首先，作者分析了 4 种 CMS 亚型之间的无进展生存期（PFS）差异。结果表明，CMS4 CRC 表现出最短的 PFS 和最高的恶性肿瘤程度，表明临床行为最具侵袭性（p < 0.05）。随后，作者查明了 CMS4 和 CMS1-3 之间的差异甲基化位点 （DMS）。在 FDR < 0.05 和 p < 0.05 的阈值下，作者鉴定了 726 个显著的 DMS（图 1A）。聚类分析揭示了 CMS4 内不同的甲基化模式，与其他亚型相比，大多数位点表现出明显更高的甲基化水平（图 1 B）。这些 DMS 的功能富集分析突出了它们在免疫系统和转录因子中的参与，表明改变的启动子甲基化会影响肿瘤免疫微环境和转录因子结合[图 1 C，D]。对这些甲基化位点定位的分析表明，只有少数 DMS 位于 CpG 岛内，大多数甲基化位点分布在公海区域，其余位于 N 大陆架、N 海岸、S 大陆架和 S 海岸（图 1E）。接下来，进行随机森林和套索回归来评估这些 DMS 的重要性，最终确定了 43 个显著重要的甲基化位点（图 1 F，G）。Kaplan Meier 分析显示 8 个甲基化位点具有显著的预后价值（p < 0.05）（图 1 H）。以下是 8 个甲基化位点，分别为 cg10671066、cg06827038、cg05859264、cg01262913、cg18833140、cg25095814、cg26530341、cg27248887。 高甲基化患者的无进展生存期 （PFS） 较差，而低甲基化与更好的结局相关。TCGA CRC 中亚型特异性差异甲基化分析。 答 ：火山图显示了 CMS4 和 CMS1-3 之间不同的甲基化位点（红点代表显着的差异甲基化位点）。B：差异甲基化位点的聚类富集分析显示，与其他三种亚型相比，CMS4 CRC 的甲基化富集显着更高。C、D：差异甲基化位点的功能通路富集分析。E：启动子区域差异甲基化位点的基因组定位。F：通过 300 轮基于随机森林的特征选择，识别出高频差异甲基化位点。G：LASSO 回归分析了差异甲基化位点的系数变化轨迹，确定了那些在 λ 值中具有持久影响的位点。H：单因素生存分析确定了 8 个具有显着预后价值的甲基化位点 （p < 0.05）。CMS 系统共有分子亚型;CRC 的结直肠癌PFS 相关甲基化位点及与 mRNA 表达水平的相关性分析8 个预后甲基化位点的 Kaplan Meier 分析如图所示。阿拉伯数字答：cg10671066 （p = 0.027）、cg06827038 （p = 0.033）、cg05859264 （p = 0.025）、cg01262913 （p = 0.037）、cg18833140 （p = 0.045）、cg25095814 （p = 0.038）、cg26530341 （p = 0.026）、cg27248887 （p = 0.003）。同时，比较了不同 CRC 亚型组织中 8 个甲基化位点的甲基化比例。基于 TCGA 450 k 数据库，表达谱显示 CMS4 CRC 组织中 8 个甲基化位点的甲基化水平明显高于 CMS1-3 亚型。显示了 8 个与预后相关的甲基化位点及其相应基因的信息。除了与五个基因符号（SNOZ196、SNORD51、EF1B2、uc_338 和 NDUFS1）相关的 CpG 位点 cg27248887 外，其他 CpG 位点对应于单个基因符号：cg10671066 对应于 SLAMF6，cg06827038 对应于 WFIKKN2，cg05859264 对应于 MAPK13，cg01262913 对应于 DSCR9，cg18833140 对应于 HABP2，cg25095814 对应于 CASP8，cg26530341 对应于 TNFRSF10A。