人工合成多肽在生物材料上的修饰进展

摘要：生物材料表面通过合适的多肽修饰可以提高材料与细胞的亲和性。本文简要地介绍了一些具有生物活性的多肽, 论述了它们的合成、在生物材料上的修饰、细胞在多肽修饰材料表面的行为等重要问题。

关键词： 多肽 生物材料 生物相容性 多肽合成 表面修饰

组织修复和替代材料伴随着现代医疗科技的进步得到了迅速发展[1, 2]。体内植入材料需要具备相当的力学强度、优异的稳定性、合理的降解周期、尽可能小的生物毒性等基本要求。而材料的生物相容性的理念已经从传统的生物惰性拓展到适度的材料与机体之间的相互作用, 相关研究变得越来越重要。如何控制细胞在材料表面的粘附、增殖、分化已经成为组织修复替代材料领域的一大热门的基础研究课题[3, 4]。

常用的生物材料本身一般不含有特定的生物活性成分, 因此不同程度地影响了细胞在其表面的粘附, 进一步影响到组织与材料界面的良好整合。要在保留材料原有物理化学特性同时改善其细胞相容性, 常常要对材料表面进行修饰[5-7]。根据仿生学原理, 蛋白质和多肽类物质往往具有特定的生物信号, 能够显著改善细胞在其表面的粘附等行为。胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白在生物材料修饰上的应用已有不少报道, 修饰后的材料在动物体内实验中也取得了一定的成功[8-11]。但是蛋白质源自生物活体组织, 容易引发患者的免疫反应, 存在被未知病毒感染的风险;另外蛋白质在修饰过程中容易变性, 在生物体内更易被酶解, 因此其稳定性并不高, 这些问题限制了其大规模的应用。而同样由氨基酸构成的多肽却可以克服以上缺点, 它们的结构更简单、稳定性好、易于消毒和储存[12]。一些特定的氨基酸序列往往具有显著的细胞响应, 在材料表面修饰上人工合成的这些多肽分子, 其作用更直接、效率更高。局部的选择性的多肽修饰可以达到对特定细胞的选择性粘附的效果, 更加有利于材料表面的细胞控制和复杂组织的精确构建。人工合成多肽还可以进行环化;环状多肽具有较强的抗水解和酶解能力, 稳定性大为提高[13]。

1 生物活性多肽的主要功能

多肽是由氨基酸通过酰胺键连接而成的分子。部分含有特定氨基酸序列的多肽具有生物学活性。具有生物活性功能的多肽种类很多。以下我们根据它们的功能和作用机制作简要介绍。

1.1 具有抗菌作用的多肽

自然界中的微生物之间存在着生存竞争, 有些细菌能够分泌一些多肽物质抑制其它细菌的生长。如乳酸链球菌能够分泌一种多肽Nisin, 抑制革兰氏阳性菌的生长。Nisin分子结构中包含双脱氢丙氨酸、双脱氢丁氨酸、羊毛硫氨酸、3-甲基-羊毛硫氨酸和氨基丁酸等稀有氨基酸, 它们通过硫醚键形成五个内环, 其活性分子常为二聚体或四聚体。疏水的Nisin是带正电荷的阳离子分子, 能够吸附在敏感菌的细胞膜上, 通过C端侵入细胞膜内, 形成离子通道, 破坏细菌膜内的离子平衡而使其死亡。杆菌肽 (Bacitracin) 是另一种应用广泛的抗菌肽, 它能够与细胞膜上脂质体结合, 将肽聚糖转移到细菌内, 从而干扰和阻断细胞的生理活动[14, 15]。

1.2 具有镇静作用的多肽

自然界中某些含特殊序列的多肽分子, 对生物体具有镇静作用。例如, 牛奶中的β-酪啡肽具有安神镇静的功效。与其它化学镇静剂相比, 生物多肽用量少, 药物依赖性小, 呼吸抑制副作用小, 因此已经在药物领域引起了关注。人工合成的脑啡肽 (如YGGFM和YGGFL序列) 已经开始了应用研究。这些多肽配体具有特异性的受体[16]。

