间质细胞通过分泌胶原蛋白决定了胆囊癌（GBC）和胆囊腺瘤（GBA）之间的肿瘤微环境（TME）差异为分析胆囊来源性肿瘤的肿瘤微环境（TME）特征，作者使用基于液滴的单细胞 RNA 测序平台，从 8 例手术切除的新鲜组织中构建了单细胞图谱，包括 4 例原发性胆囊腺癌和 4 例胆囊神经内分泌肿瘤（ICPN）。在切除、消化和质量过滤后，作者获得了 70,041 个细胞。作者使用 t-SNE 方法鉴定了 8 个细胞亚群，包括 T/NK 细胞（n=23,574；CD3D、CD3E、GNLY、KLRD1）、B 细胞（n = 1,220；CD79A、MS4A1）、浆细胞 B 细胞（n = 2,238；CD79A、MZB1）、髓系细胞（n= 10,761；CD68、CD14、CD163）、肥大细胞（n= 2.813；TPSAB1、MS4A2）、间质细胞（n= 3,730；COL1A1、COL14A1、LUM）、内皮细胞（n= 1.361；CD34、PECAM1、VWF）和上皮细胞（EPCs，n= 24,344；EPCAM、CDH1）。为探究胆囊良性肿瘤与恶性肿瘤 TME 的差异，作者计算了 GBA 和 GBC 的细胞比例。与 GBA 相比，GBC 的 TME 中存在更多间质细胞、髓系细胞和 B 细胞（图 1c, d）。值得注意的是，在胆囊癌（GBC）中，上皮细胞的比例低于腺瘤性病变（GBA），这与 GBA 上皮细胞具有更高的增殖评分一致。这表明非癌细胞在 GBC 的不良预后中起着关键作用。GBC 和 GBA 生物信息学分析概述。(a) t-SNE 图可视化 8 个样本中的 8 种细胞类型。(b) 点图可视化已识别细胞类型中细胞类型基因特征的表达水平。(c, d) 条形图显示 GBC 和 GBA 中各种细胞类型的相对丰度以及每个样本中各种细胞类型的相对丰度。(e, f) GBC 和 GBA 之间差异基因（DEGs）在 GSE202479 中的 GO 和 GSEA 富集分析。(g) GSE202479 中不同胆囊疾病样本的基质和免疫细胞浸润评分。(h) GSE202479 中 GBC 和 GBA 样本的免疫细胞浸润预测。(i) GBC 和 GBA 之间细胞间相互作用差异的数量和强度。红色代表 GBC 中上调的强度，蓝色代表下调的强度；线的宽度是上调或下调的程度。作者还对来自 GSE202479 数据集的 10 例 GBC 和 3 例 GBA 样本的 bulk-RNA seq 进行了差异表达基因分析，并构建了这些差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。PPI 网络中的许多枢纽基因是细胞外基质（ECM）的组成部分，例如 COL1A2、COL3A1 和 FBN1。GO 和 GSEA 分析显示，差异表达基因在 TME 基质成分相关方面显著富集，如 ECM、血管发育和弹性纤维组装（图 1e, f）。在该数据集中，GBC 的基质细胞浸润评分也明显高于 GBA（图 1g）。作者还使用 CIBERSORT 预测了这些样本的免疫细胞浸润情况。结果显示，不同样本间免疫细胞的比例差异很大。然而，在该数据集中，GBC 样本始终比 GBA 含有更高丰度的髓系细胞（图 1h）。细胞通讯分析显示，细胞相互作用的数量和强度显著上调，而间质细胞是这种差异的中心，尤其是在上皮细胞中。这表明间质细胞决定了 GBC 和 GBA 之间 TME 的差异（图 1i）。在所有由间质细胞介导的相互作用中，由于其高通讯概率（补充数据 2），COLLAGEN 信号通路引起了作者的兴趣。作者注意到，间质细胞与上皮细胞最上调的相互作用是 COL1A2-SDC1。在免疫细胞中，包括 T/NK 细胞、髓系细胞和肥大细胞，相互作用主要上调的是胶原-CD44。在接下来的部分中，作者将详细阐述 GBC 和 GBA 之间 TME 的差异，并阐明间质亚型如何主导这种差异。