Pearson 相关系数显示，这 8 个位点的甲基化值与其在 CRC 中相应的 mRNA 表达水平呈显著负相关。图 2B 显示了 SLAMF6、WFIKKN2、MAPK13、DSCR9、HABP2、CASP8、TNFRSF10A 和 NDUFS1 甲基化值与 mRNA 表达水平的相关系数和 p 值。 为了进一步探索甲基化调控基因表达的具体机制，作者对 8 个基因的表达模式、功能、定位和当前研究现状进行了全面分析，其中 SLAMF6 引起了作者的特别兴趣。SLAMF6 仅在血液肿瘤中被记录，在实体瘤中没有报道。因此，作者后续研究的重点是验证 SLAMF6 在 CMS4 CRC 中的甲基化状态，并研究 SLAMF6 的甲基化调控机制。PFS 相关甲基化位点以及与 mRNA 表达水平的相关性分析。 答 ：8 个差异甲基化位点显示出显着的预后价值。B：8 个基因启动子甲基化与 mRNA 表达水平呈负相关CMS4 CRC 中 SLAMF6 甲基化状态的识别肿瘤中 DNA 甲基化格局的一般变化是复杂多样的。大部分低甲基化集中在广泛的重复丰富的基因间结构域中，导致基因组不稳定，而 CpG 岛子集中的超甲基化通常会导致肿瘤抑制基因的转录抑制[24]。前人研究表明，CpG 位点位于启动子内，主要分布在岛屿、海岸、陆架和公海。尽管 SLAMF6 的启动子不含 CpG 岛，但作者选择了 CpG 二核苷酸相对富集区的第一个外显子和 2000bp 前位点来设计引物（图 3 A，B）。通过亚硫酸氢盐测序 PCR（BSP）验证 SLAMF6 的甲基化状态。序列数据显示，SLAMF6 启动子区域共有 9 个甲基化位点，NCM460、DLD1、SW1116、HT29、SW480、SW620 和 HCT116 细胞中 SLAMF6 甲基化位点的比例分别为 58.9%、36.7%、51.1%、55.6%、80%、93.3%和 87.8%（图 3C、D）。还采用甲基化特异性 PCR （MSP） 来确认 CRC 细胞中 SLAMF6 甲基化状态。 电泳模式表明，SLAMF6 基因在 SW480、SW620 和 HCT116 上的启动子甲基化（M）状态比未甲基化（U）状态更为显著[图 3E]。此外，作者还对 4 例转移性 CRC 组织和 3 例非转移性 CRC 组织进行了 MSP，结果表明转移性 CRC 组织的甲基化（M）状态明显高于非转移性 CRC 组织（图 3F）。因此，作者得出结论，SLAMF6 在 CMS4 细胞和晚期 CRC 组织中表现出较高的甲基化比例，高甲基化与较差的预后有关，可作为潜在的检测靶点。CMS4 CRC 中 SLAMF6 甲基化状态的识别。 答 ：CpG 二核苷酸相对富集区 SLAMF6 启动子的 2000bp 前位点。B：SLAMF6 启动子区特异性 9 个 CpG 二核苷酸呈递及特异序列。C：基于亚硫酸氢盐特异性测序的 SLAMF6 启动子中 CpG 二核苷酸的代表性甲基化谱。D：不同 CRC 细胞中 CpG 二核苷酸的甲基化比率。E、F：甲基化特异性 PCR 显示 SLAMF6 启动子在 CRC 细胞系（E）和 CRC 组织（F）中的甲基化和未甲基化状态CRC 中 SLAMF6 表达水平和生物学功能的评估为了验证 SLAMF6 在 CRC 中的表达水平，采用 qPCR、蛋白质印迹和免疫组化检测 SLAMF6 在 mRNA 和蛋白水平上的表达。首先，对 SLAMF6 在 CRC 不同分期和转移的表达进行差异分析，发现 SLAMF6 在 IV 期和转移组织中的表达量要低得多（正常：n = 51、2.82 ± 0.66;M0：n = 475,2.17 ± 0.99;M1：n = 89、1.95 ± 0.94）（图 4A、B）。