1.3 具有抗癌作用的多肽

人们已经在自然界中发现了一些具有细胞抑制作用的多肽, 例如海蛞蝓、被囊动物、海绵等海洋生物体内具有此类多肽, 因此多肽也就有可能用于抗癌制剂。哈米特林 (hemiasterlin) 、隐藻素 (cryptophycins) 、海兔毒素 (dolastatin) 等多肽能够通过对细胞微丝的解聚而阻碍有丝分裂[17]。体内研究表明隐藻素对许多移植瘤包括多药物抗性 (MDR) 细胞系具有活性, 并且有较好的水溶性和治疗效果, 而MDR是影响肿瘤化疗效果的一个非常重要的因素, 它预示此类多肽很有可能发展为临床药物。

1.4 多肽激素

生物的内分泌腺体能够分泌一些多肽激素, 直接参与新陈代谢的调控, 或者控制其它激素的分泌而实现其功能。例如著名的胰岛素 (insulin) 与血糖浓度的调控息息相关, 已成为糖尿病患者的常用药物;促甲状腺素释放素则是由脑丘体分泌的一类激素肽, 它间接控制甲状腺素的分泌。激素类多肽目前在临床上遇到的最大困难是如何保持其活性, 多肽的分子修饰是改善其稳定性的一大途径。

1.5 免疫活性肽

环孢菌素 (cyclosporine) 是降低组织器官排异反应的一类环肽药物, 通过对蛋白质循环酶的抑制达到降低免疫反应的效果, 同时还具有抗菌、消炎的作用。不过天然的环孢菌素对肾功能有较大的影响, 目前人工合成和经修饰的环肽能够减轻这些副作用[18]。白细胞介素 (interleukins) 和干扰素 (interferons) 也是免疫系统细胞分泌的重要多肽, 它们能够帮助免疫系统对外侵物 (如病毒、寄生菌等) 作出免疫反应。这些免疫活性肽在抗肿瘤和艾滋病治疗方面也有一定的功效。

1.6 增强通透性的多肽

一些小分子多肽具有细胞膜穿透能力。一些药物经过此类多肽的修饰后, 就能够顺利地被细胞吸收。这些药物载体一般是两亲性的分子, 且多带有正电荷, 易于吸附和穿透细胞膜, 这个过程与细胞的内吞作用也有关系。例如穿膜肽 (penetratin) 、tat透膜肽以及它们的衍生物可被用作新型的药物载体[19]。温龙平等人发现一种促进药物透过皮肤的环肽 (序列为ACSSSPSKHCG) , 为经皮给药提供了一种新思路[20]。

1.7 促进干细胞归巢的多肽

干细胞移植已发展为治疗恶性血液病等疾病和修复部分缺损组织的一种手段, 经静脉输入受者体内的造血干细胞需通过血管内皮细胞间隙, 准确进入骨髓血窦间的血管外空间的龛位, 即“归巢”后, 方能进行进一步的增殖、分化, 重建造血和免疫功能。这种细胞选择性的归巢行为与特定组织对干细胞能选择性地粘附某些信号分子具有一定的关系[21]。迟现抗原4、淋巴细胞功能相关抗原1、细胞间黏附分子1、P-选择素、E-选择素等蛋白质和相关多肽序列, 是影响造血干细胞归巢过程的重要信号分子[22]。

1.8 整合素结合肽

最常见的用于生物材料表面修饰的多肽为细胞膜上的整合素的配体。整合素由α、β亚单位组成, 为介导细胞粘附的重要跨膜受体, 已知有18个α亚基和8个β亚基, α、β亚基的外区组合形成24种整合素。受体可与特异性配体相结合。最常见的配体位点是精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸 (RGD) 序列。不同的整合素分子可能识别相同的短肽序列或同一配体中不同的短肽序列。配体与整合素的结合可以诱导细胞所谓的聚焦黏附 (focal adhesion) , 如图1所示。贴壁型细胞的生长和分化与其聚焦粘附状态密切相关, 细胞如果不能够很好地在材料表面粘附和铺展, 就非常容易发生细胞凋亡。整合素在介导细胞与细胞外基质 (ECM) 之间发生特异性粘附的同时, 伴随着生物信号的转导, 因此, 它对于联系细胞内外的代谢活动也起着重要作用。

图1 细胞与材料间的聚焦粘附

1.8.1 RGD序列的整合素结合肽

到目前为止, RGD是在促进生物材料表面细胞粘附上应用最为广泛、最有效的多肽序列, 因此相关的研究报道也比较多。RGD序列存在于纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白、层粘蛋白、骨桥蛋白等多种细胞外基质蛋白质。已知的24种整合素中, 有近一半能够与含RGD序列的ECM蛋白质发生作用, 如α3β1、α5β1、α8β1、αIIbβ3、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8以及α2β1和α4β1。