作者的关注点将集中在胶原信号通路以及与独特间质细胞亚型相互作用的细胞亚群。ECM 重塑成纤维细胞主导了胆囊癌 TME 中胶原介导的细胞相互作用为识别介导胶原信号的成纤维细胞亚群，作者对间质细胞进行了重新聚类，并根据 Wang 等人提供的标记（7）确定了四种细胞亚型，包括免疫调节成纤维细胞（IRF）、细胞外基质重塑成纤维细胞（ERF）、类衰老成纤维细胞（SLF）和周细胞（图 2a）。GO 富集分析显示 IRF 参与补体激活和囊泡分泌（图 2b）。ERF 高度表达与胶原生物合成相关的基因，并在细胞外基质重塑的 GO 术语中富集（图 2b）。SLF 具有衰老相关分泌表型（SASP）的分泌能力，高表达蛋白酶或蛋白酶抑制剂（CST1、PAPPA、CTSC、PLAT）。SLF 的基因标记在丝氨酸降解中富集（图 2b），这是细胞衰老的表现。周细胞是一种围绕毛细血管内皮的间质细胞。值得注意的是，作者数据中的周细胞实际上是由经典周细胞和血管平滑肌细胞（VSMCs）组成的集合，这是由于细胞数量限制以及周细胞和 VSMCs 之间存在大量基因交集。与先前研究一致，周细胞在肿瘤中稀少，这表明胆囊癌（GBC）中的血管覆盖周细胞的情况较差（8）。为了描绘这些间质细胞之间的转变，作者进行了无监督轨迹分析，发现 IRFs、ERFs 和周细胞代表了细胞轨迹中的三种不同状态。值得注意的是，SLFs 跨越了细胞轨迹的三种状态（图 2c）。因此，考虑到 SLFs 高表达衰老相关基因（7），它们可能是这些间质细胞的共同目的地。 GBC 和 GBA 中间质细胞亚型的表征。(a) 可视化 GBC 和 GBA 中間質細胞亚型的 t-SNE 图。(b) 中間質細胞亚型基因标记的富集分析和伪时间变化。(c) 中間質細胞亚型的细胞轨迹。(d) 显示 GBC 和 GBA 中各种细胞类型相对丰度的条形图以及每个样本中各种细胞类型的条形图。(e) 无标度网络中 8 个模块的树状图。(f) ERF 每个基因模块的枢纽基因。(g) 每个模块中基因表达在 umap 图上的投影。(h) ERF-M5 中基于特征基因连接性（kME）最高的前 25 个基因。(i) 模块与临床特征之间的相关性。方块的面积和颜色代表相关性；*(p<0.05), ** (p<0.01), *** (p<0.001)。(j) 每个中間質細胞亚型的转录因子基因表达热图。(k) 胶质细胞间的细胞间相互作用。 (l) 散点图展示了 ERFs 通过胶原信号与其他基质细胞之间的细胞通讯。颜色代表细胞类型，线的宽度代表细胞通讯的强度。(m-p) mIHC 图像显示了 GBC 组织中 ERF 标志物（FN1, COL1A2）的表达情况。ERF 是细胞外基质（ECM）胶原的主要来源，它们在胆囊癌（GBC）中富集，但在癌旁组织和肝内胆管腺瘤（GBA）中罕见（图 2d）。为了进一步研究 ERF 的功能，作者使用 7 作为软阈值进行了高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA），并鉴定出八个 ERF 基因模块（图 2e, f）。作者将样本分为三种病理表型，包括 GBA、早期 GBC（局限于胆囊，T1-2）和晚期 GBC（T3）。之后，作者计算了模块与病理表型之间的相关性。M3、M4、M5、M6 和 M8 与病理表型呈显著正相关，尤其是 M4（图 2i）。M4 包含许多与氧化应激相关的线粒体基因（图 2f）。然而，M5 引起了作者的兴趣，因为它在 ERFs 中的特异性表达（图 2g) 。M5 包含与细胞外基质重塑相关的基因，特别是不同类型的胶原蛋白（图 2h)。这些结果也支持 ERF 与胆囊癌的进展相关，并通过分泌胶原蛋白在细胞外基质重塑中发挥重要作用。为了探索 ERFs 的起源，作者还使用 SCENIC 进行了 BEAM 分析和 TF 预测。