SLAMF6 在 4 种 CMS 亚型中的表达显著低于正常组织。此外，SLAMF6 在 CMS1 亚型中的表达水平相对较高，在 CMS2 亚型中的表达水平相对较低。这种现象可能归因于 SLAMF6 在肿瘤微环境中的各种细胞上表达，如肿瘤相关免疫细胞和基质细胞（图 4C）。临床病理资料分析显示，SLAMF6 低表达与 CRC 患者的病理分期（p = 0.015）和病理 M 分期（p = 0.004）相关（表 2）。Logistic 回归分析还表明，SLAMF6 与病理 M 分期显著相关（OR，95%CI：0.501（0.312–0.805），p = 0.004）（表 3）。预后分析表明，SLAMF6 高表达患者比 SLAMF6 低表达患者表现出更好的无进展生存期（PFS）（HR：0.65（0.46–0.93，p = 0.019））（图 4 D）。此外，CRC 细胞中 SLAMF6 的表达表明 DLD1 的表达水平明显较高，属于 CMS1 亚型（免疫学），然而，其他种类的 CRC 细胞，尤其是 CMS4（间充质）细胞，如 SW480、SW620、HCT116，SLAMF6 的表达相对较低（图 4 E）。免疫组化表明 SLAMF6 主要在肿瘤细胞膜和细胞外微环境中表达。它呈现多种模式，CRC 转移患者 SLAMF6 表达阴性，而微卫星不稳定性（MSI）患者 SLAMF6 表达明显较高。此外，SLAMF6 在 CRC 肿瘤免疫微环境中也过表达（图 4F）。使用蛋白质印迹法确认了用 siRNA 转染的 DLD1 中 SLAMF6 的表达，在转染 SLAMF6 全长质粒的 SW480 细胞中 SLAMF6 的表达。集落形成表明，与对照组相比，siRNA 在 DLD1 中显着促进细胞增殖，而 SLAMF6 过表达减少了 SW480 细胞中的细胞增殖（图 4 G）。反式孔室显示，敲低 SLAMF6 增强了 DLD1 细胞的迁移能力，而 SLAMF6 的过表达抑制了 SW480 的迁移能力（图 4 H）。因此，作者得出结论，SLAMF6 表达的降低主要归因于 CMS4 细胞和晚期 CRC 组织中较高的甲基化比例。 SLAMF6 表达缺失在转移性或 CMS4 CRC 中更为明显。A：SLAMF6 在 CRC 不同阶段的表达情况。B：转移性和非转移性 CRC 患者 SLAMF6 表达的差异。C：不同 CMS 亚型 SLAMF6 表达的差异。D：基于 SLAMF6 表达的 Kaplan Meier 生存分析涉及 CRC 患者 PFI 状态。E：Western blot 和 qPCR 验证了 SLAMF6 在 CRC 细胞中的表达水平。F：CRC 组织中 SLAMF6 表达的代表性图像。G：SLAMF6 敲低抑制了菌落形成，而其过表达增强了 CRC 中的集落形成。H：SLAMF6 沉默和过表达对 CRC 细胞侵袭能力的影响。*p < 0.05，***p < 0.001。比例尺，20 μm。CMS 系统共有分子亚型;CRC 的结直肠癌TGF-β/SMAD3/DNMT1 调控 SLAMF6 的表达先前的研究结论表明，CMS4 中 SLAMF6 的高甲基化可能是由于甲基转移酶的催化形成。然后作者用不同浓度的甲基转移酶抑制剂（5-aza-2-脱氧胞苷，5-Aza）刺激 CMS4 细胞。结果表明，5-Aza 上调 SLAMF6 的表达（图 1）。5、此外，作者抑制了 CMS4 细胞中的 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B，结果显示敲低 DNMTs 也会上调 SLAMF6 的表达（图 5 B）。鉴于 CMS4 CRC 中 TGF-β 信号激活的标志，作者进一步探索了 TGF-β 在调节 SLAMF6 表达方面的潜在功能。