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结果：
癌细胞、单核细胞和成纤维细胞在非复发和复发性MPE之间显示出明显的变化。该研究纳入了16名胸腔积液患者及其后续治疗的队列。为了发现表现为详细信息的细胞图谱，进行了胸腔穿刺术并收集了胸腔积液。首先收集了基线胸腔积液样本，然后进行3-6周的匹配治疗。进行CT扫描以确定复发情况。根据与基线水平相比的治疗反应，将样本分为非复发组（n = 8）和复发组（n = 8）。在基线样本上进行了单细胞RNA测序（图1A）。通过t-SNE可视化，细胞在非复发组和复发组之间显示出不同的分布（图1B-i）。随后，通过保守的细胞标记物对细胞进行了注释，并将其聚类为7个主要群体，包括癌细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、树突状细胞、T细胞和前B细胞（图1B-ii）。根据t-SNE推断的内部细胞特征，进一步将主要细胞群体分类为14个个体群集。C1、C5、C8和C12细胞簇是癌细胞簇，在复发性MPE中分布较多，与非复发组相比（图1B-iii）。在所有14个簇中，C1被注意到是复发细胞的明显比例，并且与其他簇相比拥有最多的细胞数量（图1C-i,ii）。C5、C8、C12在复发细胞中的比例和细胞数量不同。这四个癌细胞簇共同占据了所有簇中细胞的大部分，因此可能在复发性MPE中展示出主导功能（图1C-i,ii）。
为了进一步探索每个个体群体中表达的保守基因，作者确定了与每个聚类密切相关的基因（图2A）。其中，WAP四硫键核心蛋白2（WFDC2）、角蛋白18（KRT18）和EpCAM是C1聚类中表达上调最高的三个基因。这些基因与肿瘤的迁移和侵袭有关。这些特征表明C1聚类倾向于具有更高的转移性表型，并可能导致MPE的复发。作者使用主成分分析（PCA）进一步区分了四个癌细胞聚类。除了C12外，其他三个聚类基本上是分开的，重叠部分显示不完全收敛，并指示了它们的共同特征（图2B）。然后，比较并合并了保守基因集，以找出相似性和差异性（图2C）。重叠部分展示了共同的标记基因。KRT18和角蛋白8（KRT8）出现在C1、C5和C8中。WFDC2和EpCAM以及其他几个基因聚集在C1、C8和C12中。C1、C8和C12之间也存在重叠部分。C1拥有最大比例的复发细胞，建议在探索诊断标志物时应更加关注C1相关基因。
ELF3-CLDN4反馈环介导了与转移性肿瘤表型相关的阿米巴型细胞迁移。C1是表达多样的保守标记的癌细胞的异质子集，需要进一步精确分类。为了定义亚水平基因-细胞特征，C1进一步分为六个亚组。与上述结果一致，复发性MPE中这些细胞的数量显著高于非复发性MPE（图3A）。每个亚簇从C1派生的比例明确呈现，其中C2、C3、C4在复发性MPE组中占据明显的比例（图3B）。
假设反复出现的与MPE相关的CLDN4表达具有一致的特征，可能与基因突变状态无关，参与了缺氧诱导的血管生成如上所述，作者已经将CLDN4作为一种潜在的诊断标记物，用于表达在复发性MPE的癌细胞上。然而，驱动基因突变状态是否影响CLDN4的表达仍然不确定。因此，作者对没有驱动基因突变的样本进行了调查。细胞被重新聚类，最终得到了13个聚类，复发组中的聚类分布明显不同（图4A-i）。其中，C2、C5、C7、C8和C9被聚类为癌细胞亚群（图4A-ii）。在总共的13个聚类中，C2、C5和C8相对于其他聚类表现出了更高的复发细胞比例（图4B）。确定了与每个聚类密切相关的保守标记物，这与整个样本聚类一致。C2表达了与总C1相似的KRT18，C4表达了与总C5相同的Coiled-Coil Domain Containing 80 (CCDC80)（图4C）。这些结论支持了野生型和总MPE样本之间的转录组相似性。然后，作者验证了野生型样本中CLDN4的表达模式。CLDN4和ELF3的表达在所有聚类中得到验证，并且在癌细胞聚类C2、C5和C7中观察到它们的显著增加表达（图4D），表明总细胞中发现的类似表达状态。