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1、鸭疫里默氏杆菌的研究进展 鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）引起的一种急性或慢性、败血性传染病，又称鸭传染性浆膜炎（Infectious serositis）。该病主要感染雏鸭、鹅、火鸡、鹌鹑及其他禽类，2~3 周龄的雏鸭最易感，患病鸭主要临床特征表现为下痢、共济失调、眼鼻有分泌物、头颈震颤等，主要病理特征为气囊炎、肝周炎和纤维素性心包炎，并伴有干酪性输卵管炎、关节炎和脑膜炎等。截至目前，至少已鉴定出21 种血清型的RA，但由于各血清型之间的交叉保护较弱，给该病的防控带来了巨大挑战，也给世界养鸭业造成了重大经济损失，影响畜牧业的发展（Liu et al.，2013；Liu et al.，2012）。 1.1病原学 鸭疫里默氏杆菌，其菌体多为杆状，为黄杆菌科革兰氏阴性小杆菌，显微镜下观察有夹膜，无芽孢，且不能运动，革兰氏染色可见两极浓染，菌体多单个存在，偶见链状排列。RA 对生长条件的要求十分严格，在营养丰富的培养基上长势良好，如：5 %绵羊血培养基、巧克力培养基、胰蛋白大豆酶琼脂培养基（TSA），增菌时一般在含有5 %小牛血清的胰蛋白酶大豆琼脂肉汤（TSB）中培养。在普通琼脂培养基和麦康凯培养基上不能生长。该菌在病鸭脑部分离率较高，在肝脏、脾脏中的分离率较低（郭予强，1983）。初次分离可以将病鸭的肝、脑组织无菌挑取后接种于5%的绵羊血平板或者胰蛋白胨大都肉汤培养基（TSA）上。在37℃，厌氧培养温箱中培养24 h后，可见乳白色、略透明、椭圆形，有稍隆起、反光的菌落，菌落直径在0.8 mm~1.4 mm，挑取单个菌落置于含有5%小牛血清的胰蛋白酶大豆琼脂肉汤培养基中，在200 rpm/min, 37℃的摇床上培养24 h 可以达到稳定增菌。RA 对理化因素抵抗力较弱，在-20℃以下可冻干保存且保存时间较长；在4℃条件下可保存3 周，且毒力降低；在室温下仅可存活1 周；而在55℃作用16 h后便可全部失活（邓治邦等，2004）。另外，在培养基中添加少量硫胺素可促进RA 生长，而添加少量的吡啶胺素和氨丙啉可抑制RA 的生长（杨宗维等，2006）。生化实验中，大多数菌株可以使明胶液化、不产生吲哚和硫化氢（杨余山，2005），一般不发酵葡萄糖等碳水化合物，但相关文献中显示少数RA 可以发酵海藻糖，麦芽糖及甘露糖（Salih，2014；Hinz et al.，1998）。 1.2血清型 RA 的血清型是由荚膜类型所决定的，分型方法常见的有平板凝集试验、琼脂扩散试验和试管凝集试验（程安春等，2003）。目前世界公认的RA 共有21个血清型，该分型方法由Harry 在1969 年通过平板凝集试验首次确立16 种RA的血清型（Harry，1969），后来通过Bisgaard，Sandhu，Loh 和Pathanasophon等人的修正和不断完善逐渐形成了RA 今天的血清分型方法（Bisgaard et al.，1982；Sandhu et al.，1991；Loh et al.，1992；Pathanasophon et al.，1995）。RA 血清型众多，由于血清型不同导致RA 菌体的抗原结构存在差异，到目前为止没有观察到各个血清型之间存在交叉免疫保护反应，并且同一地区不同时间流行菌株的血清型可能发生改变，甚至同一养殖场同一时间会有多个血清型的RA 混合感染，因此用疫苗防控该病的效果并不理想，阻碍了该病的防控（Magyar et al.，2019）。该菌在我国由郭玉璞等人于1982 年在对北京地区3 个鸭场传染性浆膜炎的研究中首先被报道，且菌株血清型为血清1 型（郭玉璞等，1982）。随后该菌在全国各地陆陆续续被报道，张大丙等人于1999 年证明了我国存在血清1、2、6、10、11、13、14 型共7 种血清型的RA（张大丙等，1999），此后程安春等对1994~2000年间全国范围内的1842 株RA 分离株进行研究发现我国流行的RA 有1、2、3、4、5、7、8、10、11、13 和14 型，其中优势血清型为1 型和2 型（程安春等，1999）。