|
作者：刘希燃，南京农业大学硕士在读，主要研究固体废物资源化利用对植物土传病害的防治。 周刊主要展示优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍一个关于两个角色的故事:根分泌阿魏酸甲酯抑制烟草黑胫病，并增强根际芽孢杆菌抗黑胫病能力。原文于 2025年1月发表在《Microbiome》上。
 根系分泌物是调节根际相互作用和控制土传疾病的化学信号分子。 植物与土壤微生物之间的相互作用在调节植物对生物胁迫的抗性中起着动态的关键作用。然而，许多根分泌物在植物病原体中的具体作用尚不清楚。根分泌物阿魏酸甲酯是一种天然存在的相对无毒的抗真菌剂，已被用于控制采后病原体和保存食品，但尚未用于植物病害防治。该研究聚焦于根系分泌物阿魏酸甲酯，深入探究了其在直接防御病原菌和招募有益微生物方面，发挥“一箭双雕”的作用，对烟草疫霉（P. nicotianae）的影响以及在植物与土壤微生物互作中的作用机制。结果表明，抗性品种革新3号接种烟叶后分泌的阿魏酸甲酯量高于敏感品种小黄金1025。 阿魏酸甲酯对烟草黑胫病有较强的抑制作用，通过抑制NADH脱氢酶功能有效防治烟草黑胫病。此外，阿魏酸甲酯招募了芽孢杆菌等抑制疾病的根际微生物，从而增强了抗病性。咖啡酸O-甲基转移酶NtCOMT10的过表达导致阿威酸甲酯分泌增加，同时改善了烟草黑柄病的疾病抑制和有益微生物的富集。此外，阿魏酸甲酯对其他植物病原菌如葡萄球菌、葡萄球菌、大豆球菌、葡萄球菌和尖孢菌均有拮抗作用。 图1 实验设计示意图 1.根分泌物代谢组学比较分析及其对P. nicotianae的抗真菌活性
为了研究根分泌物中是否存在抗真菌代谢物，作者对接种烟草假单胞菌后的根分泌物进行了比较分析，分析了抗性品种革新3号和敏感品种小黄金1025。通过UPLC-MS/MS在根分泌物样品中鉴定出304种代谢物（图2A）。热图分析显示，葛新3号和小黄金1025之间存在显著差异，特别是在接种烟叶假单胞菌后（图2A）。根分泌物代谢物在革新3号中有40种差异表达，而在小黄金1025中有81种差异表达（图2B）。接种烟叶假单抗后，抗性品种共有43种分泌的根分泌物代谢物发生了变化（图2B中的三角形标记）。进一步的研究表明，大多数成分集中在脂质、酚酸、有机酸和氨基酸中（图2C）。选取阿魏酸甲酯、阿魏酸甲酯、己二酸、癸酸甲酯、苹果酸甲酯、绿原酸甲酯、酪酸甲酯等7个化合物，以无害、易合成、价格低廉为标准进行进一步分析。 将化合物以100 μg/mL的浓度加入培养基中，以100 μg/mL的代森锰锌甲为阳性对照。结果表明，阿魏酸甲酯显著抑制烟草假单胞菌菌丝生长（图2D）。因此，对阿魏酸甲酯进行了进一步的研究。 图2 不同烟草品种根系分泌物分析 2.阿魏酸甲酯对P. nicotianae 有显著的防控效果
通过在培养基中梯度添加阿魏酸甲酯，发现其对P. nicotianae的生长表现出剂量依赖性抑制（图3A），在无菌土壤和自然土壤中，阿魏酸甲酯显著降低了P. nicotianae的数量，且在自然土壤中效果更为显著（图3B和C）。阿魏酸甲酯显著增强了烟草对黑胫病的抗性（图3D），烟草病情指数和病原菌数量均显著降低（图3E和F）。这些结果表明，阿魏酸甲酯在培养基和土壤中均能有效抑制P. nicotianae的生长，并显著增强烟草对黑胫病的抗性，此外，我们的研究结果表明，阿魏酸甲酯对绿僵菌、绿僵菌等具有拮抗作用。 图3 阿魏酸甲酯对烟草黑胫病的治效果分析图
