酸敏性PEG载体的合成及其在多肽合成中的应用

摘 要:本文通过聚苯乙烯固载聚乙二醇氨基树脂与对羟甲基苯氧乙酸缩合制备了具有酸敏手臂结构的对羟甲基苯氧乙酰胺PEG树脂(简称PS-PEG-HMPA)。在合成中改进了PS-PEG-NH₂树脂的制备方法，提高了树脂上功能基的转化率，不必进行封闭剩余活性基的操作，就得到具有单一功能基的树脂。以此树脂为载体，运用Fmoc保护化学固相肽合成方法，合成了白蛋白八肽片段KQTALYYC。纯化后的肽用HPLC进行纯度分析。氨基酸组成分析的实测值也与理论值相符合，确证了产物的均一性。

关键词：酸敏性载体 PEG树脂 固相多肽合成 Fmoc保护化学

固相合成多肽的成功依赖于许多因素，载体是其中最根本、最关键的一个。近十几年来，为了改进传统使用载体骨架的非均相性问题，发展了一系列聚苯乙烯固载聚乙二醇树脂载体[1~4],这种类型载体有良好的亲水性能，兼具了固相合成与液相合成的优点，提高了缩合反应的速度和产率，是固相法合成多肽的理想载体。目前，这种载体主要用于长肽链和疏水肽的合成，特别是用作连续流动肽合成(Continuos Flow Peptide Synthesis)的载体[5~8],其性能与作用是一般聚苯乙烯载体无法替代的。

此外，人们还根据需求对载体进行了各种修饰，主要是进行功能基转化或者在功能基上接一个手臂结构(Handle)或连接分子(Linkage)[7，8]。这种结构具有很重要的作用。首先通过手臂上的某些基团的电子效应调节肽链与载体形成的化学键对酸、碱、光照等切割条件的敏感度，以期获得完全自由或部分保护的肽段；其次肽与载体形成的键较原来的苄酯键稳定，以避免在接肽过程中肽链的过早脱落及切割反应中使用强酸引起的副反应;第三，手臂的空间隔离作用(PEG链也可视为手臂结构)在相当程度上增加了增长着的肽链与载体的相容性，有利于缩合反应的进行。我们可以根据不同的N端保护基，把载体体系分为叔丁氧羰基保护基化学(简称为N-Boc),芴甲氧羰基保护基化学(简称为N-Fmoc)及其它保护基化学三种类型。Fmoc作为碱敏保护基团，因其有较多的优越性，近年来得到广泛的应用，与之相适应的各种酸敏手臂结构也不断地设计出来[10,11]。应用Fmoc保护化学方法，在较温和的酸切割条件下可获得自由的，部分保护的或完全被保护的多肽，这可以通过调节酸的浓度，选择适宜的手臂结构来达到。特别是可获得完全被保护的多肽这一功能，顺应了目前越来越广泛采用的肽片段缩合的需要。

为了发展新型载体，改进固相合成方法，在过去对PS-PEG载体研究的基础上，本文中我们把酸敏性手臂结构和PEG链同时引入聚苯乙烯骨架中，合成了对羟甲基苯氧乙酰氨PEG树脂(4-hydroxymethylphenoxyamide PEG resin,简称PS-PEG-HMPA)。以此树脂为载体采用Fmoc化学方法合成了白蛋白特征片段NH₂-Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-Tyr-Tyr-Cys-COOH。然后将与有关单位合作，通过合成的白蛋白八肽制备抗糖化白蛋白的单克隆抗体，最终建立糖化白蛋白的免疫测定和糖尿病的监测方法。本文得到的肽树脂在95%TFA条件下切割，获得了较高的产率。纯化后的产物经HPLC鉴定，得到了多肽单一峰，证明了产物的均一性，氨基酸分析的实测值与理论值基本相同。实验结果表明PS-PEG-HMPA可以作为一种新型酸敏载体使用。

