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Monte Rosa Therapeutics是一家专注于分子胶降解剂（Molecular glue degrader，MGD）开发的公司，其研发管线聚焦于难成药靶点（GSPT1、VAV1、NEK7）。去年10月，Monte Rosa在BioRxiv上发表了其最新文章“Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition”，阐述了他们分子胶降解剂的开发历程。 ——背景—— 分子胶降解剂是一种利用细胞内蛋白质降解机制（如泛素-蛋白酶体、溶酶体等）来降解靶标蛋白的分子。目前研究最为深入的分子胶降解剂是以E3泛素连接酶CRBN为基础的分子胶降解剂，这类药物也被称为CRBN调节药物（Cereblon modulating drugs，CELMoDs）。CELMoD与CRBN结合，形成新的二元复合物界面，通过该界面招募新的底物（Neo-substrate）。已知的Neo-substrate有CK1α、GSPT1、IKZF1、IKZF2、WIZ等，这些都是传统意义上的难成药靶蛋白。这些Neo-substrate通过一个G-loop与CRBN/CELMoD结合，G-loop由β-hairpin α-turn构成，在特定位置有一个共同的甘氨酸，因此也被称为β-hairpin G-loop。目前已知数千种人类蛋白都包含这样的结构。鉴于三元复合物界面的简洁性，作者们试图回答两个问题：是否有更多的G-loop蛋白可被CELMoD诱导降解；除了G-loop，CRBN是否还能与其他结构兼容？ ——NEK7降解剂的发现—— 在前半部分中，作者通过计算方法发现了人类蛋白质组中存在大量G-loop蛋白，并明确了这些G-loop蛋白可被化合物诱导接近CRBN，但“接近（Proximity）”是蛋白降解的必要不充分条件：以本文中的Cpd1为例，Cpd1可诱导CK1α，NEK7，SCYL1，MNAT1，ASS1，CHD7，PPIL4等多种蛋白接近CRBN（Turbo-ID实验），但仅有CK1α，PDE6D和少量C2H2 ZFs的含量有明显下降。于是作者探究了一个问题：能否通过对分子胶进行化学改造，使得“接近”转变为“降解”。
图1. 本文所用到的分子胶 在此基础上，作者将目光投向NEK7（一种与 NIMA 相关的丝氨酸 / 苏氨酸激酶，在自身炎症性疾病中具有治疗相关性）。NEK7激酶结构域的N-lobe上存在一个β-hairpin G-loop，与CK1α具有较高相似性（图2）。在TR-FRET， NanoBRET和TurboID实验中，CRBN和Cpd1，NEK7能形成三元复合物，但在CAL51细胞中，Cpd1对NEK7水平无影响。
图2. NEK7激酶结构域 作者通过TR-FRET，NanoBRET实验筛选了内部化合物库，发现了Cpd5能诱导NEK7与CRBN形成三元络合物，其EC50值与Cpd1相当，但信号强度高于Cpd1。在CAL51细胞中，Cpd5选择性降解NEK7，且降解谱与Cpd1比相当干净（图3）。
图3. A. Cpd1降解谱。B. Cpd5 NanoBRET信号强于Cpd1。C.Cpd5降解谱。 作者解析了CRBN-Cpd5-NEK7的复合物晶体结构。首先Cpd5的二氢尿嘧啶片段插入CRBN三色氨酸笼中，咪唑并吡啶环以及后续的尾巴朝向溶剂暴露区，负责与NEK7相互作用。NEK7通过G-loop与CRBN/Cpd5复合物结合，其中G-loop位于咪唑并吡啶环附近，G-loop上的G57，L55，L54主链羰基分别与CRBN W386，H357，N351侧链形成氢键。此外G-loop G-5位的丙氨酸A52较小的侧链避免了与化合物形成冲突。最后，苯基磺酰胺部分更接近于NEK7残基的远端，并且与位于相邻的N-lobe上β-链上的R35和E37形成氢键（图4）。
图4. 三元复合物晶体结构及详细互作 ——VAV1降解剂的发现—— 前面作者通过基于序列的方式，发现了一千多种CRBN潜在新底物。紧接着作者更换策略，通过基于表面的方式，又发现了新的CRBN底物，这些新发现的底物的degron序列与之前的G-loop完全不同。 本公众号前文推送的“MaSIF相关工作”是近年来描述蛋白质表面的重要计算工具。值得注意的是，Monte Rosa这篇工作的共同第一作者正是MaSIF的第一作者。本工作采用的表面相似性算法来源于MaSIF。 从CRBN-CC90009-GSPT1三元复合物结构出发，首先提取GSPT1中与参与复合物形成的界面，然后在蛋白质组中搜寻相似的界面。作者将已知的G-loop的蛋白排除在外，希望寻找到新颖的靶标（图5A）。 VAV1是B细胞和T细胞受体信号传导的关键介质，且不含G-loop。 VAV1表面可划分出27168个patch，将这些patch逐一与GSPT1 degron surface进行匹配，得到较为相似的patch。然后通过蛋白-蛋白对接，过滤掉与CRBN界面有冲突的patch，最后确定VAV1的C末端SH3结构域（SH3c），与GSPT1表面在与CC-90009形成的复合物中与CRBN接触的表面有极高的相似性，且SH3c结构域与GSPT1或其G-loop没有潜在的结构同源性。
图5. A.基于表面的CRBN Neo-substrate发现过程 B.VAV1 SH3c表面与GSPT1 degron比较 随后作者筛选了内部化合物库，发现Cpd6能够专一地诱导CRBN与VAV1 SH3c形成三元复合物（图6）。
最后，作者解析了VAV1-Cpd6-CRBN的三元复合物结构（图7）。VAV1 SH3c 结构域中的预测参与形成复合物的patch由两个色氨酸残基 W820 和 W831 以及 RT 环的顶端区域（aa797 – 801）形成。
图7. VAV1-Cpd6-CRBN的三元复合物结构及关键相互作用 ——小结—— 通过计算工具，该工作系统性的发掘了1633种潜在的CRBN新底物，且在已知的β-hairpin G-loop motif之外，发现了新的helical G-loop。（之前的工作已经发现含C2H2锌指结构域是CRBN的潜在底物）该工作进一步拓宽了CRBN底物范围，包含不同功能、结构的蛋白质。通过实验验证，该工作确证了21种含有β-hairpin G-loop或 helical G-loop的新底物，大大拓宽了CRBN底物。不同的CELMoDS，可实现对底物的精准降解，表明基于CRBN的分子胶降解剂大有可为。 G-loop motif的发现是基于序列的发掘方法的胜利。回归本质，CELMoDs诱导三元复合物形成这一过程事实上是Neo-substrate的界面与CELMoD-CRBN二元复合物新界面之间的电荷、形状、亲/疏水等的匹配。因此，基于表面的方法使作者成功发现了VAV1也是CRBN的底物，尽管VAV1与GSPT1序列相似性或结构同源性上都很低。该发现同样凸显了CRBN参与PPI相互作用的界面的非凡可塑性（N351、H357、W400），这些位点既能与G-loop相容，也与VAV1的RT-loop相容。 最后，Monte Rosa的工作展示了计算工具在分子胶开发中的非凡潜力。 参考文献： [1] Petzold, G.; Gainza, P.; Annunziato, S.; Lamberto, I.; Trenh, P.; McAllister, L.; Demarco, B.; Schwander, L.; Bunker, R. D.; Zlotosch, M.; et al. Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition. bioRxiv 2024, 2024.2010.2007.616933. DOI: 10.1101/2024.10.07.616933. |
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