原文：A single-cell transcriptome atlas reveals the trajectory of early cell fate transition during callus induction in Arabidopsis关键词：愈伤诱导，细胞命运转变，发育轨迹，转录调控，多能性，单细胞转录组摘要：从体细胞获得多能性愈伤组织在植物发育研究和作物遗传改良中具有重要意义。这一发育过程包含了一系列细胞命运转变和重编程。然而，我们对愈伤组织诱导过程中细胞异质性和细胞命运转变机制的理解仍然十分有限。本研究报道了一项针对拟南芥根外植体的时间序列单细胞转录组实验，这些外植体在愈伤组织诱导培养基中培养了0天、1天和4天，并构建了愈伤组织诱导过程的详细单细胞转录图谱。我们确定了负责启动早期愈伤组织的细胞类型：lateral root primordium-initiating （LRPI）-like 细胞和 quiescent center (QC)-like 细胞。LRPI样细胞来源于木质部极中柱鞘细胞，与侧根原基相似，LRPI 细胞脱分化为 QC细胞。QC 细胞是在愈伤组织形成早期出现的未分化多能性获得细胞，在后期愈伤组织发育和器官再生中发挥关键作用。本研还还鉴定了调控 QC 细胞的转录因子以及与细胞命运决定相关的基因表达模式。总体而言，愈伤组织诱导细胞谱系转录组图谱为愈伤组织形成过程中的细胞命运转变提供了独特视角，显著提高了对愈伤组织形成的理解。在组织培养再生系统中，外植体在愈伤组织诱导培养基上形成愈伤组织是体细胞获得细胞全能性以及不定芽或根从头再生的关键步骤。然而，对于许多作物，愈伤组织诱导是遗传改良研究的瓶颈，因此探究植物愈伤组织形成的分子机制极为重要。 以往研究表明，CIM 诱导的愈伤组织发育与侧根形成相似，涉及木质部极中柱鞘（XPP）细胞的有序分裂和分化，XPP 细胞在诱导过程中获得与侧根原基或根分生组织相似的细胞身份，从而诱导相关调控因子表达。例如，ARF7 和 ARF19 被激活后促进 LBD16 等基因表达，这些基因对愈伤组织形成至关重要； WOX11 和 WOX12 的表达激活会促使再生细胞重编程为根原基细胞，进而驱动根干细胞调控基因表达，介导干细胞生态位模式诱导和根原基细胞分裂；根分生组织干细胞的其他调控因子如 PLT3 、PLT5 和 PLT7 在愈伤组织多能性获得过程中也被激活促进。但目前仍不清楚这些调控因子在细胞水平是如何组织的，从而最终决定多能愈伤组织的细胞命运。 此前已有研究对愈伤组织起始及细胞命运转变机制研究不足。本研究通过时间序列 scRNA - seq 构建根来源愈伤组织诱导早期的单细胞转录组图谱，识别关键细胞类型和调控因子，深入解析愈伤组织诱导过程中的细胞命运转变机制。 本研究以拟南芥 Col - 0 为实验材料，取根外植体置于愈伤组织诱导培养基（CIM）中分别培养 0、1 和 4 天（有明显突起）。接着从根外植体中制备原生质体用于 scRNA - seq（图1 A）。利用 DNBelab C4 系统进行 scRNA - seq，其中 CIM0 根外植体设置三个重复，CIM1 和 CIM4 根外植体设置两个重复。去除原生质体诱导的基因，最终得到用于下游分析的矩阵，CIM0 包含 6184 个细胞、CIM1 有 8777 个细胞、CIM4 有 10227 个细胞。进行数据归一化、缩放、转换、主成分分析（PCA）降维、细胞聚类以及 DEGs 分析。 对数据集进行聚类，获得了 26 个细胞簇，并对大多数簇的细胞身份进行了注释（图1 B）。由于愈伤组织细胞处于混合状态，还使用 AUCell 方法辅助鉴定。CIM0 细胞大多保持根细胞身份，如标记基因富集分析显示，部分细胞簇可注释为木质部、侧根柱状细胞、表皮等多种根细胞类型；CIM1 中出现具有干细胞和多能活性的细胞，主要为血管细胞，其特异性表达干细胞调节因子 BBM 和植物肽生长因子 PSK5 （图1 B-C）；CIM4 中鉴定出潜在多能细胞，9 号簇（LRPI - like 细胞）富集表达侧根原基起始（LRPI）基因且表达 QC 标记基因 WOX5，19 号簇（QC - like 细胞）富集表达 QC 标记基因 PI 以及再生相关标记基因，且 19 号簇的多能性得分最高（图1 E）。