1 实验部分

1.1 酸敏性PEG载体的合成

PS-PEG-HMPA载体的合成路线如下：

1.1.1 手臂结构-对羟甲基苯氧乙酸的制备

1.对甲酰基苯氧乙酸的制备

20g(0.164 mol)对羟基苯甲醛，24.7g(0.233 mol)Na₂CO₃,55 ml H₂O加入到反应瓶中，搅拌下加热至70℃,反应0.5h。145.7g(1.542 mol)氯乙酸溶于212mlH₂O中，调pH值至9,滴加至反应瓶中，80℃反应24 h,冷却至室温，调pH至6,乙醚萃取完毕，调水相pH值为2,沉淀后抽滤，得淡黄色沉淀。热水重结晶，得淡黄色针叶状晶体18.0g。测熔点：194-196℃,文献值：198℃[18]。

2.对羟甲基苯氧乙酸的制备

反应瓶中加入13g(0.071mol)对氧乙酸苯甲醛，1mol/LNaOH溶液71.4 ml(0.071mol),甲醇70ml,搅拌。分批加入NaBH₄2.8g(0.071 mol),室温下反应2.5 h。反应完毕，调溶液pH值至2~3。乙酸乙酯萃取，用Na₂SO₄干燥乙酸乙酯层，然后旋转蒸发除去乙酸乙酯得白色粉末，用乙酸乙酯重结晶，得到白色针状晶体9.4 g,测熔点：110-113℃,文献值：111.0-112.5℃[19]。

1.1.2 氨基PEG树脂的制备

1.苯乙烯-二乙烯苯共聚物(S-DVB)的氯甲基化

按参考文献[12]进行。电位滴定法测定氯含量[13]。

2.PEG羟基树脂的制备

按文献[1]进行。准确称恒重后产品的重量，测定氯残留量，羟基含量[14],计算反应产率及PEG固载量。

3.PEG树脂的羟基氯化

在N₂保护下，3.2 g PEG树脂(OH含量0.389 mmol/g)于70 ml DCM,20 ml吡啶中溶胀0.5 h,然后加热至42℃回流。回流温度下缓慢滴加二氯亚砜1.71 ml,温度降至40℃,此温度下回流20 h。抽滤，树脂依次用DCM,THF/H₂O浸泡，洗涤，最后水洗至无CI,晾干，真空干燥，测氯含量。

4.氯化PEG树脂的氨化

氯化PEG树脂于二甲基甲酰胺(DMF)中浸泡后，加入9g邻苯二甲酰亚胺钾盐，N₂保护下加热至回流温度，反应5h,降温至120℃反应3 h。冷至室温，抽滤，乙醇洗涤后，转移至另一反应瓶中。 反应瓶中加入无水乙醇80 ml,水合肼62.2 ml,N₂保护下83℃反应10 h,冷至室温，抽滤，依次用乙醇，水洗涤，抽滤，真空干燥，水杨醛法测氨基含量[15]。

1.1.3 酸敏树脂的合成

2.9 g PEG氨基树脂(0.914 mmol)于20 mlDMF中溶胀0.5 h,然后加入对羟甲基苯氧乙酸的HOBt活化酯(4.703 mmol),搅拌下反应17 h,抽滤，树脂依次用DMF,DCM洗涤，晾干，真空干燥至恒重。水杨醛法测氨基残留量，由此计算功能基含量。

1.2酸敏性PEG载体在白蛋白肽段合成中的应用

1.2.1 Fmoc-Cys(Trt)树脂的制备

1,891g Fmoc-Cys(Trt)溶于.10 ml DCM/DMF(8:3),加入到1.63 ml 1mol/LDCC/DCM溶液中，隔绝湿气下反应1 h。滤除沉淀后将得到的对称酸酐溶液加入已溶胀好的树脂1.704g(OH:0.316 mmol/g)中，室温下搅拌反应15 min。加入DMAP0.0073 g,缩合反应30 min。抽滤，依次用DMF,i-PrOH,DCM洗涤树脂，真空干燥至恒重。