在 Wang 等人构建的模型（7）中，IRFs 可以转化为 ERFs。作者的研究揭示了在 IRFs 向 ERFs 的转化过程中，与 ECM 降解和胶原合成相关的基因上调，这与癌症进展中 ECM 成分的变化一致（9）。FOSL2、VDR、TWIST1、CREB3L1 和 ETV1 被预测为 ERFs 的 TFs（图 2j）。TWIST1 和 CREB3L1 与 CAF 诱导的 ECM 重塑和纤维化介导的肿瘤进展相关（10, 11）。JUN、FOS 和 JUNB 是 IRF 的 TFs，它们是 AP-1 家族的成员，可以驱动 CAF 的激活（12）（图 2j）。FOSL2 作为 ERFs 的 TF，也是 AP-1 家族的成员，这表明 ERF 与 IRF 之间的相关性。 Cellchat 分析显示，ERFs 可以通过 COL1A2-(ITGA1+ITGB1)和 COL1A2-(ITGA2+ITGB1)与周细胞和内皮细胞相互作用（图 2k、l），这与 GBC 中成纤维细胞亚型之间以及成纤维细胞与内皮细胞之间细胞相互作用增加的现象一致。该结果还支持 ERFs 在 GBC 与 GBA 之间胶原介导的细胞相互作用增加中起主导作用。作者使用 ERF 标志物 FN1（IHC 评分=2）和 COL1A2（IHC 评分=6）对 GBC 组织石蜡切片进行了 mIHC 检测。结果显示 ERFs 富集于 GBC 组织中，并被分泌的 COL1A2 蛋白包围，这支持 ERFs 可以分泌 COL1A2 以与 GBC 中的其他细胞相互作用（图 2m–p）。为了研究胆囊癌（GBC）和胆囊腺瘤（GBA）之间的基因差异，作者将上皮细胞投影到 t-SNE 图上。这些细胞根据样本或组织类型明显分离（图 3a, b）。此外，来自同一患者两个样本的上皮细胞被归入相同的细胞簇（图 3a），这表明细胞簇的分离是由于胆囊肿瘤的高遗传异质性，而不是批次效应。作者还计算了每个上皮细胞的 CytoTRACE 评分和 CNV 评分。正如作者所预期，GBC 的 CytoTRACE 和 CNV 评分均显著高于 GBA，表明肿瘤细胞具有更高的干性和遗传变异（图 3–f）。GBC 和 GBA 之间 DEGs 的 GSEA 分析显示，恶性细胞上调了对外部刺激的反应能力以及与细胞外基质（ECM）的相互作用能力（图 3g, h）。GBA 上调 Wnt 信号通路（图 3g），这与先前的研究结果一致（13）。 Wnt 信号通路在上皮间质转化（EMT）中发挥重要作用，上皮细胞通过 EMT 过程失去极性并获得侵袭性（14），这意味着 EMT 可能参与了 GBA 的恶性转化。(a) t-SNE 图可视化按样本着色的上皮细胞。(b) t-SNE 图可视化按组织类型着色的上皮细胞。(c) t-SNE 图上每个模块中 CytoTRACE 分数的投影。(d) GBA 和 GBC 上皮细胞的 CytoTRACE 分数。(e, f) GBA 和 GBC 上皮细胞的 CNV 分数。(g, h) GBC 和 GBA 上皮细胞 DEGs 的 GSEA 富集分析。(i) 间质细胞亚型的细胞轨迹。(j) 上皮细胞每个状态的 CNV 分数。(k) GBC 和 GBA 上皮细胞 DEGs 的富集分析。(l) CNV 分数及其与 GBA 和 GBC 上皮细胞 CNV 分数的相关性。(m) 虚拟时间中 CDH1 和 VIM 的动态表达。(n) 每个状态上皮细胞的代谢。(o) 上皮细胞每个状态与间质细胞亚型之间的细胞通讯。 (p) 散点图展示了 ERFs 与上皮细胞各状态之间的细胞通讯，通过胶原信号传导。为了描绘 GBA 和 GBC 之间的恶性转化过程，作者使用 monocle2 进行了无监督轨迹分析。细胞轨迹揭示了从 GBA 到 GBC 的演化过程，遵循伪时间 (图 3i)。