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实验动物（试验设计）➱小鼠免疫及杂交瘤细胞株筛选 ➱腹水制备及抗体纯化➱抗体的鉴定➱ |
方法的建立➱表位叠加试验➱抗体工作浓度的确定采用棋盘滴定法➱ |
抗体工作浓度的确定➱例 |
捕获抗体2.0 μg/mL，1.0 μg/mL，0.5 μg/mL，每个稀释度重复两孔，100 μL/孔，4℃包被酶标反应板过夜 |
HRP标记二抗分别做1:50、1:100、1:200和1:400一系列倍比稀释 |
抗原包被浓度和二抗稀释度：阳性OD450nm值在1左右的，阳性OD450nm值和阴性OD450nm值之比（即P/N）最高 |
包被条件的确定：37℃包被2 h加4℃过夜；4℃过夜和37℃包被2 以P/N值最大且阳性OD450nm值接近于1.0 |
血清稀释度的确定：阳性血清和阴性血清作1:25、1:50、1:100、1:200和1:400连续几个稀释度稀释，阳性OD450nm 阴性OD450nm P/N |
封闭液及血清稀释液的确定：第一组用10％小牛血清进行封闭；
第二组：用10％马血清进行封闭；
第三组：用5％BSA进行封闭；
第四组：用10％BSA进行封闭；
第五组：用5％脱脂奶进行封闭。以P/N值最高者为最佳封闭液及血清稀释液。 |
封闭时间的确定：37℃ 30 min 37℃ 60 min 37℃ 90 min 37℃ 120 min 阳性OD450nm 阴性OD450nm P/N |