半胱氨酸取代量的测量是：首先取少量(约8mg)树脂样品依次于5%和20%哌啶(Piperidine)/DCM-DMF(1:1)溶液中脱保护基，室温反应时间分别为15min和20 min,抽滤，树脂依次用DMF,MeOH,DCM洗涤，各洗3次，3 min/次，真空干燥至恒重，然后水杨醛法测氨基含量。

1.893 g(AA:0.357 mmol/g)Cys(Trt)-树脂于19mlDMF中溶胀15 min,然后加入0.44ml苯甲酰氯，搅拌3min后，加入0.31 ml吡啶，0℃下搅拌反应2h。抽滤，树脂依次用DMF,MeOH,DCM各洗6次，1.5 min/次。真空干燥至恒重。

1.2.2 白蛋白肽段的合成

按通常Fmoc化学合成步骤，在多肽合成瓶中对Fmoc-Cys(Trt)树脂(1.917 g,Cys含量：0.357 mmol/g)依次进行脱保护(20%Piperidine/DMF),洗涤等步骤后，加入3倍于半胱氨酸取代基含量的Fmoc-Tyr(tBu)的HOBt活化酯，2.5倍于取代基含量的DCC溶液进行缩合，并加入10%的DIEA催化反应。连接以下各个氨基酸的步骤同Tyr,直到完成所要求的序列Fmoc-Lys(Boc)-Gln-Thr(tBu)-Ala-Leu-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-肽树脂。多肽合成操作步骤见表1。使用Kaiser方法对接肽过程中缩合反应程度进行定性监测。

1.2.3 肽树脂的裂解反应

肽树脂0.629 g首先用20%Piperidine/DMF脱保护，用MeOH,DCM洗涤完毕后，真空干燥过夜。冰浴下加10 ml切割液(EDT:去离子水：TFA=1:1:38),室温下反应1.5 h。抽滤后树脂与反应器用少量TFA和10倍于TFA的DCM洗涤(4次),与滤液合并后旋转蒸发至1~2ml,然后用1%醋酸水溶液稀释(滴加),等量乙醚萃取水层(4次),旋转蒸发水层，冷冻干燥，得粗品肽。

1.2.4 肽的纯化

粗肽用反相C硅胶柱色谱纯化，流动相为60%的甲醇水溶液(含0.2%TFA),固定相为Cja硅胶(使用前在甲醇中减压脱气),洗脱速度为0.67 ml/min,UV254 nm进行检测。加样后，收集洗脱曲线主峰的组分，经旋转蒸发后，冷冻干燥，得半纯化肽。

1.2.5 肽的纯度及组成分析

肽的纯度通过反相高效液相色谱鉴定，色谱条件为：色谱柱Nova-Pak18,流动相36%甲醇-水恒浓度洗脱，流速1ml/min,检测波长210nm。

经过HPLC鉴定的产品在6 mol/L(含1%的苯酚),氮气保护下，110℃反应22 h,水解后的样品做氨基酸组成分析，氨基酸分析固定相为2619F(磺酸型聚苯乙烯树脂),流动相为不同pH值的柠檬酸钠缓冲液，梯度淋洗，流速为0.75 ml/min。

