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摘 要：为解决热休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)抑制剂的周身毒性问题,自主设计并合成了两个HSP90抑制剂的三肽前药P1和P2。以4-(2-羟乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯和1-(溴甲基)-4-硝基苯为起始原料,经羟胺缩合、硝基还原、关环等反应合成HSP90抑制剂HSP90i-1和HSP90i-2;以L-脯氨酸和L-缬氨酸衍生物为原料,经缩合、脱保护、酰化等反应合成多肽连接子M1。将HSP90i-1、HSP90i-2分别和M1缩合,得到两个三肽前药P1和P2。1H NMR、LCMS、13C NMR分析表征结果表明两个前药分子被成功合成。该研究具有使用的原料廉价易得、反应都在常温下进行、条件温和可控、总产率较高等特点,为多肽前药的设计及合成提供了新的思路和方法。 关键词：HSP90抑制剂;前药;缩合;酰化;多肽前药 0 引 言 热休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)是一种癌症治疗靶点,近年来备受关注。HSP90通过与客户蛋白和辅助分子伴侣的相互作用调节细胞内的信号通路、蛋白质稳态和细胞凋亡过程。通常,HSP90可用于保持400多个蛋白的构象稳定,同时也是癌细胞生长和转移的关键调节因子,能促进瘤细胞运动、侵袭和转移[1]。HSP90治疗靶点发现至今已有三十多年时间,尽管有三十多个HSP90抑制剂进入了临床研究,但都因安全性问题宣告失败[2-3]。Synta公司研发的Ganetespib,在前期研究中对非小细胞肺癌表现出良好的治疗效果,却在临床三期试验中因毒性而终止后续研究[4]。前药策略是将母药分子进行化学结构修饰,使活性母药与某些功能基团以共价键相连,在体内经由某些生物酶的作用释放出母药,从而达到较好的药效。前药策略在药物开发过程中被广泛应用,如用于提高口服药物的生物利用度、增强药物的血脑屏障渗透性、增强药物化学代谢以及母药的靶向递送等[5-8]。将前药策略用于母药的靶向递送,在抗肿瘤药物开发领域极具前景,能够极大地提高药物的安全性。 HSP90抑制剂的毒性主要来源于两个方面:一方面是由于药物进入体内循环后,在各个器官广泛分布,对正常组织的HSP90蛋白功能产生抑制作用,从而诱发周身毒性;另外,进入临床的HSP90抑制剂的选择性过大,尤其对HSP90蛋白家族的其他亚型也都有较强的抑制作用,不可避免地产生脱靶毒性。因此,HSP90亚型选择性抑制剂的开发已经成为一个重要的研究方向。然而,HSP90的蛋白结构高度保守,这使得开发选择性抑制剂异常困难[9-14]。 本文以4-(2-羟乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯和1-(溴甲基)-4-硝基苯为起始原料,经缩合、还原、关环等多步反应得到两个HSP90抑制剂HSP90i-1和HSP90i-2;以L-脯氨酸和L-缬氨酸衍生物为原料,经过缩合、脱保护、酰化反应得到三肽连接子M1。将M1分别与HSP90i-1和HSP90i-2缩合,得到三肽前药分子P1和P2。利用1H NMR、LCMS、13C NMR等分析中间体及目标分子的结构。本文的研究可为三肽类前药提供新的设计思路和合成方法。 1 实验部分 1.1 抑制剂HSP90i-1合成 目标分子的合成路线见图1。4-(2-羟乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯经TsCl活化羟基、羟胺缩合、硝基还原、关环和脱保护[15]等步骤合成4-(5-羟基-4-(1-(2-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-5-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)-6-异丙基苯-1,3-二醇(HSP90i-1)。