近年来，不同血清型的RA 在全国范围内都有报道，冯金牛等在广东、广西、福建地区发现了血清9 型RA（冯金牛等，2010），程龙飞等对2006～2012年北京市、上海市、山东省、江苏省、江西省、浙江省、福建省、广东省、广西省、海南省等地423 株血清型进行了调查发现最为流行的RA 为血清1 型、2 型、11 型和17 型，4 种血清型的RA 合计占所有菌株数量的86.4 %（程龙飞等，2013）。刘小龙等在鹅中检测到了血清11 型（刘小龙等，2017），吴征卓等报道了贵州地区存在血清6、11 型（吴征卓等，2021）。在其他国家同样报道了多种血清型RA 的流行，在丹麦的一项研究中RA 的分离率可达90 %，且多为血清4 型菌株（Ryll et al.，2001）。Magyar 等人在匈牙利部分地区的鹅中分离到139 株RA，从鸭中分离到28 株，其中血清型1 是最流行的血清型，占总菌株的64.5 %（Magyaret al.，2019）；在越南，Vo TT 等人在408 只有典型败血症的鸭中分离到69 株RA，分离率为16.9 %，其中血清10 型占大多数，为31.9 %（Vo TT et al.，2022）。 1.3耐药性 抗生素治疗作为细菌病感染后普遍的治疗方法，已经经过了几个世纪的发展，并且早在20 世纪50 年代抗生素作为饲料添加剂已在畜牧业中进行使用，但由于抗生素的广泛使用和滥用对人类和动物造成的危害在逐年增加，尤其是因抗生素滥用造成的细菌耐药性正在严重危害人类及动物健康（刘秀玲等，2012）。随着细菌的耐药性的逐年增加，导致了更高的治疗成本和死亡率，细菌耐药性已经演变成为一种全球性健康威胁（Zhang et al.，2022）。在畜牧业中滥用抗生素，导致了用单一抗菌药物治疗家禽感染已变得更加困难。增加了动物病原菌的耐药性通过食源性病原体传播给人类的风险。近年来，因抗生素的不当使用造成的RA耐药性日趋严重（Shousha et al.，2021）。Zhong 等人对1998~2005 年间224 株RA 进行药敏试验发现，分离菌株对29 种抗生素产生了不同程度的耐药性，其中对阿曲南、头孢吡肟、奥沙西林、青霉素G、头孢他啶和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐药性水平较高（Zhong et al.，2009），Sun 等人对在从中国南方地区分离到的103 株RA 对23 种抗生素的耐药性试验中发现分离菌株的链霉素、卡那霉素、庆大霉素、阿布拉霉素、阿米卡星、新霉素、萘啶酸和磺胺脒最小抑菌浓度（MIC）值都很高（32~128 mg/mL）（Sun et al.，2012），2017 年，Gyuris 等测定了2000~2014 年在匈牙利于临床分离的185 株RA 分离株对13 种抗生素的耐药性，结果显示，RA 分离株对四环素，红霉素和链霉素耐药率极高，分别为91.4 %，75.1 %和71.4 %（Gyuris et al.，2017）。 1.4致病性 影响RA 的致病力和致病机理的因素有很多，已知对RA 毒力有影响的主要因素有：铁离子（Wang et al.，2017）、TonB、Dps、Fur（Liao et al.，2015）、荚膜合成基因（刘马峰等，2019）、外膜蛋白A（OmpA）（Hu et al.，2011）、脂多糖（LPS）（Wang et al.，2014）、IX 型分泌系统组分（Guo et al.，2017a）和烯醇化酶（Enolase）（邹荣华等，2022）等。铁在细菌的抗氧化过程、呼吸过程和DNA 合成等方面起到非常重要的作用，是很多细菌赖以生存的重要营养物质（Liu et al.，2021；Andrews et al.，2003）。在之前的研究中，研究人员发现TonB1 和TonB2 参与了铁离子的摄取（Liu et al.，2016），Zhang 等人的研究中发现，TonBA 和TonBB 缺失株的铁离子摄取率降低，并且TonBB 缺失株比TonBA 缺失株抑制铁离子的摄取的能力更强（Zhang et al.