在这个轨迹中，状态 1 代表具有分化为腺瘤或癌细胞潜能的上皮细胞。状态 1 的标记基因富集于建立细胞极性和细胞连接组装，表现出上皮特征的丧失。状态 2 主要由腺瘤细胞组成，这些细胞高表达与蛋白质合成相关的基因，表明其具有高度的增殖能力。状态 3 是腺瘤细胞命运的一个转折点，在此之后它们将分化为两种不同类型的癌细胞。状态 4 中的癌细胞表现出高调控活性以激活免疫反应，而状态 5 中的癌细胞则表现出增强的氧化磷酸化能力 (图 3k)。状态 4 和状态 5 的 CNV 评分显著高于状态 1、2 和 3 (图 3j)。 ScMetabolism 主要涉及状态 1、2 和 3，这些状态主要参与氨基酸和脂肪酸代谢。状态 4 表现出显著的糖胺聚糖生物合成能力，而糖胺聚糖是细胞外基质（ECM）的组成部分。状态 5 主要参与具有生物活性的脂质介质的代谢，例如花生四烯酸和类固醇激素（图 3n）。作者还进行了 BEAM 分析，以检测从 GBA 到 GBC 进化过程中的基因变异。通过富集分析，作者发现上皮间质转化（EMT）在每个分支点的 BEAM 基因中富集，这支持 EMT 在 GBA 恶性转化中发挥重要作用。为了验证作者的假设，作者使用 UCell 计算了每个上皮细胞的 EMT 评分，发现 GBC 的 EMT 评分显著高于 GBA（图 3l）。此外，EMT 评分随着细胞轨迹的增加而升高（图 3i）。间质标志物 VIM（波形蛋白）在伪时间过程中增加，而上皮标志物 CDH1（E-钙粘蛋白）减少（图 3m）。免疫组化显示，与 GBA 相比，GBC 组织中 EMT 标志物 Snail（GBC：免疫组化评分=8；GBA：免疫组化评分=4）和 Twist（GBC：免疫组化评分=6；GBA：免疫组化评分=3）的表达更高。CNV 评分是广泛用于评估上皮细胞恶性程度的方法。作者的数据中 EMT 评分与 CNV 评分呈正相关（图 3l）。在 GSE202479 数据集中，早期 GBC 与 GBA 之间的差异基因也富集在 EMT 中，这也表明 EMT 促进了 GBA 的恶性转化。ERFs 与上皮细胞表现出广泛的相互作用。Cellchat 分析显示，GBC 中增加的细胞相互作用归因于 ERFs 与状态 5 之间的 COL1A2-SDC1。然而，状态 4 与 ERFs 的相互作用较弱（图 3o, p）。作者的分析表明，ERFs 与肿瘤细胞在后期（CNV 评分较高）的相互作用增加，这些肿瘤细胞具有异常的代谢特征，而不是那些积极参与 ECM 形成的细胞。根据先前的研究（15, 16），SDC1 对 Wnt-1 诱导的乳腺肿瘤发生至关重要，这意味着 COL1A2-SDC1 相互作用可能促进 GBA 细胞的 Wnt 诱导的恶性转化。正如作者所提到的，间质细胞主要通过胶原-CD44 与免疫细胞相互作用。CD44 是一种粘附分子，参与免疫细胞的组织驻留，这促进了肿瘤微环境（TME）的形成。在接下来的部分，作者将详细讨论与 ERFs 相互作用的免疫细胞的特点。浸润性髓系细胞由单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞组成。由于 C4 和 10x 平台的局限性，作者的数据中缺少中性粒细胞。因此，作者根据经典标志物将髓系细胞分为两组：单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞。作者对单核细胞/巨噬细胞进行了重新聚类，并鉴定出八个不同的亚群（图 4a）。Macro01 和 Macro02 在 GBA 中富集（图 4b）。Macro01 高度表达 PGC、RGS1 和促炎细胞因子 TNF，这与 M1 表型相关（17–19）（图 4k）。Macro02(FCGBP+CX3CR1+C3+)被鉴定为免疫抑制性细胞亚群，存在于两个早期 GBC 中（7）。