为了确定与野生型和总聚类C1中CLDN4相关的基因，作者发现与之相关的前两个基因TACSTD2和EpCAM是一致的（图4E）。先前有报道称TACSTD2和EpCAM与肿瘤的细胞粘附和转移有关，这暗示了它们对伴随CLDN4的复发性MPE的影响。这些结果表明，CLDN4、TACSTD2、EpCAM和ELF3是密切相关的基因标记，可能作为复发性MPE的潜在诊断标志物。在细胞百分比加权表达分析中，总聚类被分为非复发和复发组，并进一步分为突变和野生型组。尽管在非复发组的总癌细胞聚类C1和C8中表现出轻微的表达，但只有在总C1的复发细胞中才能观察到CLDN4的表达，以及ELF3、TACSTD2和EpCAM。所选CLDN4相关的四个基因在总C1簇中的表达模式与基因突变状态无关（图4F）。进一步的表达相关性分析发现CLDN4与血管内皮生长因子A（VEGFA）和缺氧诱导因子1亚单位α（HIF1A）呈正相关关系（图4G-i,ii），这两个因子都与血管生成和缺氧有关， 46 , 47 可能是促进MPE复发的机制理解。
低氧诱导的血管生成和MIF信号传导是MPE复发的潜在机制解释根据非复发组和复发组的样本，进行了入站和出站信号的细胞通信网络分析（图5A-i-iv）。在复发样本中，单核细胞聚类C2和C3主要接收到由成纤维细胞聚类C6发送的MIF信号，同时也接收到由癌细胞聚类C1发送的MIF通路信号（图5A-i,ii）。与此同时，C1通过VEGF通路直接向C6发送信号（图5A-i,ii）。而在非复发样本中，C1不再与C2、C3和C6参与VEGF和MIF信号传导，而C6通过MIF通路向C2和C3发送信号，C2则通过白细胞介素1（IL1）通路发送信号，这可能与抗肿瘤免疫和胸腔积液控制有关（图5A-iii,iv）。由于先前的数据显示，与非复发组相比，复发组中C2和C3单核细胞数量减少，C1在复发样本中与C2、C3和C6进行信号通信。MIF信号网络显示了C1与复发样本中其他聚类之间的深刻关联（图5B-i）。从以前的研究中，作者发现MIF会与CD44和CD74分子结合，并应用它们作为单核细胞抑制信号的功能。48 作者发现C2和C3与C6相比，在CD44和CD74的表达水平上有较高的表达水平（图5B-ii）。在这些聚类中，C6代表信号发送者和影响者，目标是C2和C3，它们也是接收者。C1通过介导信号参与信号传递。结果是，复发类别中的单核细胞数量受到抑制，它们的炎症抗肿瘤效应受到损害（图5B-iii）。
为了评估上述四个基因的表达与治疗反应之间的关联，作者检查了上海肺科医院64名诊断为晚期非小细胞肺癌并有胸腔积液样本的患者的基线情况。实时聚合酶链反应（PCR）的结果显示，与非复发组相比，CLDN4的表达在复发组中显著增加（p = 0.027）（图6A-i），而ELF3、EPCAM、TACSTD2在两组之间没有显著差异（图6A-ii、iii、iv），进一步支持CLDN4作为预测复发性胸腔积液的临床标志物的价值。同时，作者还通过对这些患者进行额外的生存分析，进一步探索CLDN4的预后价值。结果表明，CLDN4的高表达与整体生存率（OS）趋势较差相关，尽管没有明显差异（p = 0.21）（图6B-i）。然而，作者发现CLDN4的表达不能区分两组之间的无进展生存期（PFS）（图6B-ii），这可能是由于作者的样本量较小以及潜在的偏倚所致。为了进一步区分OS的生存差异，作者进行了包含基因表达信息和临床病理特征的Cox回归模型，以确定可能显著影响PFS的变量，这可能与CLDN4合作作为疾病控制的短期指标，并最终影响患者的长期结果。最终，成功建立了一个包含CLDN4、ELF3、治疗策略和疾病病理的模型，可用于显著区分OS（p = 0.001）（截断值 = 0.8）（图6C）。同时还展示了该队列的基线特征（图6D）。
总结 CLDN4 可以被视为晚期非小细胞肺癌患者中复发性胸腔积液的预测标志物。需要进一步验证其在样本量更大的队列中的临床价值，并进行深入的机制研究以了解其生物功能。
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