Western blot 表明 TGF-β抵消了由 siDNMT1 或 5-Aza 触发的 SLAMF6 表达的增加，这种资助表明 TGF-β对 SLAMF6 表达具有抑制作用（图 5 C）。先前的研究报道称，转录因子 SMAD2/3 在间充质激活中发挥了重要作用[25\u201227]。 蛋白质印迹表明，在不同浓度的 TGF-β刺激下，CMS4 细胞中 p-SMAD2/3 和 DNMT1 增加[图 5D》，表明转录因子积累进入细胞核。为了进一步研究 TGF-β对 DNMT1 表达的调控是否依赖于 SMAD2/3，作者在 CMS4 细胞中敲低了 SMAD3，蛋白质印迹显示 TGF-β诱导的 DNMT1 表达的上调受到显著抑制（图 5 E，F）。这些观察结果 表明，TGF-β激活了 p-SMAD2/3 并诱导了 DNMT1 的高表达。 根据 JASPAR 数据库，作者对 DNMT1 启动子上的转录因子结合位点进行了潜在预测，其中 SMAD3 被预测为潜在的转录增强子（图 5 G）。采用 CHIP 法验证 SMAD3 是否与 DNMT1 相互作用。结果表明，转录增强子 SMAD3 主要结合在 DNMT1 启动子 3'-5'链的-1345 至-1529 位点（图 5H，J）。此外，还使用 EMSA 确定核蛋白-DNA 结合活性的影响。如图 5 所示，TGF-β处理组为 5 ng/ml 和 10 ng/ml 的 SW620 细胞与对照组相比，SMAD3 与探针序列的结合复合物明显。TGF-β共同激活 SW620 细胞中的转录因子 SMAD2/3 并上调 DNMT1，从而诱导 SLAMF6 甲基化。 TGF-β/SMAD3/DNMT1 调控 SLAMF6 的表达。 答 ：用不同浓度的 5-Aza（0、2μM 、5μM、10μM ）处理后评估 SLAMF6 的表达。B：SLAMF6 的表达受 DNA 甲基转移酶（DNMT）的调控。C：TGF-β抵消了 DNA 甲基化对 SLAMF6 表达的抑制作用。D：不同浓度 TGF-β（0、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml）处理后，检测 DNMT1、p-SMAD3、p-SMAD2 的表达水平。E：沉默 SMAD3 表达的验证。F：Western blot 分析显示，TGF-β刺激（10 ng/ml）沉默 SMAD3 对 DNMT1 蛋白水平的影响。G、H、I：CHIP-qPCR 通过 TGF-β刺激验证了 SW620 细胞中转录因子 SMAD3 与 DNMT1 启动子区的结合（G：JASPAR 的预测序列;H：电泳图;I：PCR 的定量分析）。J：EMSA 检测证实了 SMAD3 和 DNMT1 在 TGF-β处理后 SW620 细胞中的组合。PCR：聚合酶链反应;EMSA：电泳迁移率位移测定;CHIP：染色质免疫沉淀肿瘤微环境对免疫治疗的有效性有重大影响。CMS4 是一种典型的免疫治疗反应较差的冷肿瘤，其特点是 CD8+ T 细胞活性低，微环境中浸润较少。比较不同表达水平的 SLAMF6 对肿瘤免疫细胞浸润的影响，SLAMF6 的高表达伴随着多种免疫细胞浸润的增加，而 SLAMF6 的低表达则排除了多种免疫细胞的浸润，如 DC 细胞、B 细胞、CD8+ T 细胞、巨噬细胞、Mase 细胞、中性粒细胞、NK 细胞、Th1 细胞、Th2 细胞和 Treg 细胞（图 6 基因功能富集分析还显示，SLAMF6 相关基因集中在 IFN-γ特征、APM 信号、碱基切除修复、细胞周期、DNA 复制、同源重组、核苷酸切除修复、p53 信号通路、嘧啶代谢等多种信号通路中（图 6 B）。此外，相关性分析显示 SLAMF6 表达与癌症免疫周期激活步骤之间存在显著相关性（图 6B）。