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导语

结果：

多组学共识预后相关的MUC分子亚型

该研究的工作流程如图1所示。在对所有数据进行有效预处理后，作者通过主成分分析（PCA）对处理批次效应前后的数据进行验证（图S1A和S1B）。作者独立地从10个多组学集成聚类算法中识别出三个亚型，并通过综合参考聚类预测指数、间隙统计分析、轮廓分数和以往的研究经验来确定亚型的数量（图S2和S3）。然后，通过共识集成方法进一步将聚类结果与转录组（mRNA、lncRNA和miRNA）、表观遗传甲基化和体细胞突变的分子模式相结合（图2A-2C）。作者的分类系统与总体生存率（OS）密切相关（p < 0.001；图2D）。值得注意的是，癌症亚型2（CS2）在所有评估的亚型中表现出最有利的生存结果。

MUC整合共识分子亚型的分区

目前，大多数MUC的分子亚型是根据分子表达水平进行分类的，可能与特定的生物功能有关。因此，作者还尝试探索这些CS的不同分子特征。单样本基因集富集分析（ssGSEA）算法测量样本中不同分子标志物的富集程度。有趣的是，作者发现在CS2中明显富集了如腺管分化和尿道上皮分化等途径，而在CS3中明显富集了如基底分化和免疫分化等途径，这表明CS2可能更容易倾向于目前认可的腺管样亚型，而CS3更倾向于基底样亚型。此外，不同亚型对特定治疗的反应也存在较大差异，如CS2中明显富集了免疫抑制的致癌途径，而CS3可能更有可能从放疗或靶向治疗等治疗中获益（图3A）。

CMLS的发展

作者对共识基因IMvigor 210队列（IMvigor）-MUC、癌症基因组图谱（TCGA）-MUC和META-MUC进行了单变量Cox回归分析，筛选出与OS显著相关的32个SPRGs的表达。随后，将SPRGs纳入集成框架进行CMLS。在IMvigor-MUC训练队列中，作者基于99种算法组合构建了一致的模型，并计算了所有队列中每个模型的平均C-index，以评估所有模型的预测能力（图4A）。如图4A所示，在99个模型中，由CoxBoost和逐步Cox（方向=前向）组成的算法保持了最高的平均C-index，用于构建最终模型。CoxBoost算法确定了最有价值的SPRGs，而逐步Cox算法则筛选出了最有价值的模型，该模型由12个中心基因构建（图4B和4C；表S2）。然后，作者计算了所有队列中每个样本的CMLS得分。在TCGA、META、IMvigor和综合队列中，高CMLS患者的临床结果较差（图4D-4G）。

MUC预后标志的比较

随着下一代测序技术的出现，近年来已经广泛报道了许多基于基因表达的预后标志物。为了能够全面比较CMLS和其他标志物之间的差异，作者对过去5年内发表的相关文献进行了系统搜索，并最终将22个不同的标志物纳入了作者的研究中（表S3）。这些特征与不同的生物过程相关，如免疫治疗反应、免疫浸润和糖酵解。值得注意的是，CMLS在TCGA-MUC、IMvigor-MUC和META-MUC数据集中的C-index表现优于几乎所有模型（图5A-5C）。考虑到CMLS的临床应用前景，作者通过独立预后分析筛选了MUC的潜在独立预后因子（图S9），并将它们整合到一个综合的诊断模型中，以Web计算器的形式呈现（https://the-nomogram./CMLS-DynNomapp/；图5D）。校准曲线证明了该诊断模型与实际情况一致（图5E）。决策曲线分析（DCA）表明，对于患者来说，诊断图的临床效益明显高于仅使用CMLS（图5F和图5G），而时间相关的C指数进一步证明了诊断图具有更好的预测性能（图5H）。

与CMLS相关的免疫特征

使用免疫肿瘤生物学研究（IOBR）R软件包，作者对MUC的肿瘤微环境（TME）进行了全面分析，并观察到免疫细胞浸润水平，包括T细胞、B细胞和巨噬细胞，在低CMLS患者中显著高于高CMLS患者，表明存在免疫激活状态（图6A）。这些发现表明，低CMLS水平的MUC更有可能被归类为“热性肿瘤”。成纤维细胞和中性粒细胞主要富集在高CMLS患者中，与免疫抑制和排斥相关的分子标志物，如EMT途径，也主要富集在高组中，显示出免疫抑制状态（图6B和6C）。这意味着高CMLS的MUC更倾向于是“冷性肿瘤”。正如作者预期的那样，先前报道的与免疫治疗效果更好相关的标志物也在低CMLS组中显著富集（图6D）。肿瘤突变负荷（TMB）和肿瘤新抗原负荷（TNB）是目前用于评估患者对免疫治疗反应的生物标志物，而曾等人。8 还提出了M1巨噬细胞在膀胱癌免疫治疗中的特殊作用。因此，作者分析了这些生物标志物在两组之间的差异。低CMLS组的TMB、TNB和M1巨噬细胞富集程度较高，这意味着低组可能具有更高的免疫原性（图6E-6H）。生存分析还表明，CMLS可以作为TMB、TNB和M1巨噬细胞的有效补充因子，用于区分患者的预后（图6I-6K）。低CMLS与较高的TMB或TNB或M1巨噬细胞浸润倾向于对MUC患者有更好的生存预后。