3.阿魏酸甲酯损害病原菌NADH脱氢酶功能并促进自噬作用为了进一步了解阿魏酸甲酯对烟草假单胞菌（P. nicotiae）的抑制机制，我们进行了转录组分析。结果显示，经阿魏酸甲酯处理后，烟叶中有240个差异表达基因（DEGs）。其中162个基因上调，78个基因下调（图4A）。对KEGG通路的进一步分析显示，这些基因在氧化磷酸化、淀粉代谢和蔗糖代谢通路中显著富集（图4B）。NADH脱氢酶铁硫蛋白7（Ndufs7）家族的所有成员，线粒体复合体I的一个亚基，与氧化磷酸化相关，在阿魏酸甲酯处理后表达增加（图4C）。通过qPCR检测这些基因的表达，证实了之前分析中观察到的增加趋势（图4D-4H）。 这些发现促使作者关注NADH脱氢酶的活性。结果显示，阿魏酸甲酯处理后，NADH脱氢酶活性显著降低（图4I）。阿魏酸甲酯处理显著降低了NAD+和NAD+/NADH比率（图4J）。这些发现表明NADH脱氢酶和线粒体复合体I存在功能障碍。复合体I对ATP合成至关重要，同时结果检测到阿魏酸甲酯处理后烟叶细胞ATP含量降低（图4K）。 此外，使用荧光探针JC-1进行的检测有助于观察JC-1从红色（JC-1聚集体）到绿色（JC-1单体）的转化（图4L）。这表明阿魏酸甲酯处理后线粒体膜电位降低。此外，阿魏酸甲酯诱导烟叶细胞自噬，自噬染色试验显示，阿魏酸甲酯处理后绿色荧光显著增加，表明自噬发生了明显变化（图4M）。透射电镜（TEM）观察自噬体的结构和分布，阿魏酸甲酯处理后的样品呈现出更独特的双层和自噬体结构（图4N）。生化和超微结构结果表明，自噬途径明显激活。这些结果表明，阿魏酸甲酯通过破坏NADH脱氢酶的功能、减少ATP的合成、降低线粒体膜电位和刺激自噬来抑制烟草假单胞菌的生长。图4 阿魏酸甲酯防治烟草假单胞菌作用机理分析 4.阿魏酸甲酯招募有益的芽孢杆菌属物种以抑制P. nicotianae的侵染阿魏酸甲酯的添加可显著降低无菌和自然土壤样品中病原菌的丰度。然而，如图3B和C所示，阿魏酸甲酯在自然土壤中的效果比在无菌土壤中更为明显。这促使我们研究微生物在这一过程中的微生物的潜在作用，然后我们在烟草黑胫病苗田接种了烟草假单胞菌后进行了阿魏酸甲酯处理。采用Illumina Miseq对CK组和阿魏酸甲酯处理组根际土壤16S rRNA基因进行测序，监测根际土壤细菌群落组成。OTU水平的PCoA显示阿魏酸甲酯处理的样品和对照样品之间存在明显的分离（图5A）。 阿魏酸甲酯处理组的根际细菌微生物群呈现出更多数量的连接共发生网络，路径长度更短，边缘更多，节点更多（图5B），这一结果表明阿魏酸甲酯处理组的根际细菌群落的复杂性更大。为阐明黑胫病苗田菌群组成的变化，在属水平上鉴定受影响的菌种，在接种烟草假单胞菌后，对阿魏酸甲酯处理组和对照组进行了Wilcoxon秩和检验。在变化最大的前15个属中，芽孢杆菌在阿魏酸甲酯处理组的丰度最高（图5C）。这些结果表明，阿魏酸甲酯增加了芽孢杆菌的丰度。鉴于芽孢杆菌在阿魏酸甲酯处理的根际群落中丰度高，我们分析了该属中每个OTU个体的相对丰度和进化关系。16个OTU被鉴定为芽孢杆菌属，是300个最丰富的OTU之一。这些OTU在系统发育上聚集在一起，OTU5403是根际土壤中最丰富和富集的分类群，在阿魏酸甲酯处理组其丰度显著增加（图5D）。 进一步验证了芽孢杆菌对黑胫病的潜在抑制作用。图5 阿魏酸甲酯促进有益微生物的招募，以抵抗烟草黑胫病5.NtCOMT10的过表达增加了阿魏酸甲酯分泌，减少了烟叶P. nictianae的丰度为了更深入地了解阿魏酸甲酯的功能，作者试图调控其在烟草中的合成。文献综述表明，咖啡酸O -甲基转移酶可能参与阿魏酸甲酯的合成。 利用BLASTP在烟草植株中鉴定出12个NtCOMTs。系统发育树显示，这些成员被分为两个科，其中组1进一步细分为两个亚科（图S3A）。基因基序和结构分析证实了系统发育分组的发现（图S3A）。这些基因的表达水平已在抗性品种Beihart1000-1 (R)和敏感品种小黄金1025 (S)感染后0和60 h的转录组谱中检测到。