2 结果与讨论

2.1酸敏载体的合成

2.1.1氨基PEG树脂的制备

在S-DVB共聚物进行氯甲基化反应时，通过调节SnCl₄的加入量及反应时间，可以得到不同氯含量的氯甲基化树脂(表2),便于选择适当载量的树脂进行后面的反应。

采用氢化钠法制备了PS-PEG树脂，表3结果表明PEG链已载到树脂上。羟基含量低是因为部分PEG链发生了环化。

以往文献中制备氨基PEG树脂的第一步是把PEG树脂羟基转化为对甲苯磺酸酯。由于对甲苯磺酸基的较大位阻效应，使其对PEG末端羟基的亲核取代较难进行，造成羟基转化不完全。通常，为避免未转化羟基对后面接肽反应的影响，人们采用封闭的方法，这样就带来一些问题：一方面增加了反应步骤；另一方面由于位阻效应，不能保证封闭的完全性及在后面反应过程中封闭基团的稳定性。为了解决这个问题，我们做了改进，用SOCl₂作氯化剂对羟基进行直接氯化。由表4可知，羟基的转换基本完全。采用新的方法得到的树脂其转换后氯含量超过了原羟基含量和残余氯含量的总和，原因是由于氯化时间较长，产生的氯化氢作用于PEG树脂上环化的PEG链，使其与聚苯乙烯连接处的苄酯键发生断裂，生成了氯甲基，同时生成的PEG末端羟基会进一步为SOCl₂所氯化的缘故。虽然氯含量偏高，但由于未引进新的功能基，不会对后面的反应造成影响，可以通过缩短氯化反应时间来减少开环反应的发生。

表5为PEG氨基树脂功能基含量，为使邻苯二甲酰亚胺化的PEG树脂充分水解，我们重复两次水合肼水解。结果表明，延长反应时间对水解产率影响不大，这是由于邻苯二甲酰亚胺的大基团位阻效应使水解反应并不能进行完全，但未水解部分不存在活性基团，且是稳定的，对后面的接肽反应没有影响。表5中残留氯含量数据极低，说明采用新方法制备氨基PEG树脂是可行的，中间省去了各步封闭反应，最后得到具有单一活性基团一氨基的PEG树脂，这是传统的方法所不能达到的。

2.1.2 酸敏树脂的合成

我们采用HOBt/DCC活化酯法把手臂结构键连到PEG氨基树脂上，获得所需载体。水杨醛法测定其残留氨基含量为0.0057 mmol/g,在此法的误差范围之内，显示PEG树脂的氨基与对羟甲基苯氧乙酸反应基本定量完成。

2.2 白蛋白肽段的合成

由于树脂与第一个氨基酸相连的功能基为羟基，酯化不易进行，所以这里采用DCC/DMAP对称酸酐法来完成。经一次连接，获得氨基酸树脂取代基为0.357 mmol/g。对于PEG树脂(特别是经过修饰的)高载量将不利于后面接肽反应进行，所以我们得到的0.2-0.3 mmol/g的取代量是比较适宜的。随后的氨基酸逐步缩合反应是采用HOBt/DCC活化酯方法，并通过反应一段时间后，加入10%DIEA/DCM来催化反应进行。

反应的完全程度是通过茚三酮显色方法进行定性和半定量检测。并采用此方法对接肽缩合反应进行跟踪，与文献中相同类型酸敏载体进行比较，在Fmoc-Gln与肽树脂的缩合时，我们合成的PEG树脂有较高的反应速度，这是因为载体中PEG亲水链的引入改善了接肽反应环境，s由于PEGn链的溶剂化作用，反应接近于均相，较之PS酸敏载体，反应更容易发生，所以PEG树脂具有良好接肽性能。

对于酸敏性载体，肽链可以在95%TFA作用下从载体上脱落下来，肽链上的各种侧链保护基同时被脱去，最后得到自由肽。由于叔丁基、叔丁羰基、三苯甲基的存在，容易产生许多副反应，需在切割液中加入EDT作为清除剂。95%TFA下树脂的切割产率为87%。

切割后得到的粗肽用反相C18柱色谱进行初步纯化。高效液相色谱图上显示了单一的峰。表6列出了合成的八肽的氨基酸组成分析。这里由于半胱氨酸酸性水解时被破坏，无法给出实测值。谷氨酰胺水解后变为谷氨酸，所以谷氨酸对应值为谷氨酰胺的。从表中看到，氨基酸分析的实测值与理论值相当接近，证明了产物的均一性。

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