CMLS对免疫疗法反应具有出色的预测能力

为了全面评估CMLS在MUC免疫疗法中的作用，作者进行了系统分析。首先，作者对IMvigor-MUC队列进行了详细分析，考虑到该患者群体的全面预后和治疗相关信息。与许多先前的研究不同，作者通过比较两组在治疗3个月后的长期生存差异（p < 0.05；图7A和7B）以及在6个月和12个月时的受限平均生存（RMS），考虑了免疫疗法的延迟临床效应。较低的组显示出更好的预后结果，这表明免疫疗法的益处更大。不同反应程度的患者中CMLS的分布也显示出，反应组（完全缓解[CR]/部分缓解[PR]）的CMLS评分明显低于非反应组（进展性疾病[PD]/稳定疾病[SD]）（p < 0.05；图7C）。然后，作者计算了追踪肿瘤免疫表型（TIP），以探索与CMLS相关的潜在生物学机制，正如作者预期的那样，低CMLS组在主要的步骤4（肿瘤免疫细胞浸润招募）、步骤5（免疫细胞浸润）和步骤7（癌细胞杀伤）上显示出显著差异，与作者上述分析的结果一致（图7D）。此外，肿瘤免疫功能障碍和排斥（TIDE）算法被用来评估患者对免疫疗法的反应，并显示低CMLS组具有更好的响应性（P [Fisher's exact test] = 5.38e−06；图7E）。亚类映射算法在另一组接受免疫疗法的黑色素瘤患者中进行了实施，结果也显示低CMLS表明对PD-1疗法有更好的反应（Bonferroni校正p = 0.008；图7F）。最后，作者在多个免疫疗法验证队列中重新验证了作者的结论，并获得了预后信息。低CMLS在免疫疗法后人群中倾向于有更好的预后结果（GSE78220，p = 0.015 [图7G]；GSE135222，p = 0.026 [图7H]), 并且低CMLS倾向于与更好的免疫疗法结果相关（GSE91061，p = 0.032; 图7I）。

潜在治疗药物的筛选

高和低CMLS人群的预后存在显著差异，GSEA还显示高CMLS患者中血管生成、EMT、缺氧和其他途径显著激活（图8A）。鉴于高CMLS患者对免疫治疗的不良反应，作者使用癌症治疗反应门户网站（CTRP）和混合物中的相对抑制剖面（PRISM）筛选高CMLS患者的潜在治疗药物。为确保作者方法的稳健性，作者采用了顺铂作为验证算法得出的敏感性是否与临床实践一致的手段，顺铂是广泛应用于膀胱癌治疗的药物。先前的报告表明ERCC1是接受顺铂化疗的晚期膀胱癌患者的预后生物标志物。作者的算法得出了类似的结果，表明ERCC1表达水平低的患者对顺铂治疗有更强的反应，从而为患者的化疗带来潜在的益处（图8B）。然后，作者根据之前的研究系统地探索了高CMLS患者的潜在药物（图8C）。最后，作者筛选出了一个CTRP衍生的药物（达沙替尼；图8D）和两个PRISM衍生的药物（罗米地平和异喹啉；图8E）。然后，作者评估了肿瘤组织和正常组织中药物候选作用靶基因的表达水平的差异（包括配对和非配对分析）（图8F和8G）。较高的倍数变化表示药物候选治疗的潜力更大（达沙替尼：ABL1、FYN原癌基因、Src家族酪氨酸激酶[FYN]、KIT原癌基因、受体酪氨酸激酶[KIT]、STAT5B；罗米地平：HDAC1）。最后，作者在PubMed（https://www.ncbi.nlm./PubMed/）中寻找了候选化合物的证据。总体而言，达沙替尼和罗米地平被认为是治疗高CMLS患者的有希望的潜在药物。

总结

该研究通过多组学一致性聚类鉴定了 MUC 的三个分子亚型，揭示了它们之间在预后方面的显著差异，并可能对 MUC 的分子分型进行精细化改进。利用机器学习算法框架，作者定义了 CMLS，该方法在多个队列中表现出优越的性能，能够稳健地预测患者的预后，并与免疫治疗反应密切相关。鉴于高 CMLS 组中观察到的预后不良和免疫治疗反应低，作者进一步探索了达沙替尼和罗米地平对该人群的潜在治疗益处。通过整合多组学数据和尖端计算算法，该研究为 MUC 患者的早期诊断和精确治疗奠定了基础。