为了确定乳腺导管癌的单细胞空间异质性景观，作者收集了来自正常乳腺组织、DCIS、IDC 和淋巴结转移 （LM） 的 scRNAseq 样本，以及来自 IDC 的空间转录组学样本（图 1）。1 基于不同细胞类型的典型标志物，鉴定出 9 个主要细胞簇，包括上皮细胞（n = 59456）、成纤维细胞（n = 15699）、内皮细胞（n = 12906）、周细胞（n = 7733）、T&NK 细胞（n = 37403）、B 细胞（n = 17126）、浆细胞（n = 5823）、髓系细胞（n = 10942）和基底细胞（n = 9477）（图 1 B、C）。九种细胞类型在不同进展阶段的组织中表现出不同的浸润模式（图 1 D）。这可能反映了肿瘤进展过程中不同阶段的异质性微环境。CARD 是一个计算工具包，能够根据 scRNA-seq 和 ST 数据将细胞簇定位到组织切片内的空间坐标。作者应用 CARD 形成来自 scRNA-seq 的细胞类型参考，并将其映射到 ST 数据以重建空间单细胞图谱（图 1 E）。DCIS、IDC 和 LM 的空间和单细胞图谱。 答 ：描述研究设计的示意图。B：通过 scRNA-seq 分析的不同样本组中所有细胞类型的 t-SNE 降维图。 C：显示乳腺导管癌中主要细胞类型标记基因表达的气泡热图。D：条形图，显示每种单元格类型在不同组中的比例和数量。E：浸润性导管癌空间转录组学样本中 CARD 映射的细胞簇的空间定位。利用先前报道的 T 细胞亚群标记基因，作者鉴定了各种 T 细胞亚群（图 S1A，S1B，2 A）。在乳腺原位组织中，作者观察到对 TEFF 分布的偏好在侵袭过程中逐渐降低，并且 TEX 和 Treg 有富集的趋势。然而，淋巴结转移组织的免疫景观与乳腺组织不同，主要特征是富集 TFH 和 CD4 TN（图 2B）。这表明这些免疫细胞中的大多数不会随着肿瘤细胞转移而迁移。此外，作者发现了一种罕见的 T 细胞亚群，该亚群在肿瘤中很少被报道。该亚群表现出干扰素诱导基因的高表达，CCR7 的低表达以及 IRF7，IRF2 和 IRF9 等转录因子的高活性（图 S1C）。因此，它被确定为一组与干扰素反应相关的细胞，其比例很小。这种状态的细胞以前被描述为病毒反应性 T 细胞[12]，关于它们在肿瘤中的作用的报道有限。它们与 TEFF 具有相似的转录谱系（图 2 C），可能表明具有潜在的抗肿瘤作用。在所有样本中，作者观察到 CD8 TN 和 CD8 循环之间存在高度的通讯，表明它们在抗肿瘤免疫中具有协同作用（图 2 D）。T 淋巴细胞的谱系和组织分布异质性。 答 ：描绘正常组织、DCIS、IDC 和 LM 中 T/NK 细胞群的 Tsne 图。B：不同采样区域不同 T/NK 子集的相对富集。C：基于 T 细胞亚群前 50 个表达基因构建的相似性树。D：T/NK 亚群之间细胞间通讯相互作用的加权热图。E：CD4 T 细胞的发育轨迹，显示出不同的细胞类型（左）和分化潜力（右）。F：Treg 细胞的发育轨迹（左）和五种状态下细胞百分比的条形图（右）。G：显示五种 Treg 状态下 nTreg 标记基因平均表达的热图。H：不同采样区 nTreg 和 iTreg 的相对富集。I：CD8 T 细胞的发育轨迹，显示出不同的细胞类型（左）和分化潜力（右）。J：IDC 中 CD8 T 细胞与淋巴结转移差异表达基因的散点图。K：箱线图显示不同采样区域 CD8 T 细胞的 T 细胞耗竭和共刺激评分的差异。L：正常乳腺组织、DCIS 和 IDC 中 T 细胞亚群的比例差异。M：mIHC 切片揭示了 FOXP3+ CD25+ nTreg 细胞在 IDC 和淋巴结转移中的分布。作者利用单片 2 构建 CD8 T 和 CD4 T 细胞的分化轨迹。