此外，分析了不同时间点细胞类型比例变化，发现随着诱导时间增加，细胞类型逐渐多样化。 检测到多种已知参与愈伤组织形成的基因在不同时间点的表达变化：伤口响应基因 WIND1/2/3 和生长素转运调控基因 PIN1、PIN2/3 在 CIM0 特异性富集；BBM、ARF5、LBD16、WOX5、KCS1 等调控干细胞特性和早期胚胎命运的基因在 CIM1 特异性富集；WOX5、PLT5/7、SHR、REV 等调控分生组织特性和生长素的基因在 CIM4 富集。CIM1 基因如 KCS1 在 LRPI - like 细胞中特异性表达，CIM4 基因如 SHR 和 REV 主要在 QC - like 细胞中表达。这些结果反映了 LRPI - like 和 QC - like 细胞在愈伤组织形成中的重要性，同时表明本研究构建的单细胞转录组图谱揭示了愈伤组织形成过程中的细胞异质性和细胞命运快速转变特征，有助于深入探索功能细胞类型和调控因子。2. LRPI - like 细胞是愈伤组织诱导过程中的过渡细胞类型 由于愈伤组织形成与侧根形成共享初始发育程序，本研究鉴定出一种与侧根起始相关的新细胞类型 - LRPI - like 细胞。通过 Monocle 3 进行伪时间分析构建细胞发育轨迹，发现 CIM0、CIM1 和 CIM4 的细胞类型分别位于发育过程的起始、中间和终止阶段，与外植体的时间序列一致（图2 A）。 在细胞类型层面，XPP 细胞是 CIM0 和 CIM1 细胞的连接点，这与先前报道 XPP 细胞是愈伤组织细胞前体的结果相符（图2 B）。LRPI - like 细胞在轨迹中跟随血管起始样（VI - like）细胞和柱状细胞样细胞（图2 B），表明其参与愈伤组织形成并作为中间细胞状态。LRPI - like 细胞还是 CIM1 和 CIM4 细胞的连接节点，有发育成 CIM4 中其他细胞类型的潜力（图2 A-B），其细胞命运身份的连接节点和分支表明其在愈伤组织诱导中具有重要过渡作用。 分析沿发育轨迹的基因表达模式，共揭示 17 个基因模块，其中模块 17 在 LRPI - like 细胞中特异性富集（图2 C-D）。对其中基因进行 GO 富集分析，发现其与角质层发育、脂质运输、脂肪酸衍生物代谢过程、蜡生物合成过程和超长链脂肪酸（VLCFA）代谢过程等相关（图2 E）。此前研究报道某些脂质分子可参与细胞信号传导调节细胞增殖和分化，本研究发现编码 3 - 酮酰基辅酶 A 合酶家族成员的 KCS6 和 KCS10 以及脂质转运蛋白 LTP1 和 LTP2 在 LRPI - like 细胞中显著表达（图2 F），进一步表明 LRPI - like 细胞在调节脂肪酸生物合成和运输过程中发挥特定作用，主要通过此介导愈伤组织诱导。图2 LRPI 样细胞是愈伤组织形成过程中的一种过渡细胞类型 3. LRPI - like 细胞可发育为具有更强多能性的 QC - like 细胞 LRPI-like 细胞有两个发育方向，其中一个是发育成表现出最大多能性的 QC-like 细胞（图 2A），因此深入研究该发育轨迹。从 CIM4 中分离出包括 LRPI - like、VI - like、维管原生木质部、表皮、QC - like 和再生细胞等多种细胞类型。利用 CytoTRACE 工具预测细胞分化能力，该工具通过检测转录多样性的降低来估计细胞分化能力。结果显示，QC - like 细胞分化程度最低，表皮细胞分化程度最高，LRPI - like 细胞位于两者之间，这与之前轨迹分析中 QC - like 细胞源于中度分化的 LRPI - like 细胞的去分化过程一致（图3 A-C）。表明 LRPI - like 细胞在细胞分化进程中处于向 QC - like 细胞转变的中间状态。 通过 Monocle 2 分析进一步验证 LRPI - like 细胞向 QC - like 细胞的发育轨迹（图3 D）。首先分离出再生细胞（簇 2）、VI - like 细胞（簇 6）、QC - like 细胞（簇 9）和 LRPI - like 细胞（簇 19），在使用 DDRTree 可视化轨迹后，利用 Monocle 2 重建其发育轨迹。结果表明，LRPI - like 细胞主要分布在伪时间轨迹的早期阶段，QC - like 细胞主要在晚期阶段，其他两种细胞类型主要分布在中间阶段，这与图 2A 中所示的发育轨迹一致。