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作者：王硕，南京农业大学博士在读，主要研究利用噬菌体防治土传病害。  导读 病毒作为人类微生物组的核心组成部分，通过与肠道细菌和免疫系统的相互作用，对健康产生了重要影响。其中，噬菌体是人类微生物组中最主要的病毒类型，专性侵染细菌。然而，长期以来，大多数肠道病毒组研究主要聚焦于低分类分辨率（如vOTU），限制了种群水平的深入分析。此前，在荷兰阿姆斯特丹的居民中发现了一个广泛分布的噬菌体谱系。本研究进一步探讨了该谱系在不同人类群体中的生物多样性及其进化历程。基于来自六个病毒基因组数据库的序列，构建了系统发育树，并提出了一个新的候选目——Heliusvirales。通过对39项研究中的5441名个体进行分析，发现82%的个体携带该病毒，甚至在1000至5000年前生活在欧洲和北美的古代人类宏基因组中也检测到了其存在。研究表明，这一庞大的噬菌体谱系在大约30万年前智人出现时开始多样化。与现代城市化人群相比，古代人群和现代狩猎采集者的Ca. Heliusvirales种群丰富度较低。值得注意的是，患有Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病以及炎症性肠病的城市化人群，其Ca. Heliusvirales的丰富度显著高于健康对照组。基于这些发现，得出结论：这一古老的噬菌体谱系作为人类肠道病毒组的核心成员，随着日益西化的生活方式而蓬勃发展。 一、Heliusviruses在噬菌体数据库中无处不在 Ca. Heliusviridae科是一个广泛分布的人类肠道噬菌体分支。这些噬菌体共有9个标记基因：4个结构蛋白（末端酶大亚基TerL、门户蛋白、主要衣壳蛋白和头部成熟蛋白酶）、3个与复制相关的基因（DNA聚合酶I、解旋酶和核酸酶）以及2个功能未知的蛋白（图1a）。为了更全面地研究这些噬菌体，本研究从7个噬菌体数据库中筛选了842,163个超过30kbp的contig，使用9个标记基因的隐马尔可夫模型（HMM）进行分析（图1b）。本研究发现在25,699个基因组的TerL基因系统发育树中1308个基因组与Heliusvirus的TerL基因高度相似，形成一个独特的分支（图1c）。这些基因组的TerL基因在与ICTV注释的参考噬菌体的TerL基因比较时也形成了单系分支（图1d），最终保留了1032个Heliusvirus基因组用于进一步研究。噬菌体特异性基因注释细化了几种标记基因的功能：DNA聚合酶I被重新注释为核酸外切酶，而功能未知的基因编码DNA聚合酶和单链DNA结合蛋白（图1a）。唯一的通用蛋白簇是TerL，其他先前描述的标记基因均位于11个最常见的蛋白簇中（图1e）。主要衣壳蛋白和解旋酶分布在多个蛋白簇中。  图1 Heliusvirus标记基因的存在与TerL同源性有关 在TerL基因的近似最大似然树中，本研究再次辨别出三个大的、得到充分支持的分支（图 2a），但这些并不完全等同于以前的分组。TerL发育树还清楚地表明，这些噬菌体在目水平上的分类效果更好。原因如下：三个最大的分支可以分为较小的分支，这些分支至少共享其蛋白质含量的 5-57%，对于它们来说太低了，无法与不同的噬菌体属相提并论（图 2b）。根据病毒分类层次结构，本研究将这些分支分类为亚科。三个最大的科是Ca.Utuviridae（美索不达米亚）、Ca.Aineviridae（爱尔兰）和Ca.Hathorviridae（埃及）。几个较小的、支持良好的、高水平的分支也被置于科等级，因为它们共享蛋白质的含量非常低（<15%）。三个最大家系中的亚科大多共享蛋白质含量中位数为 25%（图 2b）。Ca.Heliusvirales的基因组网络显示，大多数亚科的蛋白质含量高度相似（图 2c），标记基因和基因同义的保守性以及亚科之间共享基因进一步支持这一结果（图 3）。然而，几个亚科在基因组网络中形成了不同的簇，最明显的是Ca.Mehrvirinae（Ca.Aineviridae）和Ca. Nitavirinae（Ca.Utuviridae），以及Ca.Mataharivirinae（Ca. Hathorviridae）（图 2c）。表明这些类群的蛋白质含量不同，反映了其环境和细菌宿主（图 4a、b）以及GC含量存在差异。假定的辅助代谢基因在Ca. Heliusvirales中很常见，存在于78.1%的基因组中（图 4c），但没有发现明确的科或亚科特异性辅助代谢基因。  