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张树杰△，长春祈健生物制品有限公司 1.4实验动物 SPF级BALB/c小鼠,雌性,6只，6~8周龄,体质量18~20g,购自长春亿斯实验动物技术有限公司,动物合格证号为:SYXK(吉)2020-0015。本实验对小鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用,且按照实验动物伦理相关规定进行(文件号为:SOP/03·12·002)。小鼠在12h明/12h暗节律条件下饲养。 1.5 小鼠免疫及杂交瘤细胞株筛选 采用VZV全病毒抗原经皮下免疫BALB/c小鼠,50μg/只,间隔2周，进行第2次免疫,剂量及途径同上。融合前3d,经腹腔注射VZV全病毒抗原,进行加强免疫,100 μg/只。采用PEG融合法将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,采用HAT-RPMI1640完全培养基筛选融合细胞,每日观察融合细胞生长情况,培养7~10 d，对抗体阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆。经筛选，获得可稳定分泌抗VZV-gE抗体的杂交瘤细胞。 1.6 腹水制备及抗体纯化 经小鼠腹腔注射石蜡油，500μL/只,抑制小鼠免疫系统;1周后经腹腔接种杂交瘤细胞悬液,5x10°个/只,待小鼠腹腔明显肿胀,用无菌注射器收集腹水,间接ELISA法检测腹水抗体效价。用HiTrap™ Mabselect"SuRe和HiTrap" Desalting进行层析纯化,获得小鼠抗VZV-gE单克隆抗体。 1.7单克隆抗体的鉴定 经12%SDS-PAGE分析纯化后的小鼠抗VZV单克隆抗体纯度。VZV全病毒蛋白经12%SDS-PAGE分离后,转移至PVDF膜,用5%脱脂牛奶于23℃封闭1h;加入小鼠抗VZV单克隆抗体(1:5000稀释),于4~8℃作用过夜;用PBST洗涤3次,加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:10 000稀释),于23 ℃孵育1h;DAB显色,检测小鼠抗VZV单克隆抗体的特异性。采用小鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定小鼠抗VZV单克隆抗体的亚型。 1.8方法的建立 将小鼠单克隆抗体用包被稀释液(0.05 mol/L碳酸钠-碳酸氢钠,pH9.6)稀释后,加 入96孔板,100μL/孔,于2~8℃包被过夜;弃孔中液体,用5%BSA-PBS封闭液于37℃至少孵育1h; PBST洗涤4次,加入待测样品,100μL/孔,于37 ℃孵育1h;PBST洗涤4次,加入酶标抗体(用HRP标记试剂盒标记的小鼠单克隆抗体),100μL/孔,37 ℃至少孵育1h;PBST洗涤4次,加入TMB,100μL/孔，37℃孵育10 min;2 mol/LHSO溶液终止显色,用酶标仪检测A4500 1.9方法的优化 1.9.1抗体的确定采用表位叠加试验。 以1μg /mL的VZV全病毒抗原包被96孔板,于2~8℃包被过夜;分别加入1.7项筛选的任意两株不同的单克隆抗体(A1和A2)及这两株混合单克隆抗体[A(1+2)]，100μL/孔,于37 ℃孵育1h;PBST洗涤4次,加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:100稀释),于37℃作用1h;TMB显色,2mol/LH,SO溶液终止反应,用酶标仪测定单株及两株混合单克隆抗体的A450,并按下式计算叠加系数(A.I),A.I越大表明抗原位点重叠的可能性越小,因此,以A.I值最高的1对抗体最为最佳组合。A.I(%) = 2x [A(1 +2)孔 A4s0 / (A1 孔 A450 + A2 孔A450)-1]x100% 1.9.2抗体工作浓度的确定采用棋盘滴定法。 将1.9.1项确定的最佳捕获抗体用包被稀释液(0.05 mol/L碳酸钠-碳酸氢钠,pH9.6)稀释至0.25、 0.5、1、2.5和10μg/mL,酶标抗体用含2.5% BSA 的PBST按1:500、1:1000、1 : 2000、1:5000和1:10000稀释,检测gE抗原内部参考品(1:2~1:128稀释)，其他步骤同1.8项。以P/N最大的捕获抗体浓度和酶标抗体稀释倍数作为最佳工作浓度。 2.3.1 最佳抗体 表位叠加试验检测结果表明,mAb-11与 mAb-B2的A.I最高,为80%,见表1。因此,将其作为最佳配对抗体,其中以mAb-B2为捕获抗体，HRP标记的mAb-11为酶标抗体。  2.3.2抗体最佳工作浓度 当捕获抗体mAb-B2为2μg/mL,酶标抗体mAb-11-HRP稀释度为1:5 000时,P/N最大,见表2。因此确定筛选捕获抗体和酶标抗体的最佳工作浓度分别为2μg/mL和1:5000稀释。  |
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