LRPI - like 细胞类型包含 CIM1 和 CIM4 两个样本，研究发现 CIM4 中的 LRPI - like 细胞有许多基因表达下调，这表明 LRPI - like 细胞在向 QC - like 细胞转变过程中经历了显著的转录组变化，为后期细胞命运转变做准备。Monocle 2 分析显示 LRPI - like 细胞的发育轨迹分为两个分支，一个分支包含 VI - like 细胞和再生细胞（指定为细胞命运 1），另一个分支在轨迹末端主要包含高比例的 QC - like 细胞（指定为细胞命运 2）（图3 D）。研究还发现，已知调节愈伤组织形成和芽再生的基因表达逐渐增加，并在轨迹终点显著富集，如 ARF5、XTH19/20、FAD - BD、PHB 和 MET1 等（图3 F）。为进一步验证重建的发育轨迹，使用 scTour 工具进行分析。scTour 能够精确预测潜在的细胞状态动态或新的独立数据集。预测结果显示，LRPI - like 细胞向 VI - like 和再生细胞方向发展，最终形成 QC - like 细胞，这与 Monocle 2 的结果一致（图3 E）。此外，从 CIM4 中去除 LRPI - like 细胞后，虽然在 LRPI - like 细胞和 VI - like 细胞之间出现发育间隙，但仍呈现出从 LRPI - like 细胞起始点向 QC - like 细胞终点的发育趋势。综上，LRPI - like 细胞去分化为 QC - like 细胞，且 QC - like 细胞具有更高的多能性。分析细胞命运 2 后期基因表达模式，探索了四个基因表达模块（图3 G）。其中模块 3 中的基因在细胞命运 2 的末端逐渐高表达，这些基因可能在调节 QC - like 细胞发育中发挥重要作用。对模块 3 中的基因进行功能分析，发现其与许多与有丝分裂细胞周期、生长素响应、生长素运输和细胞生长相关（图3 E-F）。例如，参与生长素响应和细胞分裂的代表性基因 TUA2 、 CKS2 和 IAA1，从再生细胞（簇 2）和 VI - like 细胞（簇 6）到 QC - like 细胞（簇 19）表达逐渐增加，这表明 QC - like 细胞具有丰富的生长素分布和运输活动，能够促进细胞生长和扩展。模块 3 中基因富集的 GO 术语与分生组织生长调节一致（图3 I），代表性基因 HSP90 - 7 参与分生组织调节，在细胞命运 2 终点的 QC - like 细胞中显著富集（图3 I），表明在伪时间轴后期 QC - like 细胞中多能性细胞比例较高。 EXPA1 和 EXPA4 的表达也随着细胞命运 2 的发展逐渐增加（图3 I），GO 分析表明其功能包括细胞壁生物合成，这与愈伤组织形成过程中的细胞壁重塑活动一致（图3 H）。此外，模块 3 中还富集了一些特定的 GO 术语，如 “对环戊烯酮的响应”、“DNA 构象变化” 和 “snoRNA 3' 端加工”，这些生物学过程涉及染色质结构和可及性调节、核糖体修饰和蛋白质合成等（图3 H），表明 QC - like 细胞在转录方面非常活跃，能够产生更丰富的转录本以满足新细胞壁和膜成分的高需求。综上，从 LRPI - like 细胞发育而来的 QC - like 细胞处于弱分化状态，具有增强的多能性和一系列转录活动，在调节愈伤组织发育中发挥重要作用，暗示其在后续愈伤组织发展中具有独特作用。图3 LRPI 样细胞可能发育成具有更强多能性的 QC 样细胞4. QC - like 细胞特化于愈伤组织诱导而非侧根发育 为探究细胞发育成愈伤组织而非侧根的决定因素，评估了 LRPI - like 和 QC - like 细胞中高表达基因在 4 天龄侧根（LRP）细胞和 6 天龄下胚轴来源愈伤组织细胞中的表达得分（图4 A-B）。结果显示，这两种细胞类型的 DEGs 在愈伤组织细胞中的得分更高，而 LRPI - like 细胞的 DEGs 在 LRP 细胞中的表达得分相对较高（图4 A-B）。表明愈伤组织形成和侧根发育在基因表达和细胞身份上存在显著差异，这些差异可能在决定细胞向愈伤组织细胞发育的方向上发挥重要作用。 （注*：ssGSEA 方法来评估 LRPI - like 和 QC - like 细胞中高表达基因在其他细胞类型（如 LRP 细胞和下胚轴愈伤组织细胞）中的表达得分，目的是比较这些基因在不同细胞环境中的表达模式差异，从而揭示细胞身份和发育命运的相关性。）结合已发表的 LRP 细胞和下胚轴愈伤组织细胞的单细胞组，划分亚群并注释细胞类型。对于 LRP 细胞，使用先前描述的方法将 282 个 LRP 细胞分为六个亚群，并注释为五种主要细胞类型，包括血管样细胞、QC 过渡细胞（QCTs）、内皮层 / QC 过渡细胞（End/QC - Ts）、侧翼细胞和原基细胞。同样，下胚轴愈伤组织细胞被分为七个亚群，注释为六种主要细胞类型，包括表皮样、外植体血管和愈伤组织创始人（EV & CF）、VI - like、QC - like、LRC - like 和分裂细胞。接着分析 QC - like 细胞去分化轨迹中的细胞与 LRP 细胞和下胚轴愈伤组织细胞亚群的相关性。在去分化轨迹的早期阶段，LRPI - like 细胞与 QCT - LRP 细胞的相关性最高，而位于轨迹终点的 QC - like 细胞与这些细胞的相关性最低（图4 C）。相反，对于下胚轴愈伤组织细胞，QC - like 细胞与 EV & CF 细胞（ - hypo）和 QC - like 细胞（ - hypo）具有显著相关性（图4 D）。这些结果表明 LRPI - like 和 QC - like 细胞在细胞身份上存在显著差异，同时也体现了这两种细胞类型在拟南芥中的新颖性。寻找在具有极显著相关性的细胞类型之间共表达的基因，以验证上述细胞身份。在 LRP 细胞中，已知参与调节侧根形成和发育的基因，如 LBD16、PLT4、MYB36 以及一些潜在的调控基因，如 AT1G70780、KIN2 和 AT4G36500 高度表达（图4 E）。在 QC - like 细胞的发育轨迹中，这些侧根身份基因在 LRPI - like 细胞中高度表达，但在 CIM4 愈伤组织的 QC - like 细胞中表达显著抑制且无法检测到（图4 F）。有趣的是，愈伤组织身份基因在 QC - like 细胞中被显著诱导，特别是参与调节愈伤组织细胞多能性获得的基因，如干细胞调节因子 SCZ 在 EV & CF 细胞和 CIM6 下胚轴愈伤组织的 QC - like 细胞中高度表达，并且在 CIM4 愈伤组织的 QC - like 细胞中也显著富集（图4 G-H）。综上,LRPI - like 细胞到 QC - like 细胞的细胞命运转变过程中，侧根身份逐渐减弱，而多能性身份在 QC - like 细胞中逐渐诱导和富集。QC - like 细胞的发育过程可能特定于愈伤组织形成，这一过程应有助于愈伤组织的形成而非侧根的发育。图4 QC - like 细胞特化于愈伤组织诱导而非侧根发育5. 特异转录因子调控网络的激活是 QC-like 细胞再生能力的基础 鉴于 QC - like 细胞在愈伤组织发育中的关键作用，利用 pySCENIC 进行转录因子调控网络（TFRN）分析，旨在鉴定调控 QC - like 细胞形成的关键转录因子（TFs）及其潜在调控的靶基因。 对 QC - like 细胞的所有基因表达数据进行分析，共鉴定出 16 个新的 TFs 和 106 个潜在调控的靶基因，进而构建了 QC - like 细胞的 TFRN（图5 A）。在这个调控网络中，包含了一些已知参与愈伤组织形成和芽再生调控的基因，如 WOX13（WOX 家族成员，促进组织修复）、CYCLIN D3;3（调节细胞群体增殖）以及 PHB 和 REV（在芽再生中起关键调控作用）等，这些靶基因在 LRPI - like 细胞向 QC - like 细胞的发育轨迹中，在 QC - like 细胞中特异性富集（图5 B）。表明它们可能在 QC - like 细胞的发育过程中发挥重要作用。 进一步研究发现，TCP23、GBF4 和 RTV1 是负责调控这些基因的关键转录因子，表明它们及其靶基因可能参与调节 QC - like 细胞的发育过程。研究人员先前分析了在 QC - like 细胞形成过程中显著增加表达的模块 3 中的基因（图3 F -G），并对这些可能对愈伤组织形成起关键作用的基因进行了深入探究，通过在模块 3 和 TFRN 中进行交集分析，发现了 20 个这样的基因（图5 A）。