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BEND4 在 DLBCL 中的表达水平及预后意义通过 CCLE 数据库分析确定了表达水平升高的前 10 种细胞系（图1 A）。与良性细胞系相比，淋巴瘤细胞系中 BEND4 的表达水平更高。在 B 细胞肿瘤亚型中，弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系比其他亚型（包括伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和浆细胞骨髓瘤）表现出相对较高的 BEND4 水平（图 1 B）。接下来，比较了 TCGA 和 GTEx 数据库中 DLBCL 和正常样本的 BEND4 mRNA 水平，结果显示肿瘤中表达显著增加（p < 0.001）（图 1 C）。通过 HPA 数据库对蛋白水平进行分析显示，DLBCL 组织中 BEND4 表达水平高，且免疫组化染色阳性强度强（图 1 D）。BEND4 mRNA 和蛋白在弥漫性大 B 细胞淋巴瘤中的表达。A 从 CCLE 中筛选出 mRNA 表达水平升高的前 10 种细胞系。B BEND4 mRNA 在四种 B 细胞肿瘤亚型中的表达情况。C TCGA 和 GTEx 数据库显示，DLBCL（n = 48）的 BEND4 mRNA 表达水平高于正常对照组（n = 444）。D HPA 提供的 DLBCL 组织中 BEND4 蛋白的代表性免疫组化图像。***p < 0.001作者研究了 BEND4 对弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）患者生存的影响。高 BEND4 表达与较差的总生存期显著相关（HR = 8.66，95% CI 1.059–70.898，p < 0.05）（图 2 A）。高表达组的疾病特异性生存期（DSS）事件也更为频繁（p < 0.05）（图 2 B）。BEND4 高表达组和低表达组之间无显著的无进展生存期差异（p > 0.05）（数据未显示）。尽管没有统计学显著性，但高表达组的风险评分和死亡率均高于低表达组（图 2 C）。多变量 Cox 回归分析表明，初始治疗结果（HR = 5.930，95% CI 1.281–27.446，p < 0.05）和 BEND4 表达（HR = 10.283，95% CI 1.212–87.282，p < 0.05）是 DLBCL 的独立不良预后因素（图 2 D）。BEND4 表达对 DLBCL 患者生存的影响。A Kaplan–Meier 曲线比较高、低 BEND4 表达 DLBCL 患者的总生存率。B 比较高、低 BEND4 表达组间的 DSS 事件。C 比较高、低 BEND4 表达组间的生存时间和风险评分。D BEND4 表达及其他临床特征的多元 Cox 分析。*p < 0.05在高表达和低表达 BEND4 的组之间鉴定出 148 个差异表达基因（103 个上调，45 个下调；|Log2 FC|> 1，p.adj < 0.05）（图 3 A）。差异表达基因的 GSEA 分析显示这两组在 GO 术语和 KEGG 通路方面存在显著差异。GO 分析显示，与 BEND4 相关的基因映射到 108 个 GO 注释（|NES|> 1，p.adj < 0.05），其中 58 个呈正相关（NES > 1）和 50 个呈负相关（NES < − 1）。前五个呈正相关的 GO 术语包括染色质结构成分、核小体、核糖体结构成分、蛋白质 DNA 复合物和依赖 DNA 复制的染色质组装（图 3 B）。前五个呈负相关的术语为 T 细胞受体复合物、质膜信号受体复合物、嗅觉感觉、化学刺激检测和免疫反应调节信号通路（图 3 C）。差异基因表达和富集分析。A TCGA 中高、低 BEND4 表达 DLBCL 差异表达基因的火山图。B 显示前五个正相关 GO 术语的 GSEA。C 显示前五个负相关 GO 术语的 GSEA。D KEGG 分析中前五个正相关通路 GSEA。E KEGG 分析中前五个负相关通路 GSEA。F BEND4 表达与五个免疫调节通路的相关性分析KEGG 分析显示，与 BEND4 相关的基因在 114 条 KEGG 通路中显著富集（|NES|> 1, p.adj < 0.05），其中 92 条通路呈正相关（NES > 1），22 条通路呈负相关（NES < − 1）。与 BEND4 表达呈正相关的前五条通路包括 DNA 甲基化、复制起始处 Orc 复合物的组装、前期染色体的凝聚、RHO Gtpases 激活 PKNs 以及 HDACs 去乙酰化组蛋白（图3 D）。与 BEND4 表达呈负相关的前五条通路包括 CD22 介导的 BCR 调控、补体初始激活、FCGR3A 介导的 IL-10 合成、磷脂在吞噬作用中的作用以及 FCGR 激活（图 3 E）。此外，五个与免疫调节相关的通路——BCR 激活、BCR 信号通路、TCR 通路、补体级联反应和补体初始激活——与 BEND4 表达显著负相关（图 3 F）。TIMER2.0 分析显示 BEND4 表达与弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）中的六种常见免疫细胞亚型之间无显著相关性（图4 A）。因此，作者进一步检测了 BEND4 表达与 24 种肿瘤浸润免疫细胞之间的关系。比较高、低 BEND4 表达组的 DLBCL 样本，发现高 BEND4 表达组的细胞毒性细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和 Tgd 的浸润水平显著降低（p < 0.05）（图 4 B）。此外，BEND4 表达与嗜酸性粒细胞、细胞毒性细胞和 Tgd 的浸润水平呈显著负相关（R. < − 0.3, p < 0.05）（图 4 C）。