根据 CytoTrace 评分和细胞在各种状态下的分布，确定分化的开始。值得注意的是，在 CD4 T 细胞分化轨迹中，Treg 细胞的一个子集在开始时聚集，表明它们并非起源于 CD4 TN 分化（图。阿拉伯数字E、F）。进一步检查表明，该 Treg 细胞亚群表达高水平的 NRP1、IKZF2 和 IL2RA（图 2G），被认为是 nTreg 的标记基因[13\u201215]。 因此，它们属于 nTreg 亚型。作者提出乳腺导管癌中的 Treg 存在两种亚型：源自 CD4 TN 分化的 iTreg 和不源自 CD4 TN 的 nTreg。这两种亚型表现出不同的分化谱系。此外，两种 Treg 亚型之间存在组织分布异质性，nTreg 主要富集在 LM 组织中，iTreg 富集在 IDC 中（图 2H）。这表明 CD4 TN 衍生的 iTreg 介导的累积免疫抑制作用有助于在乳腺原位肿瘤中形成免疫抑制微环境，而在淋巴结转移组织中观察到 nTreg 的天然免疫抑制作用。作者使用多重免疫荧光（mIHC）观察 LM 组织中 FOXP3+ IL2RA+ nTreg 细胞的富集（图 2 M）。CD8 T 细胞的分化轨迹主要分为免疫记忆分支和免疫效应分支（图。阿拉伯数字通过对每个样本中细胞比例的计算分析，作者发现在乳腺原位组织中，CD4 TN 和 CD8 TEFF 的比例降低，而 Treg 的比例增加（图 2 L）。值得注意的是，耗尽的 T 细胞主要富集在 IDC 中（图 2B）。对所有样本的 T 细胞进行差异分析表明，浸润 IDC 的 CD8 T 细胞表达高水平的 PDCD1 和 LAG3，表明存在耗竭趋势。相比之下，LM 中的 CD8 T 细胞通常表现出幼稚和增殖的表型，其特征是 TCF7、SELL、TOP2A 和 PCLAF 的高表达（图 2 J）。GSVA 分析显示，IDC 样本的 T 细胞耗竭评分最高，而 LM 样本的 T 细胞共刺激评分最高。综上所述，作者发现乳腺原位组织中的导管癌在进展过程中逐渐形成 T 淋巴细胞免疫衰竭和免疫抑制的微环境。然而，淋巴结转移组织并未遗传这种微环境表型，表现出增殖性和幼稚样免疫微环境。作者对骨髓细胞进行了无监督聚类分析，以揭示原发性和淋巴结转移性乳腺导管癌的免疫微环境。总共鉴定了 17 个亚群（图 S2A，3 A）。IDC 中高度富集的 C0 簇表现出 ATF3、JUN 和 FOS 等基因的高表达，以及相关调节因子的高活性。该集群显示 M2 表型并被指定为应激 TAM。簇 C4 主要富集于正常组织，并表达高水平的整合素相关基因（ITGB8、ITGB1、ITGA5、ITGAV、ITGAX），鉴定为正常组织中的组织驻留巨噬细胞（TRM）。簇 C6 高表达 CD74、HLA-DQB1 和 HLA-DRB1，Ro/e 值表明其在 IDC 中富集，将其归类为 MHC-II TAM（图 3B，C）。因此，IDC 主要由各种类型的肿瘤相关巨噬细胞组成，包括 MHC-II TAM 和应激 TAM。相比之下，淋巴结转移组织主要由肥大细胞和树突状细胞浸润，包括 cDC1、cDC3 和 pDC。肿瘤中髓系细胞的表型。 答 ：Tsne 图显示正常组织、DCIS、IDC 和 LM 中的髓系细胞亚群。B：热图显示细胞吞噬作用、血管生成、细胞增殖以及 M1 和 M2 表型的分数。C：不同采样区域髓系亚群的相对富集。D：应激巨噬细胞特异性标记基因和转录因子活性的表达。E：单核细胞和巨噬细胞的发育轨迹和分化潜力。F：应激巨噬细胞在分化轨迹中的位置。G：髓系细胞亚群在正常乳腺组织、DCIS 和 IDC 中显示出比例差异。H：mIHC 图像显示正常组织，DCIS 和 IDC 组织中巨噬细胞标志物（CD68）和应激标志物（EGR1）表达。轨迹分析表明，应激 TAM 主要出现在分化的后期阶段（图。