有趣的是, 单纯的RGD三肽几乎没有促进细胞粘附的作用。Rouslahti等人的研究发现, RGD的C端封闭后, 其促进细胞粘附的能力大大增强;而在N端增加氨基酸却没有明显的影响, 并且得到了以下RGD促细胞粘附顺序:RGD<RGD-NH2<RGDS<GRGDSP[23]。进一步的研究发现, 含RGD的环肽对细胞粘附有很好的促进作用, 易被环肽识别的整合素受体是αvβ3和αvβ5。Kessler等人研究发现cyclo (RGDf K) 和cyclo (RGDEv)在促进细胞粘附能力上均优于同序列的线性五肽[24] (这里的单字符f和v分别指D型的苯丙氨酸和缬氨酸) 。更加重要的是, 环肽首尾相接的封闭结构大大提高了其稳定性, 使得其在生物体内的活性更加持久。

不同的RGD多肽序列对整合素的结合也具有一定的选择性, 例如cyclo (RGDf V) 对αvβ3有很强的作用能力, 而GRGDSP和GRGDNP对α5β1有很强的作用力, GRGDF和GRGDY等对αvβ3和αIIbβ3的作用力较强[25]。而不同种类的细胞其整合素的相对表达量是不一样的, 比如CHO K1细胞整合素表达α5β1要高于αvβ3, 而内皮细胞更倾向于通过αvβ3与多肽进行结合[26]。因此在实际应用中, 这种细胞整合素表达差异也将影响到材料修饰时多肽序列的选择。

1.8.2 非RGD序列整合素结合肽

在细胞外基质中除了RGD多肽外, 还有许多别的多肽序列对细胞的行为产生影响。其中一些多肽也可以和RGD一样跟整合素发生作用, 如α2β1、α4β1、α4β7和αIIbβ3能够识别配体中的DGEA、EILDV、GPRP、KQAGDV序列;另一些则跟细胞膜内其他受体发生相互作用。目前相关机理的研究得还比较有限, 非RGD多肽在生物材料上的修饰应用尚不多。Hubbell等人研究了DEGA序列对神经细胞的生长影响[27], Mann等人发现KQAGDV对平滑肌细胞具有很强的促粘附作用[28], Hasenbein发现RGD与KRSR同时修饰到材料表面, 对成骨细胞的粘附能力大大优于成纤维细胞[29]。

2 多肽的合成与固定

2.1 多肽合成

由于氨基酸是一端带氨基另一端带羧基的分子, 因此普通的缩合只能得到各种氨基酸序列的多肽混合物, 获得具有精确序列的多肽分子则显得非常困难。Merrifield在多肽合成领域作出了杰出的贡献。他创立和发展了固相合成多肽的方法, 极大地简化了合成和纯化步骤, 大大提高了产率, 使各种多肽的人工合成变得可行[30]。他也因此获得1984年的诺贝尔奖。

固相合成多肽的基本步骤如图2所示。首先将N端受保护的第一个氨基酸分子通过羧基反应连接到树脂上, 侧链基团在反应中被保护基保护, 避免副反应的发生。而α氨基上的保护基可以比较容易地脱除, 树脂上肽链末端去保护后的α氨基与游离氨基酸的羧基偶合, 过量的反应物通过过滤和洗涤去除, 重复这一步骤, 就实现了氨基酸链从C向N端增长, 直到完成所需的多肽序列后, 用切割试剂将肽链从树脂上分离下来, 最后将侧链上的保护基脱除, 纯化后, 即得到一条完整的多肽链。

图2 固相多肽合成基本步骤

2.2 多肽的固定

一些多肽能够促进细胞的粘附和生长, 但这需要一个前提, 即多肽分子足够稳定地固定在材料之上。因此, 如何实现多肽固定是多肽修饰研究的重要方面。

2.2.1 直接共价连接

一般通过共价键的连接, 多肽分子能够稳定地连接到生物材料上。但有时候材料分子并不具有与多肽直接反应的官能团, 因此还需要对材料作一些修饰, 引入羟基、羧基、氨基等官能团, 就能够与多肽上的官能团反应;Cooper等人将聚氨酯 (PU) 在Na H溶液中去质子化, 进一步与β-丙内酯反应, 得到了羧基化的PU, 能够反应连接上RGD多肽分子[31]。Langer等人将聚乳酸 (PLA) 与聚-L-赖氨酸 (PLL) 共聚, RGD多肽分子通过与PLL片段上的氨基反应, 连接到材料上[32]。

