3.1. BaP 诱导的胶质母细胞瘤靶点及其相关生物学效应为了系统地探索 BaP 诱导的胶质母细胞瘤潜在的扰动机制，作者首先从 ChEMBL、PharmMapper 和 SEA 数据库中检索了 473 个独特的 BaP 相关靶基因（ 图 1A）。同时，从 GeneCards、TTD 和 OMIM 数据库中收集了 253 个独特的胶质母细胞瘤相关靶基因（ 图 1B）。通过交集分析，发现了 31 个交集基因，这些基因可能参与 BaP 诱导的胶质母细胞瘤发病机制（ 图 1C）。图 1. BaP 诱导的胶质母细胞瘤的潜在靶点鉴定及功能富集分析。(A) ChEMBL、PharmMapper 和 SEA 数据库之间共享的 BaP 相关靶基因的维恩图。(B) GeneCards、OMIM 和 TTD 数据库之间共享的胶质母细胞瘤相关靶基因的维恩图。(C) 维恩图分析识别与 BaP 暴露和胶质母细胞瘤相关的潜在靶基因。(D) 与 BaP 暴露和胶质母细胞瘤相关的潜在靶基因网络。(E) 使用 STRING 数据库构建的 BaP-胶质母细胞瘤相关靶基因的 PPI 网络。(F, G) 使用 Cytoscape 3.9.3 对 PPI 网络进行进一步可视化和分析。节点根据其度值进行着色和大小调整，较深颜色和较大圆圈表示更强的相互作用。PPI 分析揭示了 31 个交集靶标之间的复杂相互作用（ 图 1D）。在高置信度 PPI 网络中，节点 TP53、EGFR、CDKN2A、SRC 和 HSP90AA1 显示出高数值（分别为 28、28、26、25 和 25）（ 图 1E）。根据 MCC 排名前 5 的基因包括 TP53、EGFR、CDKN2A、SRC 和 HSP90AA1（ 图 1F），并对其相应的 PPI 网络和拓扑参数进行了分析（ 图 1G）。为了研究 31 个交集基因的生物相关性，作者进行了 GO 和 KEGG 富集分析。GO 分析显示在三个主要类别—生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）—中存在显著富集，并从每个类别中选择了前 10 个术语进行进一步解释。富集的生物学过程包括 PI3K/AKT 信号通路、腺体发育和蛋白磷酸化的正向调控。富集的细胞组分主要与焦亡斑、细胞-基底连接和细胞突出膜相关。在分子功能中，跨膜受体酪氨酸激酶活性尤为突出，涉及 EGFR 和 SRC 等核心蛋白，这些蛋白通过将细胞外信号（如生长因子）传递到细胞内信号级联来调控细胞增殖、分化和存活。这些富集通路和功能类别突出了 BaP 可能影响 GBM 发生和进展的关键机制（ 图 2A-C）。图 2。(A-C) 代表 BaP-GBM 靶点的 GO 富集分析。(D) 代表 BaP-GBM 靶点的 KEGG 富集分析。KEGG 通路分析显示在多个通路中存在显著富集，如 PI3K-Akt 信号通路、癌症中的蛋白聚糖、Rap1 信号通路、感染相关通路以及与代谢药物耐药性相关的通路（ 图 2. D）。基于这些通路的研究结果促使作者验证 BaP 与 GBM 之间的物理相互作用。分子对接分析揭示了 BaP 与关键蛋白靶标之间的特异性结合相互作用（ 表 1, 图 3）。在 CDKN2A 上，BaP 与 VAL5 和 LEU40 形成疏水相互作用，与 ARG41、GLY44、ALA43 和 GLU4 形成范德华相互作用，并与 TYR8 形成 Pi-Pi T 型相互作用，结合亲和力为-8.4 kcal/mol。