3、F）.它富含浸润性导管癌（图 3C），因此仅在肿瘤侵袭进展的晚期大量出现。此外，作者观察到在乳腺原位组织肿瘤侵袭进展过程中 TRM 比例降低，应激 TAM 增加（图 3G）。为了确认应激 TAM 在乳腺导管癌组织中的分布，作者进行了 mIHC 染色（图 3 H）。综上所述，作者发现乳腺原位组织导管癌的微环境在进展过程中逐渐积累 TAM。然而，LM 组织主要由肥大细胞和树突状细胞（如 pDC）组成，表现出独特的髓系免疫微环境。作者从样本中提取成纤维细胞，并将肿瘤相关成纤维细胞（CAF）与正常成纤维细胞（NF）区分开来（图 SXXX）。利用先前确定的 CAF 在乳腺癌中的特异性表达谱[16]，作者确定了六种 CAF 亚型：apCAF、dCAF、iCAF、mCAF、rCAF 和应激 CAF。（图 4A、B）。GO 通路分析显示，iCAFs 主要参与活性细胞质翻译，mCAFs 与细胞外基质相关，应激 CAFs 主要富集于泛素-蛋白连接酶结合途径，infCAFs 表现出病毒应答和干扰素信号传导的特征，dCAFs 主要与细胞周期调控有关，apCAFs 富集在抗原加工和呈递途径中（图 4 随后，推断了从 NF 到 CAF 的分化轨迹，以探索成纤维细胞内的动态通路变化和细胞转变。该分析表明，在 CAF 分化过程中，内皮细胞的募集和迁移增强，对 TGFB 的反应，以及 EMT 评分的增加（图 4 D，E，F）。这些观察结果表明了 CAF 激活过程中的去分化过程及其参与肿瘤微环境的建立。 值得注意的是，IDC 样本含有多种 CAF 亚型，而 DCIS 和淋巴结转移主要由 iCAF 浸润（图 4G）。此外，作者利用 pySCENIC 分析来识别可能参与 CAF 分化的调控模块（图 4H）。此外，作者验证了淋巴结转移组织中 iCAF 的存在（图 4I）。因此，IDC 代表了 CAF 亚型的更复杂和多样化的分布，而 DCIS 和淋巴结转移组织表现出相对均匀的 CAF 特征。CAF 的表征。 答 ：Tsne 图说明了正常组织、DCIS、IDC 和淋巴结转移中 CAF 的细胞亚群。B：气泡热图显示了不同 CAF 亚型特异性标记基因的表达。C：GO 通路富集分析揭示了每个 CAF 亚型中前 50 个高表达基因。D：分化轨迹描述了从正常成纤维细胞到 CAF 的进化。E：EMT 沿成纤维细胞分化为 CAF 的轨迹评分。F：热图显示基因表达沿伪时间的动态变化。G：六种 CAF 亚型的组织分布偏好。H：散点图显示了每种 CAF 亚型中调节子的具体排名分数。I：LM 组织中 iCAF 标记物 （CFD） 的 HE 图像。如前所述，浸润性导管癌作为转移前组织代表了强免疫抑制环境。它是导管癌进展中微环境成分最复杂的阶段。T 淋巴和髓系是感兴趣的两个主要免疫亚组。作者使用 CARD 重建了 IDC 样本中 T 淋巴细胞和髓系细胞的空间转录组生态位。使用 K-means 聚类，作者对浸润性导管癌的空间转录组样本的空间转录组样本进行了空间分辨的生态分型（图。5、A），并鉴定了七种亚型（图 5 B）。其中三种亚型，生态型 1、5 和 6，预后良好（图 5C，D）。值得注意的是，COX 回归分析显示肿瘤成分中生态型 1 的风险值最低，小于 1（图 5 F）。生态型 1 主要由 CD4 TN 细胞和吞噬巨噬细胞组成[图 5D，E]。因此，它可以被认为是一种有效的抗肿瘤免疫生态位。然而，CD4 TN 细胞和吞噬巨噬细胞的富集水平在 IDC 中较低（图 2A 和 3C）。因此，这种生态位结构的丧失可能导致与肿瘤进展相关的免疫启动失衡。生态亚型的空间分辨率及其与预后的关联。 答 ：显示聚类数量与总平方误差之间关系的折线图，以及间隙统计量。B：空间点聚类热力图，将其划分为 7 个生态亚型。