2.2.2 通过偶联分子的连接

通过一些连接分子 (linker) 也可以将多肽间接地连到材料上。Mikos等人将RGD连接到聚乙二醇 (PEG) 的一端, PEG的另一端与聚反丁烯二酸乙二醇酯反应, 得到了RGD修饰的聚合物水凝胶[33]。Bankey等人将PLA和聚己内酯 (PCL) 膜用脉冲等离子体沉积的方法, 与丙烯胺反应后, 跟连有RGD的PEG反应, 获得RGD修饰的聚酯材料[34]。Marchand等人合成了一端含叠氮基团另一端为羧基的linker分子, 通过叠氮将linker接枝到PEG主链上, 羧基端则进一步连上RGD, 实现了PEG-PCL材料的RGD修饰[35]。

2.2.3 偶合反应

多肽与材料官能团之间的偶合反应有碳二亚胺、活泼酯、SPDP试剂法等途径。碳二亚胺是一类常见的缩合剂, 反应的条件温和, 常用的缩合剂有1-乙基-3- (3-二甲胺基丙基) 碳酰二亚胺 (EDC) 、N, N′-二环已基碳酰亚胺 (DCC) 、N, N-碳酰二咪唑 (CDI) 等。羧基官能团先与碳二亚胺反应生成加成中间体, 然后与另一个分子上的氨基反应脱水生成酰胺键[36]。值得注意的是, 这类反应需要对多肽进行必要的官能团保护, 否则容易发生多肽分子间的偶合副反应, 中间体易与水反应失去进一步反应的能力。

活泼酯的二步法反应能够解决以上问题, 未保护的多肽能够在水相中与其他材料发生共价连接。首先将羧基等官能团转化为活泼酯 (例如, N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 活泼酯) , 这一步反应可以在二氯甲烷 (DCM) 或二甲基甲酰胺 (DMF) 中进行, 羧基与NHS的反应采用DCC或EDC催化, 活泼酯在水溶液中具有数分钟至几小时的反应活性时间, 因此可以在水相中与RGD反应。由于第二步反应中不需要缩合剂, 避免了RGD分子间的偶合反应, 干燥后的活泼酯中间体可以存放数月保持其活性。对于官能团是氨基的分子, 可以采用N, N&apos;-二琥珀酰亚胺基碳酸酯 (DSC) 形成活泼酯, 进而与多肽反应。对于含羟基的物质, 可以采用三氟代乙烷磺酰氯 (tresyl chloride) 或者对硝基苯碳酰氯处理, 得到活泼酯也可以和RGD反应。

此外, Healy等人利用马来酰亚胺中的双键与带巯基的多肽加成反应达到修饰目的[37], Hubbell等人利用麦克尔加成反应, 将带巯基RGD连接到含丙烯酸的聚合物上[38]。

Dickinson等人采用异型双功能交联剂3- (2-吡啶二巯基) 丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯 (SPDP) , 通过其分子中的活泼酯组分与氨基反应, 然后利用巯基交换反应或巯基加成反应与多肽分子实现了偶联[39]。

2.2.4 物理涂覆

除了共价连接, 也可以将多肽与其他聚合物反应后, 物理混合到材料中。Shakessheff等人利用GRGDS与PLL反应, 将大分子产物涂覆到聚乳酸材料上, 提高了聚乳酸材料表面的细胞粘附特性[40]。Caldwell等人利用Poloxamer (PEO-PPO-PEO) 与RGD多肽反应, 涂覆在聚苯乙烯 (PS) 表面改善其生物相容性[41]。