在作者的数据中，TREM2 是 Macro02 的一个标志物。TREM2 清除磷脂和脂蛋白，这与 Macro2 中脂质代谢基因的显著上调一致（图 4k）。Macro03、Macro04 和 Macro06 在 GBC 中富集（图 4b）。Macro03 广泛表达趋化因子配体（图 4k），在肿瘤微环境中招募促进肿瘤的免疫细胞中发挥重要作用。 Macro04 被报道为一种 MDSC 样巨噬细胞，是单核细胞在肿瘤中成熟为巨噬细胞过程中的一个中间状态（7）。Macro06 高度表达与更好预后相关的基因特征（SELENOP 和 FOLR2）以及一个 M2 标志物（MRC1）（Figure 4k) (20, 21）。Macro05 在 GBA 和 GBC 中占据相似的 proportions 并显示出明显的增殖特征（MKI67, STMN, TOP2A），可能作为自我更新的胆囊驻留巨噬细胞（Figure 4k）。Mono01 高度表达 GPX1 和线粒体基因（Figure 4k），表明它们在 TME 中的氧化应激中发挥重要作用。Mono02 表达多种免疫球蛋白重链γ类蛋白（Figure 4k）。考虑到这些单核细胞高度表达 SPP1，并且有报道称 SPP1+ 巨噬细胞表达免疫球蛋白相关基因和单核细胞标记物 VCAN，因此这些细胞可能是 SPP1+ 巨噬细胞的一个亚群，一种与患者预后不良相关的促肿瘤巨噬细胞（22）。 (a) t-SNE 图可视化了来自胆囊癌（GBC）和胆囊腺瘤（GBA）的巨噬细胞亚群。(b) 条形图显示了 GBC 和 GBA 中各种巨噬细胞亚型的相对丰度。(c) 巨噬细胞亚型中的 M1/M2 评分。(d) 巨噬细胞亚型中的趋化性评分。(e) Macro04 标记的 GO 富集分析。(f) GBC 和 GBA 巨噬细胞中的 M1/M2 评分。(g) GBC 和 GBA 巨噬细胞中的 M1/M2 评分。(h) GBC 和 GBA 巨噬细胞中 DEGs 的 GSEA 富集分析。(i) 巨噬细胞亚型中髓系检查点表达在 t-SNE 图上的投影。(j) 点图显示了 ERFs 通过胶原信号通路与每种巨噬细胞亚型之间的细胞通讯。(k) 点图显示了巨噬细胞亚型的基因标记表达。为了比较这些细胞的功能差异，作者使用 Ucell 计算基因集得分。M1 与 M2 得分的比例反映了不同巨噬细胞亚群的表型倾向。以胆囊驻留巨噬细胞（Macro05）为参考，Macro02 和 Macro03 表现出 M2 倾向，而 Macro01 和 Macro06 与 Macro05 具有相似的特征。其余细胞亚群均表现出 M2 倾向（图 4c）。在 GBA 中，巨噬细胞主要为 M1 和中间表型。相比之下，GBC 包含多种巨噬细胞亚型，以 M2 为主（图 4b）。比较 GBA 和 GBC 中所有巨噬细胞的 M1/M2 得分也证实了这一点（图 4f）。然而，GBC 中的炎症和细胞因子反应更为活跃（图 4g）。作者对 GBA 和 GBC 之间巨噬细胞的差异表达基因（DEGs）进行了 GSEA 富集分析。 结果揭示，胆囊癌（GBC）中的巨噬细胞相比胆囊腺瘤（GBA）中的巨噬细胞具有增强的趋化活性，并下调了抗原呈递功能（图 4h）。这种增强的趋化性主要归因于 Macro03（CCL2+）（图 4d）。作者还注意到，Macro04（S100A9+）在所有变异程度较高的基因集中得分最低（图 4c, d），这表明这些细胞的成熟状态不同。GO 分析显示，Macro04 与免疫反应的调控相关（图 4e）。就像 T 细胞一样，巨噬细胞也表达免疫检查点，作者可视化了这些分子的表达。SIRPA、LILRB1、LILRB2、Siglec1、Siglec7、Siglec9、PDCD1、CD163 和 MARCO 的表达主要在 Mono01、Mono02 和 Macro03 上（图 4i），这表明它们具有促肿瘤作用。