GO 分析表明，这些基因的功能主要集中在细胞壁生物合成、微管相关过程和分生组织发育等方面。例如，TUA4 参与微管调节，XTH4 和 DWF1 参与生长素响应和细胞壁生物合成，EXL3、RTFL8 和 AT1G67120 参与分生组织发育和细胞增殖调控（图5 C）。所有这些基因在伪时间轨迹的后期阶段在 QC - like 细胞中富集。根据构建的 TFRN，TCP23、RTV1 和 bHLH104 是模块 3 中这些靶基因的主要上游调控因子，这意味着这些基因可能在调节 QC - like 细胞的发育过程中发挥重要作用，进一步对这些基因进行功能分析将有助于揭示细胞命运转变的决定机制。图5 特异转录因子调控网络的激活是 QC-like 细胞再生能力的基础本研究 Discussion 部分主要讨论了以下内容： 本研究通过时间序列 scRNA - seq 生成了愈伤组织形成的单细胞转录组图谱，揭示了细胞异质性和早期细胞命运转变过程，包括多种细胞类型及其动态变化，补充了对愈伤组织形成机制的理解。成功鉴定出 LRPI - like 和 QC - like 两种新的多能愈伤组织细胞群体，构建了 XPP 细胞向 LRPI - like 细胞再向 QC - like 细胞的发育轨迹，与先前研究结果相符，证实了轨迹的可靠性。 在细胞命运转变过程中，LRPI - like 细胞具有独特基因表达特征，如涉及角质层发育、脂质运输和超长链脂肪酸（VLCFA）代谢等，其中脂质转运蛋白基因富集提示其可能通过调节脂质运输活动调控细胞命运转变，因为脂质分子可参与细胞信号传导调节细胞增殖分化，VLCFAs 是限制细胞全能性和再生能力的重要信号分子。LRPI - like 细胞向 QC - like 细胞转变过程中表达逐渐增加的基因，其富集的生物学过程可调节茉莉酸（JA）信号通路影响细胞分化状态。此外，QC - like 细胞中存在独特的 TFRN，其靶基因参与生长素运输、细胞增殖分化和分生组织起始等 QC - like 细胞功能，进一步研究这些关键调控因子有助于理解细胞命运决定机制。 比较拟南芥根愈伤组织和下胚轴愈伤组织，发现不同外植体来源的愈伤组织细胞存在强相关性，QC - like 细胞与下胚轴愈伤组织中的特定细胞共享调控因子，表明愈伤组织形成机制在不同组织中具有一定保守性。 空间转录组研究将有助于构建更详细的时空细胞类型图谱，更好地理解细胞间相互作用和愈伤组织诱导机制（图 6）。 图6 愈伤组织诱导过程中早期细胞命运转变模型 本研究旨在深入解析拟南芥愈伤组织诱导过程中的细胞命运转变机制，以揭示其在植物发育研究和作物遗传改良中的作用。取拟南芥根外植体进行愈伤诱导，制备原生质体并开展单细胞 RNA 测序。接着对数据进行处理，包括过滤、降维、聚类和差异表达基因鉴定等操作，依据根细胞类型标记基因及相关方法注释细胞类型，构建单细胞转录组图谱，明确细胞类型组成及相关基因表达变化。然后通过伪时间分析、相关性分析等多种手段，聚焦 LRPI - like 和 QC - like 细胞研究其在愈伤组织诱导中的角色，包括发育轨迹、分化状态、基因表达特征及功能，以及与侧根发育的差异；最后构建 QC - like 细胞转录因子调控网络分析关键调控因子，从而系统地解析愈伤组织诱导早期细胞命运转变机制，为植物再生研究提供理论依据。 通讯作者： Xun Xu (xuxun@genomics.cn), Keke Xia (xiakeke@genomics.cn)Ruilian Yin, Ruiying Chen 作者单位： 1. College of Life Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 10049, China. 2. BGI Research, Beijing 102601, China. 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Genome Read and Write, BGI-Shenzhen, Shenzhen 518120, Guangdong, China.
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