C：具有预后意义的 3 种生态亚型的 Kaplan-Meier 曲线。D：显示每个生态位中包含的细胞类型的富集倍数变化的热图。E：具有预后意义的生态位空间分布示例。F：使用 Cox 回归计算每个生态位的生存风险值，其中生态位 1 的 HR 值最低，p 值< 为 0.05。接下来，作者通过分析转录组模式和聚类亚组来探索癌细胞的异质性。使用 InferCNV 方法，作者在 DCIS、IDC 和 LM 中鉴定了总共 24,838 个恶性上皮细胞（图。6、为了研究癌细胞在多个样本中的常见表达模式，作者建立了一种元聚类算法。最初，肿瘤上皮细胞的聚类产生了 132 个肿瘤表达模块。随后，采用分层聚类算法将这 132 个模块聚合到多个表达程序中（表 S1）。鉴定出七种不同的表达程序，代表各种细胞状态和生物学功能（图 6B）。这些包括细胞死亡（NEAT1、DDX9）、细胞质翻译（RPL7A、RPS5）、细胞周期（CENPU、PCNA）、MHC-I（HLA-A 和 HLA-B）、MHC-II（CD74、HLA-DQ1、HLA-DP1）、应激反应（JUN、ATF3、JUNB）和缺氧（LDHA、PFKP）。作者计算了所有恶性上皮的模块分数。正如作者之前观察到微环境的不同阶段一样，作者可以观察到与免疫微环境压力相对应的恶性上皮表达模块的变化（图 6C）。在从 DCIS 进展到 IDC 再到 LM 的过程中，乳腺导管癌的淋巴结转移在细胞死亡和细胞周期方面得分最高，而 IDC 则呈现相反的趋势。然而，细胞存活率的总体趋势继续增加。这些模式变化表明细胞增殖和周转在导管癌进展中的关键作用。 此外，作者观察到浸润性和转移性样本中 MHC-II 模式逐渐减少，MHC-I 也从 DCIS 下降到 IDC，表明 MHC 丢失在介导导管癌侵袭和转移中的重要作用。表达程序的推断和恶性上皮亚型的鉴定。 答 ：描述 inferCNV 推断出的所有上皮细胞的 CNV 评分的热图。B：在所有恶性上皮细胞中鉴定的表达模块。C：不同采样区域表达程序评分的变化趋势。D：t-SNE 图揭示了恶性上皮细胞内的细胞亚群。E：显示表达程序在恶性上皮亚群中分布的热图。F：显示恶性上皮亚型中免疫检查点配体表达的气泡热图。G：恶性上皮亚群在不同组织类型的分布偏好，其中 C5 增殖亚群主要分布在淋巴结转移组织中。H：恶性上皮亚群和 T 细胞亚群以及 NK 细胞之间通讯强度的热图。I：与其他恶性上皮亚群相比，C5 增殖亚群的细胞代谢途径上调。J：C5 增殖亚群的评分与较差的临床结局相关。所有恶性上皮细胞的聚类表明，大多数恶性上皮亚群表现出具有单一或多样化表达模式的特定表达程序（图。6、D、E、F）。正如作者所预期的那样，MHC 富集的 C3 亚群表现出最高强度的 MHC-I 信号通路（图 6 H）。然而，作者发现富集 MHC 的 C3 亚群同时表达免疫检查点配体的高表达（图 6F），表明免疫检查点与侵袭性转移过程中免疫逃逸机制的关联。此外，作者发现 C0 恶性应激亚群和缺氧亚群 C4 倾向于富集浸润性导管癌，表明 IDC 处于转移前缺氧和应激状态。此外，C5 恶性增殖亚群在 LM 中富集[图 6G]。为了寻找针对该增殖亚群的潜在治疗策略，作者重点关注该亚群的代谢特征。代谢途径评分的差异分析表明，C5 增殖亚群在 TCA 和氧化磷酸化方面表现出较高的代谢强度（图 6I）。众所周知，TCA 是铜癌病的直接靶点，而氧化磷酸化是参与二硫化的重要代谢途径[17,18]。 作者计算了每个恶性亚群的铜癌敏感性评分和双硫化病抵抗评分。正如预期的那样，C5 亚群具有最高的铜癌敏感性评分和最低的双硫中毒抗性评分（图 6E）。增殖亚群的代谢特征可能赋予对这两种形式的细胞死亡的敏感性。