估计评分表明 SLAMF6 与免疫评分、估计评分和基质评分呈正相关（免疫评分：R = 0.590，p < 0.001;估计 评分：R = 0.523，p < 0.001;基质 评分：R = 0.391，p < 0.001）（ 图 6C-E）。总的来说，作者的研究结果表明，SLAMF6 有助于 CRC 微环境中的免疫细胞调节，尽管所涉及的具体途径需要进一步表征。SLAMF6 的高表达有助于免疫细胞浸润。 答 ：基于 SLAMF6 表达水平的免疫细胞浸润差异。B：SLAMF6 的表达与多种信号通路呈正相关，相关性分析显示 SLAMF6 与癌症免疫周期激活步骤呈正相关。C-E：SLAMF6 表达与免疫评分（C）、估计评分（D）和基质评分（E）的相关性分析。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.0015-Aza 联合 PD-L1 单克隆抗体减少体内肿瘤生长从上述结果来看，作者认为 SLAMF6 的甲基化诱导其低表达，从而影响 CMS4 或晚期 CRC 的免疫排斥。因此，作者进一步研究了 DNA 甲基转移酶抑制剂（5-aza-2-脱氧胞苷，5-Aza）是否会影响肿瘤增殖和免疫治疗。采用 MC38 小鼠结肠癌细胞评价 5-Aza 的抗肿瘤作用。首先，使用不同浓度的 5-Aza 刺激 MC38 细胞 48 h，蛋白质印迹显示 5-Aza（10 uM）显着上调 SLAMF6 表达[图。7、随后，进行 MSP 以验证 MC38 细胞中 SLAMF6 启动子区域的甲基化状态（图 7 B）。此外，作者利用小鼠来源的结肠癌细胞 MC38 构建小鼠结肠癌异种移植模型，随后腹腔注射 PBS、5-Aza、PD-L1 单克隆抗体，并联合应用 5-Aza 和 PD-L1 单克隆抗体。结果表明，单一 5-Aza 或 PD-L1 单克隆抗体抑制肿瘤生长，5-Aza 和 PD-L1 单克隆抗体联合应用可产生更显著的肿瘤生长限制（图 7C）。联合组的肿瘤体积和重量减少更为明显（图 7D、E）。免疫组化显示，联合应用组 Ki67 的表达低于单一治疗组（图 7F）。在 5-Aza 和 PD-L1 单克隆抗体的联合应用中发现 SLAMF6、CD3 和 CD8 的表达增强（图 7 G）。结果表明，5-Aza 联合 PD-L1 单克隆抗体增强了肿瘤微环境中免疫细胞的浸润，增强了抗肿瘤能力。5-Aza 和 PD-L1 抗体对荷载肿瘤小鼠的疗效。A：在 MC38 细胞（0、2 μM、5 μM、10 μM）中用 5-Aza 处理后检测到 SLAMF6 的表达。B：采用甲基化特异性 PCR 检测 MC38 细胞中 SLAMF6 的甲基化状态。C：将荷瘤小鼠分为 4 组，腹腔注射 PBS、5-Aza、PD-L1 抗体，联合应用 5-Aza 和 PD-L1 抗体。D：四组荷瘤小鼠之间肿瘤体积的差异。E：四组肿瘤重量的差异。F：4 组 Ki67 表达差异。G：5-Aza 和 PD-L1 联合组 CD3、CD8 和 SLAMF6 表达水平升高。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。比例尺，20 μm。5-氮杂：5-氮杂-2-脱氧胞苷。总结 作者证明了 TGF-β诱导的 SLAMF6 甲基化修饰在 CMS4 CRC 中的关键作用，并概述了 TGF-β-SMAD3-DNMT1-SLAMF6 通路的机制。SLAMF6 表达参与 CRC 微环境的免疫浸润。因此，SLAMF6 可以探索作为一种改善 CRC 患者临床结果的新型治疗方法。
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