2.2.5 自组装多肽

以上所介绍的都是将多肽分子连接在事先制备的固体材料表面。多肽本身也可以通过自组装得到纳米多肽纤维等手段而获得某种程度的固定。多肽自组装可形成棒状、盘状、片层、纳米线、纳米管等各种超分子结构, 组装单元具有一些共同特点:结构上需要一定的互补性, 分子间存在着非共价键的弱相互作用 (如氢键) [42]。Stupp等人设计了一种可自组装成纳米柱的亲/疏水多肽分子, 亲水的多肽作为分子的“头”部, “尾”端则是由N端延伸出的疏水烷烃链[43]。环肽分子也可以作为自组装单元, Ghadiri等人合成了由不同手性氨基酸残基组成的六元环肽, 分子间的氢键作用使得这种分子自组装形成纳米管, 这种管状晶体结构在水溶液和其他一些溶剂中具有很好的热稳定性[44]。张曙光等人利用多肽分子中氨基酸残基的电荷和亲疏水特性, 获得了自组装形成的多肽纳米线。细胞可粘附在这些纳米线上, 因此他们进一步制备了组织工程的多肽自组装支架材料[45]。

3 人工活性多肽修饰生物材料表面时需要注意的部分问题

首先, 虽然固定于固体材料表面的RGD等多肽有利于细胞粘附, 但实验已经证明, 游离的多肽分子非但不能起到促进细胞粘附的作用, 反而因其占据了细胞的整合素位点, 使细胞粘附能力下降, 最终导致细胞凋亡[46]。因此, 要注意减少或者除去多余的活性多肽。

当RGD修饰材料的时候, 其在材料表面的密度和排列对细胞的粘附也存在影响。Hubbell等人研究了细胞粘附行为与RGD表面修饰的密度关系, 实验得到材料表面细胞铺展所需的RGD临界密度为1 fmol/cm2, 而细胞能够在材料表面形成聚焦接触应力纤维的RGD临界密度为10 fmol/cm2[47]。此外, RGD的分布也对细胞的行为产生一定的影响, Maheshwari等人研究了材料表面均匀分布和团簇分布RGD对细胞的影响, 实验证明团簇分布的RGD更加有利于细胞形成聚焦粘附[48]。Beer等人研究了RGD多肽距材料表面的连接分子长度和细胞的粘附性能间的关系。当连接分子spacer长度达到46Å时, 细胞的粘附达到最大值[49]。RGD多肽要与细胞的整合素发生作用, 必须深入到整合素内部。此外, 不同类型的整合素在细胞膜上的位置也不一致, 因此spacer临界长度跟受体/配体的结合类型也有关系。

细胞由材料表面向内部生长迁移也是组织工程的一个课题, RGD修饰的材料表面也会影响到细胞的迁移行为。Lauffenberg等人研究了两者的关系[50], 由于细胞迁移同时包含了聚焦粘附和解粘附的过程, 因此在较低的RGD密度下, 随着RGD密度的增加, 细胞容易建立新的聚焦粘附, 迁移加快;随着RGD密度的进一步升高, 细胞聚焦粘附过于紧密, 导致解粘附力增大, 细胞迁移的速率反而降低。

另外, 有时候在设计RGD多肽序列时就需要考虑到它跟材料的下一步连接问题。在绝大多数情况下, 多肽是通过N端的氨基与材料进行化学共价连接的, 在一些情况下, 某些氨基酸N端空间位阻效应大, 反应效率下降。因此也有多肽引入赖氨酸残基, 用其侧链α氨基与材料进一步连接[51]。

4 总结

多肽作为一类具有生物活性的分子, 近年来在疾病治疗和组织修复等医学领域得到了广泛的关注和应用。自从固相合成发明以来, 多肽的合成和纯化步骤被大大地简化了, 各种不同序列多肽的生产已经成为现实。人工合成多肽用于生物材料修饰, 避免了生物来源的蛋白质的免疫风险, 在简化结构的同时, 保持了高效的生物活性。通过各种物理化学手段, 多肽分子已经能够在各种聚合物和无机材料表面进行修饰。多肽修饰使生物材料能够在保持原有力学和物理化学特性的前提下, 大大改善其生物相容性, 同时有利于控制细胞在材料表面的行为, 实现更加精确的组织构建。未来的研究中, RGD多肽在组织工程三维支架以及可注射水凝胶上修饰的实用化还有待于深入, RGD以及其他多肽与细胞整合素的相互作用机理仍存在进一步研究的空间。随着材料和纳米技术的发展, 材料表面多肽修饰的控制往更精细方向发展, 在细胞粘附和组织构建领域将带来更深远的影响。

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