此外，这些细胞亚群还通过 CD44 与 ERFs 相互作用（图 4j）。树突状细胞（DCs）由 1 型常规 DCs（cDC1s）、2 型 cDCs（cDC2s）和浆细胞样 DCs（pDCs）组成（图 5a, b）。作者在数据中也鉴定出了 LAMP3+DCs。LAMP3+DC 是一种成熟的、迁移性的 DC 亚群，缺乏 cDC 或 pDC 标志物的表达（图 5b) (22)。在作者的数据中，LAMP3+DCs 在 GBC 中富集，并高表达共刺激或共抑制分子，如 CD80、CD86、CD40、ICOSL、PD-1 和 PD-L1（图 5c, f）。因此，LAMP3+ DCs 的丰度可能作为预测免疫治疗疗效的潜在指标。LAMP3+DCs 也表达趋化因子（CCL22, CCL17）和免疫抑制性 IDO1，表明其具有强大的免疫调节能力（图 5d）。类似地，在 GBC 中富集的 pDCs 也表现出免疫抑制作用，高表达 GZMB、PTPRS、CLIC3 以及耐受性标志物 PECAM1（CD31）（23) (图 5c, d)。 GZMB 可以抑制 T 细胞增殖（24），PTPRS 可以抑制干扰素的产生，CLIC3 参与血管生成并增加癌细胞的侵袭性（25, 26）。然而，pDCs 也高度表达免疫刺激分子 ICOSL 和 4-1BBL（图 5f），并且在 IFN-γ反应中富集（图 5k），这表明它们具有复杂的免疫调节活性。单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）在 GBA 中富集（图 5c）。MoDCs 主要在炎症反应中产生，并调节 CD4+T 细胞的分化为 1 型 T 辅助细胞（Th1 细胞）、2 型 T 辅助细胞（Th2 细胞）或 IL-17 产生 T 辅助细胞（Th17 细胞）表型（27）。GO 和 KEGG 分析显示 MoDCs 参与炎症反应和免疫系统的调节（图 5l）。cDC 是 DC 的主要亚型，在抗原呈递中发挥重要作用。 cDC1 和 cDC2 均高度表达 MHCII 分子，cDC1 还表达 WDFY4 用于交叉呈递（图 5d) (28）。为了比较不同 DC 亚型的抗原呈递能力，作者计算了每个 DC 细胞的 MHC 评分。令作者惊讶的是，作为主要抗原呈递细胞亚型的 cDC2（27），其 MHC 评分相对较低（图 5h）。作者推测这些异常现象可能归因于 GBC 肿瘤微环境（TME）的教育作用。与作者的假设一致，GBA 中的 cDC2 的 MHC 评分高于 GBC（图 5g）。GSEA 分析显示，GBC 中的 cDC2 上调了与基质成分的相互作用，同时下调了 MHC 蛋白复合物的组装（图 5i）。此外，ERFs 与 cDC2 之间的相互作用通过 COL1A2-CD44 显示出高度通信概率（图 5j）。然而，ERFs 调节 MHC 组装的机制仍需进一步阐明。 LAMP3+DCs 也通过 COL1A2-CD44 与 ERFs 表现出强烈的相互作用（图 5j），这支持了作者的理论，即 ERFs 促进肿瘤促进免疫细胞的组织驻留。 (a) t-SNE 图可视化所有样本的 DC 亚群。 (b) 点图显示 DC 亚型的基因标记表达。 (c) 条形图显示 GBC 和 GBA 中各种巨噬细胞亚型的相对丰度。 (d) 小提琴图显示 DC 亚型的基因特征。 (e, i) GBC 和 GBA 之间 cDC2 差异基因的 GSEA 富集分析。 (f) 成本刺激或共抑制分子在 t-SNE 图上对 DC 亚型的表达投影。 (g) GBA 和 GBC 中所有 DC 的 MHC 评分。 (h) GBA 和 GBC 中每个 DC 亚型的 MHC 评分。 (j) 点图显示 ERFs 通过胶原信号通路与每个 DC 亚型之间的细胞通讯。 (k) pDC 的 HALLMARK 富集分析。 (l) MoDC 的 GO 和 KEGG 分析。鉴定与 ERFs 进行通讯的 T 细胞和 NK 细胞亚群通过聚类 T/NK 细胞，作者在胆囊癌（GBC）和胆囊腺瘤（GBA）中鉴定出八个亚群。T/NK 亚群在 GBC 和 GBA 中的分布不同（图 6a）。调节性 T 细胞（Tregs）、NKT 细胞、类似未成熟 T（Tn-like）细胞、细胞毒性 T 细胞（CTL-1）和组织驻留性记忆 T 细胞（Trms）在 GBC 中富集（图 6b），而 NK 细胞、效应记忆 T 细胞（Tems）和 CTL-2 在 GBA 中富集（图 6b）。CTL-1 和 CTL-2 均高度表达细胞毒性颗粒酶（图 6h）。CTL-1 主要表达 GZMA 和 GZMB（图 6h），而 CTL-2 主要表达 GZMA 和 GZMH（图 6h）。与 CTL-2 相比，CTL-1 表现出更激活的 TCR 信号和更高的细胞毒性能力（图 6c）。然而，CTL-1 也表现出激活诱导的细胞死亡（AICD）（图 6c），并高表达耗竭标志物，包括 CTLA4、TIGIT、PDCD1 和 CXCL13（图 6h）。 GSEA 分析显示 CTL-1 具有更强的趋化能力，与核糖体生物合成相关的术语在 CTL-2 中富集（图 6d）。这些结果表明，与 GBA 中的 CTL-2 相比，GBC 中的 CTL-1 代表一种更成熟和耗竭的表型。Trms 高度表达组织驻留标记物 NR4A1、NR4A2、RGS1、RGS2 和 CD69（图 6h）。NR4A 核受体家族被确定为 T 细胞耗竭的关键介质（29, 30），RGS1 可以阻碍 T 细胞向肿瘤浸润并抑制其细胞毒性（31）。作者数据中的 Tems 以表达 JUN、FOS、TNF 和 CD69 为特征（图 6h），这与 Huang 等人通过肝窦识别的细胞亚群一致（32）。作者使用 VECTOR 推断 T 细胞亚型的发育方向。结果表明 Tems 具有分化为 Trms 的潜力（图 6e, f）。Tn 样细胞除表达 naive 标记物外，还高度表达 GZMK。 先前研究表明，GZMK+T 细胞是耗竭性 T 细胞的 precursor (22)。Tn 样细胞与具有耗竭性标记的 CTL-1 在 UMAP 和 t-SNE 中的接近性也提示它们在基因特征上的相似性 (图 6a, e)。 (a) t-SNE 图可视化胆囊癌（GBC）和腺瘤性病变（GBA）中的巨噬细胞亚群。(b) 条形图显示 GBC 和 GBA 中各种 T/NK 亚型的相对丰度。(c) CTL-1 和 CTL-2 之间的 TCR、细胞毒性及 AICD 评分。(d) CTL-1 和 CTL-2 之间差异基因（DEGs）的 GSEA 富集分析。(e) umap 图可视化所有样本中的巨噬细胞亚群。(f) T 细胞亚型分化的方向。(g) 点图显示 ERFs 通过胶原信号通路与每种 T/NK 亚型之间的细胞通讯。(h) 点图显示 T/NK 亚型的基因标记表达。细胞聊天分析显示，CTL-1、NKT 细胞、Tems、Tn 样细胞、Treg 和 Trms 可以通过 COL1A2-CD44 与 ERFs 相互作用（图 6g）。其中大多数在 GBC 中表现出优先富集，并具有免疫抑制或耗竭表型。这些结果支持 ERFs 在肿瘤免疫微环境（TIME）的形成和维持中发挥重要作用。总结 在本研究中，作者比较了胆囊癌（GBC）和腺瘤性病变（GBA）之间肿瘤微环境（TME）的细胞组成。结果表明，上皮间质转化（EMT）在 GBA 细胞的恶性转化中发挥重要作用，而 ERFs 通过 COL1A2-CD44 调控免疫细胞的差异。本研究为深入探究腺瘤-癌序列的潜在机制以及 GBC 的恶性生物学行为奠定了基础。
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