最后，BEND4 表达与 DLBCL 中 CD38（浆细胞）、CD163（巨噬细胞）和 CD59（NK 细胞）的基因标记呈显著负相关（R. < − 0.3, p < 0.05）（图 4 D）。肿瘤免疫浸润分析。A 散点图显示 BEND4 基因表达与 DLBCL 中免疫细胞浸润的相关性，评估方法为 TIMER 2.0。B 在 TCGA DLBCL 数据集中，高与低 BEND4 表达组中 24 种免疫细胞亚型的比例。C BEND4 表达与 DLBCL 中 24 种免疫细胞亚型之间的相关性。D BEND4 表达与 DLBCL 中各种免疫细胞的基因标记之间的相关性。*p < 0.05与 DLBCL 中 BEND4 表达呈正相关的 20 个基因（R. > 0.3, p < 0.05）如图5 A 所示。使用 TCGA 和 GTEx 数据比较了这些基因在 DLBCL 和正常对照组中的表达水平。除了 BNIPL 和 LEAP2 外，其余 18 个基因在 DLBCL 中的表达显著高于对照组（p < 0.05）（图 5 B）。通过时间依赖性 ROC 分析评估了 BEND4 及相关基因在 DLBCL 中的死亡风险预测价值，使用 AUC 阈值> 0.7。13 个基因显示出对 1 年、3 年或 5 年死亡风险的预测价值（表 1 ），其中 BEND4、COL11A2 和 CALCB 是最可靠的预测因子，在所有时间点均具有连续 AUC > 0.7（图 5 C–E）。然而，与 BEND4 负相关的 20 个基因在 DLBCL 中未显示出显著的临床价值（数据未显示）。BEND4 相关基因分析。A TCGA 中与 DLBCL 中 BEND4 表达正相关的 Top 20 基因。B DLBCL 与正常对照组中与 BEND4 正相关的基因 mRNA 表达比较。C-E ROC 分析显示 BEND4、COL11A2 和 CALCB 基因在 1 年、3 年和 5 年时准确预测 DLBCL 患者的死亡风险，AUC > 0.7。*p < 0.05，***p < 0.001使用 STRING 数据库发现了 10 个与 BEND4 相互作用的蛋白，并利用 CytoHubba 构建了 BEND4 的蛋白-蛋白相互作用网络（图6 A）。通过时间依赖性 ROC 分析，使用 AUC 阈值>0.7，LRRC66、SHISA3 和 SLC30A9 基因显示出对 DLBCL 1 年、3 年或 5 年死亡风险的预测价值（图 6 B）。此外，这三种基因在 DLBCL 中的表达显著高于对照组（p < 0.05）（图 6 C）。BEND4 相互作用蛋白分析。A BEND4 的蛋白质-蛋白质相互作用网络。B ROC 分析显示 LRRC66、SHISA3 和 SLC30A9 基因在 1 年、3 年或 5 年时准确预测 DLBCL 患者死亡风险，AUC > 0.7。C DLBCL 和正常对照组中 LRRC66、SHISA3 和 SLC30A9 基因的 mRNA 表达比较。***p < 0.001作为一种新的 BEN 结构域分子，关于 BEND4 在肿瘤中作用的研究仍然有限。CancerSEA 数据库中的功能分析仅涵盖了四种肿瘤类型：多形性胶质母细胞瘤（GBM）、胶质瘤、慢性粒细胞白血病（CML）和视网膜母细胞瘤（RB）。一个气泡图展示了这些癌症中 BEND4 表达与 14 种功能状态之间的相关性，揭示 BEND4 的作用可能因肿瘤类型而异（图7 A）。在 RB 中，BEND4 表达与六种功能状态显著相关，与血管生成、炎症和分化呈正相关，与 DNA 修复、细胞周期和 DNA 损伤呈负相关（p < 0.001）（图 7 B）。BEND4 的功能状态分析。一个气泡图展示了来自 CancerSEA 的四种癌症类型中 BEND4 表达与 14 种功能状态之间的相关性。B 在视网膜母细胞瘤（RB）中，六种功能状态与 BEND4 表达显著相关。***p < 0.001验证 BEND4 在 DLBCL 细胞中的表达和功能通过 qRT-PCR 证实了 DB、Farage 和 Riva DLBCL 细胞系中 BEND4 的表达，其水平显著高于正常 GM50113 细胞（p < 0.01）（图8 A）。将三种 siRNA-BEND4 序列（si-1208、si-886 和 si-1458）转染入 DB、Farage 和 Riva 细胞。仅 si-1458 显著抑制了 Riva 细胞中 BEND4 的表达（p < 0.05）（图 8 B），在 DB 和 Farage 细胞中未观察到显著变化（数据未显示）。体外分析 BEND4 表达和功能。A qRT-PCR 检测 DLBCL 细胞系中 BEND4 mRNA 表达水平。B siRNA 对 Riva 细胞中 BEND4 抑制的效率，通过 qRT-PCR 测量。C CCK-8 增殖实验显示 BEND4 抑制并未减少 Riva 细胞增殖，但显著增加了对阿霉素的敏感性。*p < 0.05 D 阿霉素和联合 si-BEND4-1458 处理 Riva 细胞的 IC50 曲线。*p < 0.05, **p < 0.01 ***p < 0.001, ****p < 0.0001进一步分析显示，si-1458 单独使用并不影响 Riva 细胞的增殖，但当与 0.1μg/ml 的阿霉素联合使用时，其增殖显著降低（p < 0.05）（图8 C）。此外，阿霉素组和联合治疗组 Riva 细胞的 IC50 值分别为 0.3302 和 0.1975 μg/ml（图 8 D），表明 BEND4 抑制增强了 Riva 细胞对阿霉素的敏感性。 总结 总之，作者的研究结果表明，高 BEND4 表达与弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）的不良预后和抑制性免疫微环境相关。此外，BEND4 表达的增加可能与 Riva 细胞的化疗耐药性相关，这表明 BEND4 可作为 DLBCL 的预后标志物和潜在治疗靶点。。
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