在 EGFR 上，观察到与 ALA763、ILE759、MET766、LEU777 和 LEU788 的疏水相互作用，与 THR790、THR854、ASP855、LYS745 和 LEU747 的范德华相互作用，与 GLU762 形成 Pi-阳离子相互作用，与 ARG858 形成 Pi-阴离子相互作用，以及与 LEU788 形成 Pi-σ相互作用（-10.7 kcal/mol）。对于 HSP90AA1，BaP 与 VAL186 和 ALA55 形成疏水相互作用，与 ILE96、GLY108、ALA107、PHE138、ASN51、LEU48、ASP93、THR184、SER52 和 GLY97 形成范德华相互作用，与 MET98 形成 Pi-阳离子相互作用，与 LYS58 形成 Pi-阴离子相互作用（-9.7 kcal/mol）。 在 SRC 上，发生了与 ALA293、LEU273 和 LEU393 的疏水相互作用，与 ASP404、ALA403、THR338、GLU339、MET341、TYR340、SER342、GLY344 和 SER345 的范德华相互作用，以及与 VAL281、LEU273 和 LEU393 的 Pi-Sigma 相互作用（−10.3 kcal/mol）。在 TP53 上，BaP 与 ARG1595 形成疏水相互作用，与 GLU1591、ASN1594、ARG1597 和 GLN1598 形成范德华相互作用，并与 ARG1595 形成 Pi-Sigma 相互作用（−9.3 kcal/mol）。研究发现，BaP 通过多种稳定相互作用结合这些蛋白的关键功能区域——包括激酶活性位点、DNA 结合域和蛋白-蛋白相互作用界面。这表明 BaP 可能通过损害 CDKN2A 和 TP53 的抑癌功能，或破坏 EGFR、HSP90AA1 和 SRC 等信号激酶和分子伴侣的活性，从而扰乱细胞周期控制、增殖信号传导和应激反应通路，进而促进 GBM 的发展。 图 3. BaP 与 5 个核心靶蛋白的分子对接分析。3.3. GBM 组织中核心靶基因的 GSVA 分析和单细胞表达谱对 GSE 131928 10x 数据集进行单细胞测序，将所有细胞注释为八种细胞类型：OPC 样恶性细胞、少突胶质细胞、髓系细胞、NPC 样恶性细胞、恶性细胞、MES 样恶性细胞、T 细胞和 AC 样恶性细胞（ 图 4A）。Hallmark 基因集的通路富集分析（ 图 4B）显示，胶质母细胞瘤恶性细胞亚型高度富集于增殖和生存相关通路（如 HALLMARK_E2F_TARGETS），而非恶性细胞如小胶质细胞则富集于免疫和代谢通路。图 4. 单细胞测序分析. (A) GSE131928 数据集中的细胞类型注释，显示鉴定出八种细胞类型. (B) GSE131928 数据集的 GSVA 分析. (C-D) GBM 中不同细胞亚型间 5 个靶基因的异质性表达.如图 4C 和 D 所示，EGFR 在 UMAP 分析中高度富集于特定的恶性细胞亚群，显示出强信号，而在其他簇中几乎不存在。与气泡图一致，其平均表达水平在 AC 样恶性细胞中显著升高；然而，只有某些 AC 样亚群显示 pct.exp 超过 50%，而其在其他细胞类型中的流行度仍然很低。这种模式突出了其高度特异性和有限的表达范围。相比之下，TP53 在 UMAP 分析中被检测到存在于多个细胞簇中，强度各异，其中一些恶性亚群显示出更强的信号。气泡图进一步表明，其表达在细胞类型中相对均匀，通常涉及 30–50%的细胞，具有中等的平均表达水平。CDKN2A 在 UMAP 分析中表现出弥散和微弱的表达模式，只有少数簇显示出中等信号。气泡图揭示，其表达在大多数细胞类型中较低（<30%），伴随着低平均表达。 在 UMAP 上观察到 SRC 存在于多个恶性亚群以及一小部分非恶性细胞中。