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大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。 组蛋白修饰对染色质功能具有关键调控作用，影响组织分化和癌症发生等生物过程。游离细胞DNA（（cell-free DNA, cfDNA）是血浆中的非随机片段化DNA，来源于多种组织的细胞死亡。cfDNA片段化模式，如片段大小、末端基序（end motifs）等，与cfDNA的组织起源密切相关。然而，现有的cfDNA分析方法，如亚硫酸盐处理或免疫沉淀法，存在DNA丢失和实验复杂性高的问题。因此，开发一种基于cfDNA片段组学的分析方法，用于推断组蛋白修饰水平，具有重要的研究和临床意义。 近日，香港中文大学卢煜明教授团队开发了一种基于cfDNA片段组学（fragmentomics）的分析方法，这种非侵入性评估组蛋白修饰的方法可以推断cfDNA的组织起源以及相关的病理状态。这种方法不仅能够用于健康个体的组织贡献分析，还能在病理状态下（如癌症和血液疾病）检测相关组织的DNA贡献。研究通过分析cfDNA的片段大小和末端基序，成功检测了组蛋白H3K27ac和H3K4me3的修饰水平，并展示了其在非侵入性产前检测、器官移植监测、血液疾病诊断和癌症检测中的潜在应用。相关研究成果以《Histone modifications of circulating nucleosomes are associated with changes in cell-free DNA fragmentation patterns》为题发表于《美国国家科学院院刊》（PNAS）。
标题：Histone modifications of circulating nucleosomes are associated with changes in cell-free DNA fragmentation patterns（循环核小体的组蛋白修饰与cfDNA片段化模式的变化相关） 发表时间：2024-10-9 发表杂志：PNAS 影响因子：9.4/1区 技术平台：cfChIP-seq（易基因金牌技术） 本研究团队开发了一种通过鉴定与候选组蛋白修饰相关的特异性片段化模式来分析不同组织DNA对血浆相对贡献的方法，并将其命名为基于片段组学的组蛋白修饰分析（FRAGHA）。推断出胎盘特异性组蛋白H3K27ac信号与孕妇血浆中的胎儿DNA比例高度相关。推断出肝脏特异性H3K27ac信号与肝移植受者的供体来源DNA比例相关，并且在肝细胞癌（HCC）患者中显著增加。在β-地中海贫血和结直肠癌患者中，分别观察到红细胞特异性和结肠特异性H3K27ac信号显著升高。此外利用组织特异性H3K27ac区域的片段化模式，研究团队开发了一种机器学习算法以增强HCC检测能力，其曲线下面积（AUC）达0.97。研究团队分析结果揭示发现H3K27ac或组蛋白H3K4me3的基因组区域表现出不同cfDNA片段化模式。本研究阐明了cfDNA片段组学与组蛋白修饰之间的关系，从而扩展了液体活检技术手段。 总之，本研究结果表明组蛋白修饰与血浆中cfDNA的片段化模式变化密切相关。这种相关性为通过非侵入性cfDNA分析推断与生理或病理过程相关的组蛋白修饰提供了基础。从生理学角度看，这种方法可以通过分析孕妇的血浆来非侵入性评估胎盘中的组蛋白修饰。从病理学角度看，这种方法能够实现癌症和血液疾病的非侵入性检测。本研究加深了对cfDNA片段组学生物学的理解，并扩展了液体活检的诊断手段。 研究方法
图1：FRAGHA分析示意图 结果图形（1）H3K27ac水平与cfDNA片段大小之间的相关性，并推断H3K27ac水平研究团队利用cfChIP-seq测序分析结果揭示，随着H3K27ac信号水平的增加，cfDNA片段在50-150bp、230-350bp和420-500bp范围内频率逐渐增加，而在160-225bp和360-400bp范围内频率则呈现相反模式。这些片段大小与H3K27ac信号高度相关，表明cfDNA片段大小模式可以作为H3K27ac水平的推断指标。 同时，研究人员构建了一个线性回归模型，基于片段大小推断血浆中的H3K27ac水平。在五个健康对照样本中，通过比较片段大小推断的H3K27ac信号与cfChIP-seq检测的实际H3K27ac信号，发现两者具有良好的一致性。尤其是230-350bp范围内的片段频率能够最准确地预测实际的H3K27ac信号。
图2：cfDNA片段大小模式与通过匹配样本的cfChIP-seq测序检测的循环核小体H3K27ac信号之间的相关性。
(B-F) 在这549个不同H3K27ac信号水平的区域类别中，特定大小范围内的cfDNA分子比例与通过cfChIP-seq测序确定的H3K27ac信号相关性。这些大小范围包括50-150bp（B）、160-225bp（C）、230-350bp（D）、360-400bp（E）和420-500bp（F）。 (G-K) 对于另外五名健康对照受试者，通过片段大小和cfChIP-seq测序推断的18种组织特异性区域中的H3K27ac信号的相关性。 （2）H3K27ac相关信号的组织起源分析研究者利用妊娠模型分析了胎盘特异性H3K27ac修饰区域的推断信号与胎儿DNA比例之间的关系。结果显示胎盘特异性H3K27ac信号与胎儿DNA比例高度相关。同样在肝移植受者中，肝脏特异性H3K27ac信号与供体来源的DNA比例也高度相关。表明推断的H3K27ac信号可以用于追溯cfDNA的组织起源。
