培养基的适用性检查

无菌检查法（Sterility tests），顾名思义就是检查是否无菌，至于检查什么，凡是药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料等均需要经过此项检查，因此它也成为制药行业绕不过去的一个话题。虽然中国药典、美国药典等，都对无菌检查法进行了明确的规定，但不同国家中具体实施却不尽相同，因此对于那些中美双报或者多个国家申报的公司，明确各国药典中差异尤为重要。大家更为关注的一个问题是，能不能开发出同时满足多国申报的无菌检测法，或者该怎样设计实验能够更具性价比地满足多国申报的要求？

除去培养基制备、储存和稀释液、冲洗液配制等准备工作，无菌检查包含3个部分的实验，分别为：培养基适用性检查、方法适用性试验和供试品的无菌检查。

• 1：培养基适用性检查：主要目的有两个，一是确认使用的培养基本身是无菌的，即无菌性检查，通过在适宜温度下放置培养基观察判定；二是确认使用的培养基细菌或真菌是可以舒舒服服生长并且在规定时间内可以被观察到，即灵敏性检查，通过接种特定菌种，观察菌生长状态判断。进行了以上实验，就可以判断检测不到细菌真菌，不是培养基自身造成的。
• 2：方法适用性试验：主要目的是判断采用的方法，薄膜过滤法或者直接接种法，是否适用于你要检测的这种产品。尤其是一些产品，本身就含有抑菌成分，这种情况下难道在整个检验期内结果呈现阴性，就是真的无菌了吗？答案是不一定的，因此我们需要排除检验过程中操作或者产品本身的抑菌性。当一个新产品进行无菌试验或者实验条件改变时，需要进行验证试验，可与供试品无菌检查同步进行。
• 3：供试品的无菌检查：这就是实打实的对于产品的无菌检测，从检测数量、检验量、阴/阳性对照、接种要求、培养观察和结果判读全都进行了细致规定。谈谈检测数量和检验量，检测数量是一批次一定数量的产品中需要抽检的数量，检验量是每瓶/支中要取多少体积的供试品用于检测。对于检测数量和检测量的规定更好更全面地评估了整批样品的无菌性。

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今天，我们谈一谈培养基适用性检查，是如何检查的（如何验证的），分享如下，供参考：

1. 验证目的：本次验证的目的是确认无菌检查、微生物限度检查、控制菌检查用培养基应进行培养基的适用性检查，符合灵敏度要求。

2. 参照标准：2010版中国药典二部附录：XII A无菌检查法和XI G微生物限度检查法。

3. 验证项目：无菌检查、微生物限度检查、控制菌检查用培养基的适用性检查。

4. 验证小组人员及职责：

小组人员	职务	职责
		负责验证方案的审批，确认所有的验证项目均已完成，并按方案执行。
		负责验证日常管理工作，负责验证方案的审核。
		负责验证方案及报告的起草，负责该方案的实施，对实施过程中资料和数据进行汇总并完成报告。

5. 前提条件确认：

所有本次验证实施过程中用到的仪器都已经过计量并且在计量有效期内。

所有参与本次验证的公司人员均进行相关培训

6. 接受标准

• 液体培养基促生长能力检查：被检培养基与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。
• 液体培养基指示能力检查：与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。
• 固体培养基促生长能力检查：被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。
• 固体培养基指示能力检查：被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。
• 培养基抑制能力检查：试验菌应不得生长。
• 无菌性检查：应不得有菌生长。
• 适用性检查：被检培养基上的菌落数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且生长的菌落大小、形态特征应一致。

7. 验证实施

试验用仪器和物料：所用培养皿、移液管、工器具均应严格按照相关的灭菌程序灭菌；生物安全柜、灭菌器、霉菌培养箱、生化培养箱、水浴锅、电热鼓风干燥箱等。

验证用培养基及试剂：

验证用菌株：

测试菌悬液菌液制备    

● 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于30～35℃培养18～24小时。分别取上述新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100cful的菌悬液。

● 接种生孢梭菌至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时。上述新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数10~100cfu的菌悬液。

● 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于23～28℃培养24~48小时。取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100cfu的菌悬液。

● 接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，于23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的菌悬液。

● 备注：控制菌项检查用工作菌液浓度为10~100cfu/m l，无菌项检查用工作菌液浓度小于100cfu/ml。

检查：

● 液体培养基促生长能力检查：分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应规定的培养温度及最短培养时间下培养。

● 液体培养基指示能力检查：分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应规定的培养温度和最短时间下培养。

● 固体培养基促生长能力检查：取0.1ml（含菌数50～100cfu/ml）的试验菌分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应规定的培养温度及最短时间下培养。

● 固体培养基指示能力检查：取不大于100cfu的试验菌分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。

● 培养基抑制能力检查：接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养。

● 无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶）/倾注相应数量的平皿，按规定条件培养。

● 适用性检查：取50～100cfu/ml的试验菌1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注被检培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，按规定条件培养，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

● 空白对照：被检培养基同时做空白对照，按上述规定条件培养。

各培养基检查信息：

8. 结果：

结果见附表一培养基适用性验证结果、附表二培养基适用性检查通用。

9. 结论：（略）

10. 周期：干粉或无菌培养基批号改变时重新验证。