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在之前的推送中我们介绍了诺奖得主David Baker在BioRxiv上发表的预印本文章——"Sequence-specific targeting of intrinsically disordered protein regions"，（作者通过 “口袋生成”“口袋组装”“穿连装入”“精修改善”这四步完成了针对IDRs的binder的设计。）这次我们介绍他的另一篇文章“Diffusing protein binders to intrinsically disordered proteins”，该文章介绍了一种仅通过序列信息，不需要结构信息，开发靶向一般性IDPs/IDRs的设计方法。 这篇文章仍在预印本上发表，到目前为止尚未正式发表。我们看一下Baker在这篇文章中是如何根据序列信息开展无序结构binder设计的。 ——核心内容—— 本篇文章致力于根据序列信息而非几何结构信息发展靶向无序蛋白高亲和力binder的方法。通过RFdiffusion来训练PDB库中的双链体系的数据，通过对双链体系中的其中一条链添加噪音，而另一条链仅给出序列信息，这样的做法或许可以得到达到目标的能力。这种方法之前被用于生成具有螺旋结构的生物活性肽激素的binder。现在希望将这种方法应用于无序蛋白（大部分并不兼容适配于连续的螺旋构象）。为了靶向更短的无序区，作者借鉴Sahtoe等人使用Rosetta的链配对方法和RFdiffusion对链不同的可变构象进行采样，通过主链-主链之间的氢键和侧链-侧链之间相互作用最大化，可以生成通用的方法，在较短区域实现相互作用的最大化，从而产生binder。（具体内容可以见原文和参考文献11、13、14）
图1.关于IDRs的binder设计的主要方法 ——实验结果1—— 作者首先对Amylin（37个残基调节血糖的激素）进行了binder生成，仅输入Amylin的序列信息，采用针对柔性目标进行微调的RFdiffusion的方法，生成了包含Amylin和其binder的各种构象的复合物，在连续的去噪步骤中，Amylin呈现出不同的构象，而binder的残基分布围绕Amylin变化，逐渐组织成一个折叠的结构，几乎环绕在Amylin的整个表面。然后使用ProteinMPNN对主链库进行序列设计，使用AlphaFold2对单体构象进行筛选以及复合物起始构象的猜测，此时通过实验进行了初步验证，再使用了一种双侧部分扩展的方法，使得peptide与binder的构象更好的适配。最终得到了结合Amylin纳摩尔的binder（BLI实验），并且复合物中Amylin重要的二硫键均得到保留。接着又对C-Peptide（胰岛β细胞分泌的31个残基的肽）进行了binder设计，效果最好的CP-35结合力为28 nM。以及对VP48（39个残基的转录激活因子）的binder设计，效果最好的VP-48结合力为39 nM。
图2.无序结构binder设计及亲和力测定 ——实验结果2—— 对于靶向较短的片段，RFdiffusion生成的设计中具有较好指标的，往往是那些具有β折叠构象的靶标，为了提高此类设计的效率，作者在Rfdiffusion序列输入方法中加入了定义靶标二级结构的能力，使得目标序列全部或部分为螺旋、折叠和环区的构象，这对β链构象尤其重要，因为β链的构象在实际的三维空间中会有较大变化。新加入的能力可以更好地应对β链构象的复杂性。紧接着作者利用它对3个无序区域设计了binder。G3BP1是一个与核酸相分离相关蛋白，其RNA结合区（KPGFGVGRGLAPR，13 个氨基酸）RBD非常重要，针对此进行binder设计，指定二级结构为β链，最终在所有通过筛选的设计中，目标都含有β链构象。通过筛选，实验验证以及双侧部分扩散的进一步优化，进行了10000条轨迹模拟，最终得到G3bp1-11（亲和力11 nM）。接着作者对朊蛋白淀粉样核心区域的180-187位（VNITIKQH）进行了binder设计，同样指定了其二级结构为β链，PRI28效果最好，Kd为14 nM。作者还对IL2RG（细胞因子共同 γ 链）的氨基酸残基327-336位（ERLCLVSEIP）进行了binder设计，效果最好的IL2RG-30，亲和力为97 nM。 作者分别解析了Amylin-22αβL和G3bp1-11与各自一个binder的复合物结构，结果显示两者的复合物结构均与计算设计的结构一致。Amylin-22αβL与binder、G3bp1-1与binder的X-ray结构与计算预测结构之间复合物的骨架Cα RMSD分别是2.04 Å和0.80 Å。 除此之外，作者通过all by all的方式检测了binder对靶标的特异性，图3显示这些binder均具有良好的特异性。最后作者通过IL2RG及binder在Hela细胞中的共定位和binder对Amylin-22αβL纤维聚集的影响等实验证明了无序蛋白的蛋白binder具有在细胞内正确折叠、结合靶标和调控靶标功能的能力。
图3.无序结构binder的特异性 ——总结—— 总的来说，Baker在"Diffusing protein binders to intrinsically disordered proteins"这篇文章中描述了仅通过序列信息即可设计无序结构（几个氨基酸残基到三四十残基）binder的方法，并进行了实验验证。本系列的两篇无序蛋白binder设计工作表明蛋白配体在高特异、高亲和地调控无序蛋白上大有可为。 参考文献： |
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