说社交接触比（IS ratio）小于1，而对照组小鼠的社交接触比（IS ratio）大于1。 评估攻击行为的实验范式，同一物种成员之间的社会冲突来产生情感和心理压力，让失败者产生社交挫败，失败者会有生理和行为变化。小鼠天生具有领地意识会攻击外来侵入者，研究人员发现统计实验中居住者的攻击性行为和非攻击性的社交行为可以模拟孤独症患者的暴力倾向和社交缺陷。 筑巢实验(nesting test)：群居小鼠通过筑巢来保温和防御，其筑巢能力与母性行为、家庭社交行为和繁殖等因素有关，具有社会交流的性质。2006 年Deacon 等在初级巢穴评级基础上(0：没有巢；1：平巢；2：巢盖住小鼠)制定了更加精细的 5 分巢穴评分表，广泛应用于小鼠社交行为检测。 超声波发声(ultrasonic vocalizations, USVs)：USVs 被小鼠用来传递情绪状态相关信息进行互动和交流，与小鼠社会行为密切相关。目前 3 种类型的 USVs 在实验室小鼠中得到了大量研究：幼崽隔离诱导产生的 USVs、青年小鼠社会交流产生的USVs 和成年小鼠社交互作产生的 USVs。Premoli等归纳描述了小鼠幼崽与母亲分离时发出的USVs 并认为其促进了母亲和子女之间的社会交流；发现 USVs 在青年小鼠中与社会互作和运动水平相关； 学习和记忆障碍 分别于干预前及干预第 7、14、21 天采用Morris水迷宫实验评价各组大鼠学习记忆能力，其分为定位航行实验和空间探索实验两部分。定位航行试验共 4 d，将平台置于NW象限，将受试大鼠头朝池壁分别从4个象限的同一入水点放入水池。如果大鼠在90 s 内找到平台，记录实际逃避潜伏期时间；如果在 90 s 内未找到平台，将其引上平台并停留 10 s，逃避潜伏期时间记录为 90 s。连续 4 d，以第4 天4个象限的平均值作为大鼠逃避潜伏期。空间探索试验共 1 d，定位航行试验结束后撤除原平台，将受试大鼠于SE象限入水点放入水中，观察并记录大鼠90 s内穿越原平台区域的次数。每次实验结束后，毛巾擦干及吹干大鼠后放入笼内。 相关情绪行为 该范式测试小鼠的绝望行为，实验装置为透明有机玻璃材质的圆柱形缸体，高30cm，直径15cm，缸内灌有深度为20cm的水，水温维持在24°C至26°C这一区间。摄像头位于缸体侧面，记录小鼠在水中的行为。使用专用的小鼠强迫游泳行为分析软件判断并记录小鼠在水中姿态并记录不动时间。测试开始前提前一个小时将小鼠经测试场地已适应环境。将小鼠放入水缸中记录6min。小鼠在水中漂浮，鼻尖微微露出水面，四肢舒展并微微滑动以保持身体平衡，此状态视为不动状态。测试结束后将小鼠转移至干燥温暖的环境中让其恢复体温。清理缸内小鼠排泄物并换上干净温水，再对下只小鼠进行测试。 在进行实验前3d，在每个笼子内放置1%或者2%的蔗糖水适应饲养（不同实验室所用比例不同）。1 d后，放置1瓶1%蔗糖水以及1瓶纯水24 h。在糖水适应以后，禁食或者禁食禁水24 h（不同实验室所用条件不同）。在每个笼子内放100 mL、1%蔗糖水以及100 mL纯水，1h交换位置防止产生偏好，2h以后，计算糖水偏好度。糖水偏好度=100%×糖水消耗的体积÷（糖水消耗的体积+纯水消耗的体积）。 运动相关能力 该测试检测了CSDS造模后小鼠运动协调能力是否受到损害。正式测试开始前每只小鼠训练3天，每只小鼠每天训练30min，转棒转速设置为15rpm。轻轻扶住小鼠尾巴，帮组其适应在转棒上行走，防止尾巴被机器绞伤。开始前1h将待测试对象放入实验房间适应。将小鼠放在滚动的转棒上，此时转速为4rpm。之后转棒在1min内加速至40rpm。如果小鼠在这1min加速期内掉落则排除出测试。测试过程总共5min，在此期间若小鼠从转棒上掉落，触发红外传感器，设备记录下小鼠在转棒上爬行时间。若小鼠在转棒上爬行超过5min，转棒速度降为4rpm。则小鼠爬行时间记为5min。每只小鼠测试4次，每只小鼠爬行时间取4次平均数。 轻轻捏住小鼠尾巴，将其放在抓力板上，让其前肢抓紧金属横杆，并且保持身体垂直于横杆方向。测定时以小鼠身体水平方向轻轻拉拽尾巴，此时抓力测试板在小鼠作用缓慢滑动。当拖拽力超过小鼠前肢最大抓力时，实验对象松开金属横杆，抓力板自动回弹至初始，此时机器将记录下小鼠的最大抓力。每只小鼠重复测试4次，取平均值。
Fig1 CSDS小鼠自发运动能力下降 （A）行为学流程图。（B）CSDS造模示意图。（C）社交接触测试。（D）强迫游泳测试。（E）自发运动测试连续时间点运动距离。（F）自发运动测试总运动距离。（G）自发运动测试连续时间点不动时间。（H）自发运动测试总不动时间。（I）NS组和CNO组运动轨迹图。对照组和CSDS组动物各10只  找实验方法，上脑声常谈 方法检索教程 |
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