，2021）。Fur 调节因子在细菌的铁离子获取和代谢环节中发挥着重要的作用，该因子可以和Fe2 结合形成二聚体（Fur-Fe2 ）的形式来参与细菌的铁离子代谢（杨宇豪等，2022）。该因子编码基因被缺失后，可以使铁转运相关的因子的基因表达大幅度上调（Guo et al.，2016b）。此外，细菌可以通过表达更多的铁结合蛋白如：Dps 来获得更多的铁元素，该蛋白可以在RA 生长的稳定期，保护细菌DNA 免收H2O2 的损伤（Tian et al.，2020）。IX 型分泌系统（T9SS）是RA 的蛋白质分泌系统，该系统可以分泌多数蛋白参与RA 制病过程。其中sprT 编码T9SS 的一个核心蛋白，Guo 等人通过缺失sprT 基因构建了RA 突变株，该突变株的毒力比野生型RA-YM 降低了42,000 倍。表明T9SS 通过输出关键蛋白来促进RA 的毒力。构建的sprT 基因缺失株可以作为制作弱毒疫苗的候选株（Guo etal.，2017a）。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是组成革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分之一，该物质又称为内毒素。主要由核心多糖、类脂A 以及特异性多糖组成，在细菌的耐药性、抵抗吞噬等作用中起到了很大的作用（张雪梅等，2019）。Zuo 等人制作的RA 脂多糖合成基因缺失株对鸭血清的抵抗能力下降，并且毒力下。用该菌株制作的弱毒苗对多种血清型的RA 产生了保护作用（Zou et al.，2015）。许多细菌种类能产生一层覆盖在细菌细胞壁表面的松散粘液物质称为荚膜多糖（CPSs）（Boulnois et al.，1989）。荚膜多糖作为一种保护屏障，具有多种功能，包括对吞噬作用的抵抗（Willis et al.，2013），抑制补体介导的杀伤（Hartet al.，2016），掩盖表面抗原（Hirose et al.，1997），诱导炎症反应（Tzianaboset al.，2001），参与细菌对抗生素的耐药性的产生（Spinosa et al.，2007）。因此，CPS 被认为是细菌重要的毒力决定因素，并在细菌的致病机制中起着至关重要的作用。目前纯化的CPSs 已被广泛用作疫苗，并已被证明在控制流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等菌株的流行中起到了很好的作用（Hu et al.，2017）。同样，Yi 等人构建了RA CH-1 株wza 荚膜合成基因缺失的菌株，证明了该菌株对外界环境的抵抗力进一步降低，且毒力也有大幅度降低，证明了荚膜多糖确实与RA菌株的毒力有着很大关系（Yi et al.，2017）。外膜蛋白A（OmpA）在大肠杆菌中研究最广泛，它在维持细菌细胞膜的结构完整性（Sonntag et al.，1978）、细菌接合过程（Schweizer et al.，1977)、细菌粘附和侵袭（Torres et al.，2003）等过程中起到重要的作用。研究人员对RA Th4菌株的OmpA 基因进行了突变，验证了Th4 OmpA 突变体在侵袭Vero 细胞过程中粘附性降低。而在动物实验中，通过对该突变菌株LD50 的毒力评价实验中，其毒力减弱了22 倍以上，并且感染Th4 OmpA 突变菌株的雏鸭的血液中细菌浓度明显低于感染Th4 菌株的雏鸭。从而确定了OmpA 是RA 感染过程中作为一个重要的毒力因子（Hu et al.，2011）。余波等人，构建了表达RA OmpA 的重组质粒，通过体外表达验证该质粒可在DF-1 细胞中稳定表达OmpA，并用该质粒免疫10 日龄雏鸭，结果显示免疫组雏鸭可以产生很好的保护力（余波等，2021）。雷云构建了RA 的pcDNA3.1-OmpA 真核表达质粒，证实了该质粒产生的OmpA能够使雏鸭的抗体效价明显升高，对血清1、2 型菌株都能起到较好的保护作用（雷云，2017）。