气泡图证实，在某些恶性亚群中，大约 40%的细胞表达 SRC，整体平均表达水平为中等至低。最后，HSP90AA1 在 UMAP 上表现出广泛表达，在许多簇中呈现中等信号强度，并在特定的恶性亚群中呈现强信号。气泡图进一步证实，它在各种恶性亚型（例如 AC 样和 MES 样）中具有高平均表达水平和高表达细胞比例，表明 HSP90AA1 在调节恶性细胞生理功能中发挥着广泛作用。3.4. 目标蛋白水平与胶质母细胞瘤风险的孟德尔随机化分析为确定因果关系，作者采用双样本孟德尔随机化方法，检验了五个靶蛋白的表达水平与胶质母细胞瘤（GBM）风险之间的因果关系，分析主要在欧洲血统占主导的队列（eQTLGen）中进行。具体而言，在 FinnGen R12 队列（n=406）中，IVW 方法显示出 TP53 水平与 GBM 之间存在显著的负相关关系（OR=0.430，95% CI：0.037–0.474；p=0.002）。敏感性分析未发现显著的异质性或水平多效性（p > 0.05）。此外，其余四个蛋白未检测到显著的因果关系。RMSD 通过量化原子位置与其初始坐标的偏差来反映蛋白质-配体复合物的整体构象稳定性，较小的值表示更高的稳定性。因此，RMSD 被用于评估系统平衡。如图 5A 所示，TP53-BaP 复合物在大约 75 ns 时达到平衡，随后稳定在 1.8 Å左右。Rg 表征蛋白质结构的紧凑性。如图 5B 所示，TP53-BaP 复合物仅表现出轻微的 Rg 波动，表明在模拟过程中发生了微小的构象重排。SASA 反映了蛋白质表面暴露于溶剂的面积，也进行了监测。如图 5C 所示，观察到轻微的 SASA 波动，表明 BaP 结合在蛋白质表面诱导了局部微环境变化。此外，还进行了 RMSF 分析以评估单个氨基酸残基的柔性。如图所示。 5D, TP53-苯并[a]芘复合物始终显示较低 RMSF 值（大多低于 2 Å），表明残基运动受限和整体结构稳定性。图 5. BaP-TP53 的分子动力学模拟。(A) BaP-TP53 的 SASA 值随时间变化。(B) BaP-TP53 的 Rg 值随时间变化。(C) BaP-TP53 的 RMSD 值随时间变化。(D) BaP-TP53 的 RMSF 值。(E) U87 细胞在用不同浓度的 BaP 处理不同时间后的相对吸光度值。(F) BaP 处理对 U87 细胞迁移的影响。(G) U87 细胞在用不同浓度的 BaP 处理后 P53 和 cGAS 蛋白的表达水平。CCK-8 实验表明，在 0-72 小时的观察期内，U87 细胞的活力在不同苯并[a]芘（BaP）浓度下呈现时间依赖性增加。在 0.1-10 μM 浓度范围内，与 DMSO 对照组相比，BaP 处理显著增强了细胞增殖（P < 0.05）。反映活细胞数量的吸光度值随暴露时间的延长而逐渐增加，在约 10 μM BaP 时观察到最显著的效果。这些结果表明，BaP 以剂量和时间依赖性方式促进 U87 细胞增殖（ 图 5E）。一致地，Transwell 实验显示，在 1.5×10⁴细胞的接种密度和 24 小时处理后，10 μM BaP 处理组的细胞进入下室的数目显著高于对照组（P < 0.05）（ 图 5F）。这一结果表明，BaP 增强了 U87 细胞的迁移能力。 这些发现共同表明，在特定的浓度和时间范围内，BaP 能够促进 U87 胶质母细胞瘤细胞的增殖和迁移。3.7. BaP 对 P53 和 cGAS 蛋白表达的影响如图 5 所示，Western blot 分析显示，随着 BaP 浓度从 0 μM 增加到 10 μM，P53 蛋白水平逐渐降低。相应的定量分析证实了 P53 表达的显著减少，5 μM 和 10 μM 组与 0 μM 对照组相比均显示出高度显著的降低。