图3：组织特异性H3K27ac相关信号可以反映妊娠和肝移植模型的血浆中组织DNA贡献。
图4：利用组织特异性组蛋白修饰区域的片段大小推断H3K27ac相关信号分布。测序后的cfDNA分子来自38名健康对照个体。H3K27ac相关信号通过230-350bp范围内的分子大小频率推断。 （3）血浆中推断H3K27ac相关信号的临床应用研究人员进一步探讨了推断的H3K27ac信号在临床应用中的潜力。在β-地中海贫血患者中，红细胞特异性H3K27ac信号显著高于健康对照组。在肝细胞癌（HCC）患者中，肝脏特异性H3K27ac信号也显著升高。在结直肠癌（CRC）患者中，结肠特异性H3K27ac信号也显著升高。这些结果表明，推断的H3K27ac信号可以用于检测血液疾病和癌症。
图5：通过cfDNA片段化模式推断H3K27ac相关信号的临床应用。
(C-D) 健康受试者（n=8）、有（n=4）和无（n=7）肝脏转移的结直肠癌（CRC）患者的结肠特异性区域和肝脏特异性区域中的推断H3K27ac相关信号。 （4）cfDNA末端基序分析对H3K27ac相关信号的推断，并通过组织特异性H3K27ac修饰相关的片段大小和末端基序联合分析用于癌症检测。研究者还分析了cfDNA片段末端基序与H3K27ac信号之间的关系。分析结果表明特定的4-mer末端基序（如CCGG、CCGC等）在H3K27ac信号高的区域中频率显著高于信号低的区域。基于这些末端基序，研究者构建一个线性回归模型用于推断H3K27ac信号。结果显示，胎盘特异性H3K27ac信号与胎儿DNA比例和肝脏特异性H3K27ac信号与供体来源的DNA比例均具有显著相关性。 此外，研究者开发了一个整合了片段大小和末端基序数据的支持向量机（SVM）模型用于癌症检测。在包含34名HCC患者、17名HBV携带者和63名健康对照的队列中，该模型能够高效区分HCC患者和非HCC患者，AUC达0.97。在另一个独立队列中，AUC也达到0.93。这表明整合片段大小和末端基序的联合分析方法在癌症检测中具有较高准确性。
图6：通过cfDNA末端基序分析推断的H3K27ac相关信号分析。
（5）通过 cfChIP-seq分析cfDNA 片段模式的H3K4me3修饰研究者还分析了H3K4me3修饰与cfDNA片段大小之间的关系。结果显示，230-350bp范围内的片段频率与H3K4me3信号高度相关。在HCC患者中，肝脏特异性H3K4me3信号显著升高。此外，研究还发现H3K27ac和H3K4me3修饰的cfDNA片段化模式存在差异，这为通过片段组学分析区分不同组蛋白修饰提供了可能。
图7：通过cfDNA片段化模式分析H3K4me3修饰。
易小结本研究通过分析cfDNA的片段大小和末端基序，成功推断了组蛋白H3K27ac和H3K4me3的修饰水平，并展示其在非侵入性产前检测、器官移植监测、血液疾病诊断和癌症检测中的潜在应用。这种方法为液体活检技术的发展提供了新的工具，有望在未来的临床实践中发挥重要作用。 研究也存在一些局限性 首先，不同组织中可能同时存在多种组蛋白修饰，这可能会影响推断信号的准确性。 其次，不同的DNA文库制备方法可能引入预分析偏差，影响结果的可比性。 此外，研究的样本量相对较小，需要在更大的样本队列中进行验证。 最后，虽然研究展示了片段组学分析的潜力，但其在临床应用中的实际效果仍需进一步评估。 cfChIP-seq分析在本研究中的重要作用 cfChIP-seq是本研究的关键技术之一。它通过捕获血浆中带有特定组蛋白修饰的cfDNA分子，提供了cfDNA片段化模式与组蛋白修饰水平之间的直接联系。cfChIP-seq数据不仅用于验证基于片段组学推断组蛋白修饰信号的准确性，还为研究cfDNA的组织起源和病理状态提供了重要参考。通过cfChIP-seq，研究者能够确定不同组织特异性区域的组蛋白修饰水平，从而为非侵入性诊断方法的开发奠定基础。 关于易基因cfDNA染色质免疫沉淀测序 (cfChIP-seq)技术 cfDNA（cell-free DNA）是细胞外游离DNA，主要来源于细胞凋亡、坏死以及正常细胞代谢过程中的DNA释放。通过检测 cfDNA 上的组蛋白修饰可以提供关于细胞起源、基因表达程序、病理状态和分子异质性等重要信息。cfDNA 染色质免疫沉淀测序 (cfChIP-seq)利用特异性抗体识别并免疫沉淀cfDNA上的特定组蛋白修饰，然后对免疫沉淀后的微量cfDNA进行测序分析。微量建库，不同项目需求可选择不同组蛋白修饰特异性抗体。 技术优势 微量样本需求：仅需痕量免疫沉淀后的DNA即可进行测序分析。 特异性高：cfChIP-seq通过特异性组蛋白修饰抗体精准鉴定和富集特定组蛋白修饰。 非侵入性：主要利用血浆cfDNA进行检测，是一种非侵入性技术。 应用场景 疾病诊断与分型：鉴定与特定疾病相关的组蛋白修饰模式，实现疾病早期诊断和亚型分类。 病理状态监测：监测疾病进程中组蛋白修饰变化，评估疾病的进展、治疗反应及预后。 细胞起源追踪：确定cfDNA的细胞来源，了解疾病发生过程中细胞死亡、损伤及代谢情况。 基因表达调控研究：分析cfDNA组蛋白修饰与基因表达，揭示疾病相关基因表达调控机制。
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