烯醇化酶（Enolase）是一种存在于细菌细胞质和细胞壁中的关键糖酵解酶，大小约为45 kDa。烯醇化酶存在于链球菌和各种血清型中，并具有与纤溶酶原结合的能力，同时，该酶也是链球菌突破宿主血脑屏障的关键毒力因子（Liu et al.，2017；Xia et al.，2019）。金黄色葡萄球菌的烯醇化酶位于细菌的表面，可以与宿主细胞表面的黏连蛋白相互作用，参与细菌感染和侵袭宿主的过程（Carneiro etal.，2004）。关于烯醇化酶是否在RA 突破血脑屏障的过程中起作用，邹荣华等人对此进行了验证，通过对构建的烯醇化酶缺失菌株与亲本菌株进行动物实验比较，发现烯醇化酶缺失菌株和亲本菌株在雏鸭血液中的含量没有差异，说明烯醇化酶不影响RA 在雏鸭血液中的增殖，但烯醇化酶缺失菌株相比于亲本菌株在雏鸭大脑中的含量明显降低，并且感染烯醇化酶缺失菌株菌株的雏鸭，神经症状较轻，这提示了烯醇化酶在RA 突破血脑屏障的过程中起到了重要作用（邹荣华等，2022）。 1.4流行病学 RA 可感染番鸭、樱桃谷鸭、北京鸭、鹅、野鸭、火鸡、鹌鹑和鸽等，且对番鸭、樱桃谷鸭、北京鸭、鹅的危害性最大（马基寿，2013；樊厚江，2020）。常通过直接接触转播、消化道传播，同时也能经被污染的饮水，饲料，容器、垫料等环境因素传播，此外经受伤的皮肤黏膜、蚊子等吸血昆虫也可传播本病。最为主要的传染源是隐性带毒鸭和患病鸭，其可以不断向外界环境排出细菌。该病每个年龄段的鸭子均可感染，但3~8 周龄的雏鸭最易感且死亡率最高，而成年鸭感染后一般呈现隐性感染或感染后症状不明显（孔桂慧等，2020）。感染类型可根据患病鸭病程长短及死亡率可分为四个类型，即：最急性型、急性型、亚急性型和慢性型。最急性型病例一般表现为无任何症状突然死亡，剖检症状不明显；急性型病例主要变现为精神沉郁、食欲下降、卧地不起，眼、鼻有大量粘液，排黄绿色稀粪，细菌突破血脑屏障引起脑膜炎是可见角弓反张呈“观星状”，四肢震颤，最终抽搐而死。急性发病一般为2~3 天，多为2~8 周龄的雏鸭。亚急性和慢性型病例主要发病于日龄较大的鸭，主要表现为精神沉郁、站立不稳、垂头缩颈、食欲不振，有的病鸭可见口鼻有大量粘液，呼吸困难有喘鸣音，最后因营养不良而死，病程一般为1 周左右（张燕，2022）。RA 感染后死亡的病鸭剖检可见典型的纤维素性肝周炎，纤维素性心包炎，纤维素性气囊炎，脾脏肿大出血，关节肿大及输卵管炎。因其典型病变是在心脏、肝脏、气囊表面有大量纤维素性渗出，形成明显的纤维素膜所以称其为鸭传染性浆膜炎。急性及亚急性病例常见：心肌、心外膜有大小不一出血点，心包积液，心外膜表面有大量渗出物而形成纤维素假膜，肝呈深黄色、红色，碰之易出血，极易碎裂，肝表面被附有一层黄白的纤维素性假膜；脾脏呈斑驳状，可见有轻度的渗出，表面有易剥离的灰白色或灰黄色纤维素膜；气囊表面附有一层黄白色纤维素膜；产蛋鸭输卵管内有黄白色干酪样物质；脑膜充血、出血，大脑水肿。该病一年四季均可发病特别是在温度较低、天气变化、阴雨天及季节交替时多发。另外，饲养密度大，禽舍通风不良，环境脏乱差等因素也是导致该病发生的一个重要原因。 1.5 鸭疫里默氏杆菌的诊断与防治 RA 感染的初步诊断一般是根据患病动物的临床症状及剖检变化，主要是根据剖检过程中是否发现纤维素性肝周炎、纤维素性心包炎、纤维素气囊炎等明显的示病症状来诊断的（Flores et al.，2019）。但临床实践中发现，不只是鸭疫里默氏杆菌会造成上述病变，大肠杆菌、沙门氏菌也会造成上述病变。所以，仅靠临床症状及剖检变化来诊断该病并不准确，需要实验室诊断才能进行确诊。实验室诊断的主要方法为：平板凝集试验、琼脂扩散实验、细菌形态观察、PCR、ERIC-PCR、酶联免疫吸附试验和胶体金试纸条检测。 1.5.1 平板凝集试验与琼脂扩散实验 平板凝集试验可以用来测定RA 的血清型，原理是通过细菌的菌体蛋白与血清中的抗体发生抗原抗体特异性反应，从而形成抗原抗体结合物，肉眼在琼脂平板上观查到抗原抗体沉淀线或在透明的背景上可见有白色颗粒样物质，本方法为国内外公认的对RA 进行血清分型的方法（杨瑞锋，2012）。 