相比之下，cGAS 蛋白水平以浓度依赖性方式增加。随着 BaP 浓度的增加，蛋白条带强度增强，定量分析显示相对 cGAS 表达的显著升高，0 μM 与 5 μM 之间存在显著差异，0 μM 与 10 μM 之间存在高度显著差异。图 6A 展示了 2000 年至 2025 年 TP53 和胶质母细胞瘤相关文献的年度分布和累积数量。在此期间共识别出 320 项研究。总体而言，关于 TP53 和胶质母细胞瘤的研究呈现出持续年度增长的趋势。 图 6B 显示，TP53 和胶质母细胞瘤领域主要关注“表观遗传沉默”、“脑肿瘤”和“治疗”等子主题，表明 p53 基因功能、肿瘤的表观遗传调控以及临床治疗策略是研究的重点。对“星形细胞母细胞瘤”、“脑胶质细胞病性脑病”等集群的聚类分析，反映了胶质母细胞瘤及其他胶质瘤亚型的识别和异质性研究；而“动态”、“细胞毒性效应”等则指向肿瘤发生机制和药物作用的研究。 6C 显示了该领域随时间推移的聚类主题演变，从关注“星形细胞瘤”的基本分型和分子机制、“表观遗传沉默”等主题，到中期扩展至“系统机制”。从早期关注“星形细胞瘤”和“表观遗传沉默”等基本分型和分子机制，到中期扩展至“系统效应”、“基因转移”等方向，反映了肿瘤系统和基因治疗的 影响，再到近期关注“mgmt 酶”和“胶质母细胞瘤酶”以及“胶质母细胞瘤”，反映了由临床难题（例如替莫唑胺耐药性）推动的研究深化。如图 6D 所示，关键词聚类分析识别出四个清晰定义的聚类，表明该研究领域内部存在主题分化。蓝色聚类以“星形细胞瘤”、“扩增”、“生长因子受体”和“抑癌基因”等关键词为特征。绿色聚类则聚焦于“通路”、“胶质母细胞瘤”、“体内”和“体外”等关键词。 红色簇包括“P53”、“表达”和“磷酸化”。最后，黄色簇由关键术语“化疗”、“放疗”、“生存”和“管理”关键词组成。 图 6E 通过关键词引用爆发图展示了胶质母细胞瘤领域的研究重点演变。早期阶段，诸如“恶性胶质瘤”、“野生型 p53”和“脑肿瘤”等关键词反映了肿瘤恶性特征及相关基因突变的研究。中期阶段转向“抑制”、“生存”和“星形细胞瘤”等术语，突出了 TP53 作为核心靶点及其功能机制的研究。近期前沿，包括“替莫唑胺辅助治疗”和“联合治疗”的关键词显示了胶质母细胞瘤辅助治疗和联合方案的临床研究。此外，“纳米颗粒”、“IDH1”和“靶向肌肉再神经化”等术语表明研究扩展至精准医疗、基于纳米颗粒的新型递送系统和多学科整合，展现了胶质母细胞瘤研究领域的尖端趋势。 图 6F 展示了引用爆发强度最高的前 25 个关键词，包括“辅助替莫唑胺”、“治疗”、“死亡”和“癌症”等术语。这些关键词在 2025 年持续的爆发期表明，相应的研究领域处于该领域的最前沿。因此，这些主题预计将在未来的研究中保持高度相关性和活跃的探索。 图 6. (A) 发表论文的年度数量和累积数量。(B) CiteSpace 的关键词主题聚类视图。(C) CiteSpace 的关键词时间线。(D) Vosviewer 的关键词聚类。(E) Vosviewer 的关键词时间交集可视化。(F) 出现频率最高的前 25 个关键词。总结 BaP 可能通过靶向关键基因——尤其是 TP53——并破坏关键信号通路来促进 GBM 的发展。作为中心介质，TP53 可能被 BaP 下调，从而损害 DNA 损伤修复并促进肿瘤发生。本研究为阐明 BaP 在 GBM 中的作用提供了一个全面的框架，并为开发针对 GBM 的预防和治疗策略提供了宝贵的见解。
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