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11.90 (s, 1H), 9.07 (d, J=8.7 Hz, 1H), 8.88 (d, J=9.4 Hz, 1H), 7.50～7.45 (m, 2H), 7.43 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.93 (dd, J=8.7, 1.9 Hz, 1H), 6.69 (s, 1H), 6.43 (d, J=3.0 Hz, 1H), 6.32 (s, 1H), 4.21 (t, J=7.1 Hz, 2H), 3.22～3.16 (m, 2H), 2.89 (m, 1H), 2.75 (q, J=11.7 Hz, 2H), 1.83 (d, J=12.6 Hz, 2H), 1.68 (q, J=13.5, 6.7 Hz, 2H), 1.49～1.32 (m, 3H), 0.81 (d, J=6.9 Hz, 6H)。LCMS[M+H]+=462.3。  1.2 抑制剂HSP90i-2的合成 目标分子的合成路线见图2。将1-(溴甲基)-4-硝基苯经取代、还原、缩合、关环和脱保护等步骤合成4-(5-羟基-4-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)-6-异丙基苯-1,3-二醇(HSP90i-2)。1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 11.92 (s, 1H), 9.51 (d, J=82.9 Hz, 2H), 7.73～5.65 (m, 6H), 3.46 (s, 2H), 3.29 (s, 4H), 3.06～2.87 (m, 1H), 2.62～2.18 (m, 43H), 1.38 (s, 9H), 0.94 (d, J=6.9 Hz, 6H)。LCMS[M+H]+=410.1。  1.3 三肽连接子M1合成 目标分子的合成需经历5步反应,具体合成路线见图3。  1.3.1 M1b合成 将L-缬氨酸衍生物(M1a,0.9 g, 2.95 mmol)溶于DMF(20 mL),加入脯氨酸(0.3 g, 2.95 mmol)和碳酸钠(0.5 g, 4.43 mmol),室温反应16 h。加水(10 mL),用乙酸乙酯(50 mL×4)萃取,无水硫酸钠干燥有机层,减压浓缩,得白色固体(672.0 mg, 收率:75%)。LCMS[M+H]+=259.1。 1.3.2 M1c合成 将M1b(0.5 g, 1.59 mmol)和PAB(0.2 g, 1.75 mmol)加入二氯甲烷(20 mL),加入EEDQ(0.8 g, 3.18 mmol),室温反应3 h。减压浓缩,硅胶色谱法纯化(PE与EtOAc比值为7∶3)得白色固体(513.0 mg, 收率:77%)。LCMS[M+H]+=420.2。 1.3.3 M1d合成 将M1c(0.6 g, 1.43 mmol)加入二氯甲烷(20 mL),加入三氟乙酸(0.4 mL, 4.30 mmol),室温反应3 h。减压浓缩,硅胶色谱法纯化(PE与EtOAc比值为4∶1)得白色固体(379.0 mg, 收率:80%)。LCMS[M+H]+=320.2。 1.3.4 M1e合成 将M1d(0.1 g, 1.30 mmol)溶于二氯甲烷(10 mL),加入M1a(0.2 g, 1.40 mmol)和三乙胺(0.3 mL, 1.95 mmol),室温反应3 h。加水(5 mL),用乙酸乙酯(20 mL×4)萃取,无水硫酸钠干燥有机层,减压浓缩,得白色固体(110 mg, 收率:69%)。1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 10.15～9.67 (m, 1H), 7.77 (d, J=8.3 Hz, 1H), 7.66～7.41 (m, 2H), 7.23 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.84 (dd, J=23.6, 9.2 Hz, 1H), 5.76 (s, 2H), 5.09 (t, J=5.6 Hz, 1H), 4.42 (d, J=5.2 Hz, 4H), 3.92～3.71 (m, 2H), 3.63 (d, J=6.7 Hz, 1H), 2.12 (d, J=8.5 Hz, 1H), 2.06～1.79 (m, 5H), 1.38 (s, 11H), 0.97～0.69 (m, 13H)。