1.5.2 细菌学鉴定 RA 可以在感染禽类的大脑、肝脏和渗出的纤维素物质中分离出来，在无菌条件下用挑菌环挑取少量组织在鲜血平板上进行密集划线，在37℃，厌氧环境中培养24~48 h 后可在鲜血平板表面见到乳白色、露珠样小菌落，单菌落经鉴定培养基鉴定后即可确定细菌类型。另外，也可以通过细菌质谱仪对细菌单菌落进行鉴定。 1.6 鸭疫里默氏杆菌疫苗的研究进展 1.6.1 灭活疫苗 灭活苗是通过甲醛等灭活剂将细菌灭活，菌体蛋白可作为抗原刺激宿主机体产生免疫反应，但不会引起宿主出现感染症状的一类疫苗。一般灭活苗会添加相应佐剂，已达到使疫苗缓慢释放延长机体免疫时间的效果。王小兰研制的RA 血清1、2、10 型油乳剂灭活苗，一次免疫后可产生较好的保护率，二次免疫后保护率能达到100 %（王小兰，2012），程龙飞等人制作的RA 血清2、11 型油乳剂灭活苗对雏鸭的保护率最高可达90 %，并且抗体可以持续2 个月以上（程龙飞等，2016），而王正中制作的RA 血清2、11 型二价油乳剂灭活苗颈部皮下免疫一次后保护率可达80 %，同时对比了油乳剂、水佐剂以及铝胶佐剂灭活苗的免疫效果，结果证明了三种佐剂的疫苗在刺激机体产生抗体速度方面相差不大，但在维持抗体水平方面油乳剂灭活苗更胜一筹，且使用油乳剂灭活苗免疫的鸭子攻毒后死亡率最低，证实了油乳剂灭活苗相对于其他佐剂的灭活苗更加有效（王正中，2019）。灭活疫苗的优点是可以产生持续且效价高的抗体，对免疫后的机体起到持久的保护作用，但需要进行两次甚至更多次的免疫接种以保持疫苗的效力，也存在因其吸收较缓慢会对与疫苗接种部位会产生不同程度的损害，对动物应激较大等缺点。因此近年来越来越多的灭活疫苗佐剂正在被研究和评估，如：蜂胶佐剂、黄芪多糖等（马逊，2010；陈洁等，2010）可以改善机体对RA 的免疫力。 1.6.2 弱毒疫苗 在对于细菌病的预防中弱毒活疫苗凭借着简便易操作、成本低、对动物应激小等优点一直被用于养殖一线，弱毒菌株一般可以通过人工敲除致病基因和临床分离等方法来获得，Liu 等人通过缺失RA-CH-1 株的B739_1343 基因后，发现敲除后的菌株的毒力下降了104 倍。将基因敲除毒株制备为弱毒疫苗后对雏鸭进行免疫，能够提供83 % 的保护率（Liu et al.，2018）。李林林等人采用高通量RNA-Seq 技术对含有铁元素不同的环境中的RA-GD 株进行转录组学分析，筛选出了富铁环境和限铁环境中的RA-GD 株差异表达的RIA_0940 基因，并对该基因进行了缺失，试验结果显示RIA_0940 基因缺失株与亲本毒株相比半数致死量（LD50）下降了114 倍，且组织载菌量明显下降，证明了RIA_0940 基因缺失株的毒力明显下降，可以作为弱毒苗候选株进行研究（李林林等，2022）。 1.6.3 亚单位疫苗 通过DNA 重组技术能够设计出表达特定蛋白的基因，可以在体外表达出保护性蛋白和表位从而制作出亚单位疫苗。研究显示，RA 的外膜蛋白A（OmpA）具有较强的免疫原性（Subramaniam et al.，2000）。Hu 等人在2012 年对血清2型RA 的菌体蛋白进行进行了研究，鉴定出34 个免疫蛋白，包括OmpA、GroE L蛋白。并发现了一种Ton B 依赖性的外膜受体，这种受体具有RA 血清1、2、10型的交叉免疫原性。这为研发RA 亚单位疫苗提供了新的思路和基础（Hu et al.，2011）。徐盼对RA 的OmpA 蛋白的研究中表明，OmpA 确实具有很好的免疫原性。但是，单独使用OmpA 作为抗原所表现出的免疫反应很弱。当OmpA 蛋白添加相应佐剂后做成的亚单位疫苗可以很好的刺激动物机体产生免疫反应（徐盼，2014）。临床实践中表明，亚单位疫苗中不含有细菌的基因组，不会导致细菌突变和毒力返强，相较于弱毒苗有着更高的安全性。另外，通过对于不同血清型RA 的免疫蛋白作比较，很可能找出一种共有免疫蛋白来解决不同血清型RA 之间没有交叉保护力的问题，有着很好的研究前景（王小兰，2012）。但成本较高也成为了制约亚单位疫苗大量应用于临床。
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