图2 作为一大类肠道噬菌体，Ca.Heliusvirales存在不同的亚群  图3 基于每个科和亚科的基因组成对全基因组比较，垂直线展示了tBLASTx相似性  本研究在各大洲都发现了Ca.Heliusvirales TerL基因（图 5a），表明它们分布广泛。事实上，对来自 38 项研究的5441个个体的7166个人类肠道宏基因组的分析发现，在4467个个体中发现了Ca.Heliusvirales TerL 基因（82.1%，图 5b）。本研究假设Ca.Heliusvirales与人类肠道存在古老的关联。为了探索这一点，分析了来自奥地利和北美古粪便的宏基因组鸟枪法测序数据集。来自美国和墨西哥三个不同地点的北美样本中，公元 10 年至 920 年之间发现了34个Ca.Heliusvirales TerL基因（图 5a）。Ca.Heliusvirales在多个前殖民时期的北美人中存在，这意味着它们在人类迁移到美洲之前（约 15,000 年前）是人类肠道微生物组的一部分。用两个主要Ca.Hathorviridae亚科的时间测量系统发育树证实了这一假设，其中包含与人类肠道密切相关的Ca.Mataharivirinae。具有古代北美序列和现代人类肠道序列的发育树表明，Ca.Mataharivirinae和Ca.Ravirinae大约210,000至250,000年前开始多样化（图 5c）。这大约是智人最早出现的时间，表明这些噬菌体自遥远的过去就一直是人类肠道生态系统的一部分。为了进一步探索古老、非城市化和城市化生活方式与Ca.Heliusvir之间的关系，将它们与来自城市化和非城市化人群的样本进行了比较。与古代人相比，城市化人群中的Ca.Heliusvirales丰富度显著高于狩猎采集者和古人，但在狩猎采集者和古人之间没有显著差异（图 5d）。有趣的是，这与整体肠道细菌丰富度相反，肠道细菌丰富度随着城市化而降低。丰度在三个群体之间没有显著差异。进一步分析了城市化、狩猎采集者和古代样本中的TerL基因。NMDS表明，所有三个种群（城市、狩猎采集者、古人）都有不同的Ca.Heliusvirales种群（图 5e）。在古代样本中，Ca.Xiheviridae科的分布比现代狩猎采集者和城市化人群更加普遍（图 5f）。Ca.Ghrianvirinae（Ca.Utuviridae）同时在古代和现代狩猎采集者中更普遍。  为了研究更广泛的疾病，基于TerL标记基因，在不同人类来源样本中鉴定Ca.Heliusvirales序列。研究发现，十二种疾病中的四种中，Ca.Heliusvirales的丰富度在Ⅰ型糖尿病（T1D）、Ⅱ型糖尿病（T2D）、炎症性肠病（IBD）和肝硬化的样品中显著改变（图 6a）。在前三者中，与健康对照组相比，丰富度升高，而在肝硬化样品中，丰富度降低。此外，在Ca.Heliusvirales的丰度方面，这些噬菌体的种群在四类样品中也存在差异（图6b）。健康对照者与T1D、T2D、IBD和肝硬化患者之间的亚科水平差异上体现在不同的患病模式中（图 6c）。与古代、现代狩猎采集者和现代城市化人群之间的差异类似（图 5f），Ca.Xiheviridae噬菌体在T1D和T2D患者中比对应的健康个体更普遍，但在IBD或肝硬化中不常见。Ca.Ghrianvirinae在现代城市化人群中的普遍性低于现代狩猎采集者或古代人，在T2D患者中比对照组更普遍，但在其他患者中不普遍。除了这两个之外，Ca.Tilevirinae与对照相比显著多于T1D和T2D，并且显著少于IBD和肝硬化。观察到类似的Ca.Heliusvirales在城市化人群与非城市化人群中以及在T1D/T2D患者与健康对照者中稀缺，这可能表示某些细菌分支与城市化程度的增加明显相关。  图6 Ca.Heliusvirales与许多疾病相关 结论 本研究收集了大量的宏基因组噬菌体contig和公共数据库的噬菌体完整基因组序列，通过去冗余和标记基因的识别，对Ca.Heliusvirales这一噬菌体谱系进行分析，描述了其基因组多样性和基因功能多样性。随后，与样品信息进行联系，探究了Ca.Heliusvirales中各分支与人类社会发展的联系。最后，将其与人类疾病进行相关性分析，发现其宿主的变化可能与人类疾病密切相关。该研究表明Ca.Heliusvirales噬菌体的丰度与Ⅰ型糖尿病（T1D）、2Ⅱ型糖尿病（T2D）、炎症性肠病（IBD）和肝硬化存在明显的相关性，其宿主可能和这些疾病有明显关联，为微生物群落与疾病关联研究提供数据支撑。 |
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