热图分析显示，接种烟草假单胞菌后，1b组中只有Ntab0849090.1和Ntab0513830.1的表达水平升高（图S3B）。 Ntab0849090.1在接种烟草假单胞菌后表现出更明显的变化，并根据其染色体位置重新命名为NtCOMT10。为了确定NtCOMT10是否在阿魏酸甲酯合成中起作用，我们在烟草K326中过表达NtCOMT10。选择两株种子充足的独立高过表达系OE7和OE18进行进一步分析（图S3C）。接着收集根分泌物，采用高效液相色谱-质谱法测定阿魏酸甲酯含量，与野生型相比，OE7和OE18的阿魏酸甲酯产量分别增加了168%和221.09%（图6A）。根分泌物中检测到的阿魏酸甲酯含量与NtCOMT10的表达量一致。这些结果表明，NtCOMT10在阿魏酸甲酯合成中起着至关重要的作用。与野生型相比，接种烟叶假单胞菌后，过表达系的存活率和疾病指标均优于野生型（图6B-C）。此外，在NtCOMT10 OE-7、OE-18和野生型植物中测定了烟叶假单胞菌的相对丰度。在过表达系的根际土壤中，烟草假单胞菌的相对丰度明显降低（图6D）。随后对野生型和NtCOMT10过表达植株根际土壤细菌群落组成进行了监测。阿魏酸甲酯处理组、野生型组、OE-7组和OE-18组在正常条件和病原菌接种处理下的根际细菌群落组成差异显著（图6E和6F）。在没有来自烟草假单胞菌的外部刺激的情况下，阿魏酸甲酯处理组的根际细菌群落组成在水平轴上与其他组相比表现出独特的特征（图6E）。此外，在接种病原体后，WT组与其他组之间存在明显差异（图6F）。这些发现表明，阿魏酸甲酯对烟草根际细菌群落的组成有强烈影响。在属水平上，与对照野生型组相比，阿魏酸甲酯处理组和过表达系组芽孢杆菌的相对丰度显著增加（图6G），这与田间观察结果一致（图5C）。此外，我们发现OTU9124与OTU5403的相似性为100%，与NM17菌株的相似性为99.53%，是盆栽实验中最相似的OTU，并对其相对丰度进行了量化。在过表达组和阿魏酸甲酯处理组中，OTU9124的相对丰度显著增加（图6H）。综上所述，过表达NtCOMT10增加了阿魏酸甲酯的分泌，降低了烟草P. nictianae的丰度。 图6 过表达NtCOMT10增加了阿魏酸甲酯的分泌，增强了对黑胫病的抗性 图S3 NtCOMTs10基因分析 本研究结果表明，阿魏酸甲酯根分泌物可以通过两种方式增强对烟草黑腿病的抗性：一种是通过破坏NADH脱氢酶的功能，减少ATP的合成，促进自噬的进程，直接抑制烟叶的生长；二是招募有益微生物抑制病原菌的间接作用。阿魏酸甲酯直接施用于土壤以及相关基因NtCOMT10的过表达均可显著提高烟草植株的抑病效果，并显著降低土壤病原菌的丰度。作者提出植物增强抗病性的机制是通过增加几种根分泌物代谢物的分泌，这些代谢物抑制病原体并招募有益微生物。总之，本研究为通过调节或施用根分泌物阿魏酸甲酯来抑制病原体和微生物编码功能来管理土传真菌疾病提供了一个新的视角。 论文信息 原名:A tale for two roles: Root‑secreted methyl ferulate inhibits P.nicotianae and enriches the rhizosphere Bacillus against black shank disease in tobacco 译名：一个关于两个角色的故事:根分泌阿魏酸甲酯抑制烟草黑胫病，并增强根际芽孢杆菌抗黑胫病能力
期刊：Microbiome
DOI：10.1186/s40168-024-02008-3
发表时间：2025.01.31 通讯作者：荆常亮，张成省，李义强 通讯作者单位：中国农业科学院烟草研究所
|