当作者手动检查细胞周期模块的 TOP30 核心基因的注释时，作者发现大多数基因直接参与细胞周期进程，包括 DNA 合成、染色体蛋白成分和细胞周期检查点（表 S2）。然而，FAM111B 在细胞周期中的具体作用仍不清楚，对其与癌症的关系的研究很少。值得注意的是，FAM111B 在 C5 增殖亚群中也高表达，促使作者研究其作为肿瘤增殖标志物的潜力（图 7A）。最初，作者检查了 FAM111B 的组织表达谱（图 7B），发现在 IDC 的免疫组织化学（IHC）染色中，FAM111B 的阳性和阳性密度升高（图 7 C，D）。值得注意的是，染色主要集中在细胞核中（图 7E）。作者还观察到一些肿瘤细胞系中 FAM111B 的亚细胞荧光核定位（图 7F）。这些结果表明其潜在的细胞周期调节。为了验证这一发现，作者对沉默 FAM111B 的细胞系进行了流式细胞术细胞周期测定，发现它们的细胞周期停滞（图 7 G）。此外，作者研究了 FAM111B 对细胞恶性表型的影响。结果表明，与对照组相比，FAM111B 沉默的细胞系表现出降低的侵袭性和迁移能力（图 7 H，I）。这表明靶向 FAM111B 的抑制剂未来可能成为抑制细胞周期和乳腺癌转移的有效药物。 验证针对癌细胞增殖的治疗策略。 答 ：点图说明了与其他亚组相比，在 C5 恶性增殖亚群中表达相对较高的基因。B：Qupath 用于 IDC 免疫组化切片和正常乳腺组织的肿瘤细胞分割、分类和阳性细胞鉴定，用于 FAM111B。C：条形图显示浸润性导管癌中上调的上调 FAM111B 阳性率（学生 t 检验，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）。D：显示浸润性导管癌中上调上调的 FAM111B 上调上皮阳性密度的条形图（学生 t 检验，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）。E：比较浸润性导管癌细胞核和细胞质中上调 FAM111B 平均染色强度的箱线图（学生 t 检验，*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001）。F：免疫荧光亚细胞定位显示癌细胞系细胞核中 FAM111B 的高荧光强度。G：流式细胞术分析显示沉默 FAM111B 后细胞周期停滞。H：使用 FAM111B 沉默细胞进行的 Transwell 迁移和侵袭测定的代表性图像。 I：Transwell 测定显示 FAM111B 沉默细胞的侵袭和迁移能力下降（学生 t 检验，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）。G：蛋白质印迹分析显示，在 FAM111B 沉默细胞中调节铜癌病（FDX1）和双硫化（SLC7A11）的关键蛋白表达降低。此外，为了检查肿瘤细胞增殖状态对铜死亡和二硫化物死亡的双重敏感性，作者检查了分别调节铜死亡和二硫化物死亡的关键蛋白铁硫簇蛋白 FDX1 和胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白 SLC7A11 的细胞内表达。结果，FDX1 和 SLC7A11 在 FAM111B 沉默细胞中的表达降低（图。7、J）. 这些结果表明，在未来肿瘤异质性背景下，当肿瘤治疗应用时，铜癌病和二硫化对恶性增殖亚群具有独特的诱发作用。总结 与浸润性导管癌相比，淋巴结转移处的免疫抑制环境不太明显，但其特征是广泛的肿瘤细胞增殖并伴有大量细胞死亡。此外，处于增殖状态的肿瘤细胞可能对双重硫死亡和铜死亡具有双重敏感性。FAM111B 可能是增殖的潜在标志物和治疗靶点。
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