LCMS[M+H]+=519.3。 1.3.5 M1合成 将M1e(0.4 g, 1.30 mmol)溶于二氯甲烷(10 mL),加入对硝基氯甲酸苯酯(39.0 mg, 0.19 mmol),加入三乙胺(1.0 mL, 0.38 mmol),室温反应2 h。加水(5 mL),用乙酸乙酯(20 mL×4)萃取,无水硫酸钠干燥有机层,减压浓缩,得白色固体(441.9 mg, 收率:84%)。LCMS[M+H]+=628.3。 1.4 三肽前药P1的合成 目标分子的合成路线见图4。将HSP90i-1(80.0 mg, 0.17 mmol)溶于DMF(10 mL),加入M1(118.0 mg, 0.17 mmol)和HOAT(34.7 mg, 0.23 mmol),加入DIEA(41.0 mg, 0.34 mmol),在30 ℃反应4 h。减压浓缩,硅胶色谱法纯化(PE与EtOAc比值为7∶3)得白色固体(123.8 mg, 收率:71%)。1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 11.87 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 9.52 (d, J=16.2 Hz, 2H), 7.77 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.47 (ddd, J=23.6, 14.1, 5.2 Hz, 5H), 7.28 (d, J=8.6 Hz, 2H), 6.93 (dd, J=8.6, 2.0 Hz, 1H), 6.81 (d, J=9.5 Hz, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.42 (d, J=3.0 Hz, 1H), 6.23 (s, 1H), 4.98 (s, 2H), 4.38 (dd, J=15.9, 7.2 Hz, 2H), 4.20 (s, 2H), 3.95 (d, J=11.1 Hz, 2H), 3.82 (s, 2H), 3.63 (s, 1H), 2.95～2.77 (m, 1H), 2.10～1.79 (m, 6H), 1.67 (d, J=6.5 Hz, 4H), 1.38 (s, 11H), 1.17～0.99 (m, 3H), 0.98～0.85 (m, 7H), 0.80 (dd, J=12.7, 6.9 Hz, 12H)。LCMS[M+H]+=963.5。  1.5 三肽前药P2的合成 目标分子的合成路线见图5。将HSP90i-2(100.0 mg, 0.24 mmol)溶于DMF(10 mL),加入M1(167.0 mg, 0.24 mmol)和HOAT(49.0 mg, 0.36 mmol),加入DIEA(57.9 mg, 0.48 mmol),在30 ℃反应4 h。减压浓缩,硅胶色谱法纯化(PE与EtOAc比值为7∶3)得白色固体(158.5 mg, 收率:68%)。1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 11.91 (s, 1H), 10.10 (d, J=23.2 Hz, 1H), 9.58 (s, 1H), 9.38 (s, 1H), 7.77 (d, J=8.9 Hz, 1H), 7.56 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.29 (dd, J=8.4, 4.6 Hz, 4H), 7.13 (d, J=8.3 Hz, 2H), 6.89～6.66 (m, 2H), 6.25 (s, 1H), 4.99 (s, 2H), 4.39 (dt, J=17.0, 8.3 Hz, 2H), 3.82 (s, 2H), 3.64 (s, 1H), 3.46 (s, 3H), 3.07～2.85 (m, 1H), 2.76～2.59 (m, 2H), 2.38-2.23 (m, 7H), 2.20～1.74 (m, 6H), 1.38 (s, 9H), 1.03～0.69 (m, 18H)。LCMS[M+H]+=954.2。  2 结果与讨论2.1 M1的合成过程分析 对M1进行质谱分析测试,结果如图6所示。在三肽连接子M1的合成过程中,M1a和脯氨酸在DMF和Na2CO3条件下进行缩合,得到M1b。该氨基酸缩合反应条件温和,特异性高[16],收率为75%。图6(a)展示了M1b在液相质谱ESI正模式下测试所得的谱图;由图6(a)可知其中:横坐标为化合物的摩尔质量,单位为(g/mol),表示化合物的分子质量;纵坐标为荧光强度,用a.u.表示,表示化合物吸收强度。测得离子峰[M+H]+=259.1,因结构中包含Boc,由此推断所测样品中化合物分子量为259.1+56,与目标产物M1b的理论分子质量314.1一致。  由于无保护的二肽很容易发生自身缩合,形成稳定的哌嗪二酮结构[17],故在引入第三个氨基酸之前,先与M1b的羧基反应,即M1b和对氨基苄醇反应得到二肽的苯酰胺衍生物M1c,纯化后产物收率为77%。图6(b)展示了M1c在液相质谱ESI正模式下测试所得的谱图;由图6(b)可知,测得离子峰[M+H]+=420.3,与目标产物M1c的理论分子质量419.3一致。 M1c在DCM中用TFA脱去氨基保护基Boc,得到N端未保护的二肽M1d,收率80%。图6(c)展示了M1d在液相质谱ESI正模式下测试所得的谱图;由图6(c)可知,测得离子峰[M+H]+=320.2,与目标产物M1d的理论分子质量319.2一致。 M1d中的氨基与M1a的活性酯部分高效缩合得到三肽苯酰胺衍生物M1e,收率为69%。图6(d)展示了M1e在液相质谱ESI正模式下测试所得的谱图;由图6(d)可知,测得离子峰[M+H]+=519.3,与目标产物M1e的理论分子质量518.3一致。 M1e与对硝基氯甲酸苯酯发生酰化反应,得到稳定的三肽苯酰胺活性酯衍生物M1,收率84%,该路线总产率为27%。图6(e)展示了M1在液相质谱ESI正模式下测试所得的谱图;由图6(e)可知,测得离子峰[M+H]+=628.3,因结构中包含Boc,由此推断所测样品中化合物分子量为628.3+56,与目标产物M1的理论分子质量683.3一致,确定为目标化合物。 2.2 P1和P2合成过程分析 将含有二级胺官能团的HSP90抑制剂分别与含有活性酯的三肽连接子缩合,得到两个三肽前药P1和P2。反应路线简短,条件温和,产品收率较高,为三肽类药物的合成提供了新的方法。 2.2.1 P1液相质谱分析 采用液相质谱(LCMS)对P1进行质谱分析,分析结果如图7(a)所示,测得离子峰[M+H]+=963.5,因结构中包含Boc,由此推断所测样品中化合物分子量为963.5+43,与所设计目标产物P1的相对分子质量1005.5相吻合,确定为目标化合物。  2.2.2 P1核磁氢谱分析 采用核磁氢谱(1H NMR)对P1进行氢谱分析见图7(b),P1分子式为C54H71N9O10,图中氢的个数为71,1、2、3位置的3个氢为3个羟基峰,4、5位置的6个氢为异丙基的两个甲基的氢,6、7、8、9位置的12个氢为另外4个甲基的氢,因此可以确定为目标化合物2.2.3 P2液相质谱分析 采用液相质谱(LCMS)对P2进行质谱分析,分析结果如图8(a)所示。测得离子峰[M+H]+=954.5,与所设计的目标产物P2的相对分子质量953.5相吻合,确定为目标化合物。  2.2.4 P2核磁氢谱分析 采用核磁氢谱(1H NMR)对P2进行氢谱分析,结果见图8(b)。P2分子式为C50H67N9O10,图中氢的个数为50,1、2、3位置的3个氢为3个羟基峰,4、5、6、7、8、9位置的18个氢为6个甲基的氢,由此可以确定为目标化合物。 2.2.5 P1和P2核磁碳谱分析 核磁碳谱(13C NMR)对P1和P2进行碳谱分析见图9,根据碳的位置和数量可以确定为目标化合物。  3 结 论 本文先通过多步反应得到HSP90i-1和HSP90i-2两种HSP90抑制剂,随后分别与三肽连接子M1进行缩合反应,得到三肽前药分子P1和P2。合成三肽连接子M1的总产率为27%,通过1H NMR、LCMS、13C NMR证明成功合成了目标化合物。本文提出的整个合成路线所使用的原料廉价易得,反应都在常温下进行,条件温和可控,总产率较高。本研究对HSP90抑制剂的毒性问题进行分析,利用前药方法优化化合物的结构,从而达到降低药物毒性,提高药物安全窗的目的,对抗肿瘤药物的发展有着重要的实践意义。 免责声明：本文为行业交流学习，版权归 原作者所有，如有侵权，可联系删除。 |
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