 建立OA大鼠模型，评价不同剂量水平的GZZSZTW对KOA的治疗效果（图1A）。首先，步态分析结果显示，模型组左前（FL）、右前（FR）、左后（RL）和右后（RR）的步幅均有所减少;同时，与空白组、不同剂量的GZZSZTW组和阳性对照（PC）组相比，摆动时间和站立时间均显著延长（p < 0.01）。此外，模型组RR的制动时间较空白组延长，而不同剂量的GZZSZTW组和PC组的制动时间缩短。总体而言，这些结果表明，不同剂量的GZZSZTW通过增强四肢的协调性和调节步态周期，显着提高了大鼠的运动能力[图1，B-E]。在承重能力评估中，各组的爪式持续时间和爪子面积（前）没有观察到显着差异。然而，在模型组中，观察到左右前肢的承重能力存在显着差异（p < 0.01）。相比之下，不同剂量的GZZSZTW组和PC组无显著差异（p > 0.05）。值得注意的是，在模型组中，爪接触持续时间、承载能力和左右后肢接触面积存在显着差异。在GZZSZTW低剂量（GZZSZTW-L）和GZZSZTW中剂量（GZZSZTW-M）组中，这些差异有所减少，而在GZZSZTW高剂量（GZZSZTW-H）组或PC组中没有观察到显着差异（图2A-F）。此外，模型组右膝关节的承重能力明显低于其他组，在接受不同剂量的GZZSZTW和塞来昔布治疗后，这种情况有所改善（图3A）。使用苏木精和曙红（H&E）和番红素O-Fast Green染色进行组织学分析，结果显示，模型组的软骨层较薄，表面较粗糙，膝关节组织细胞外基质生成减少。不同剂量的GZZSZTW和塞来昔布治疗后，关节面看起来更光滑，软骨细胞排列良好，基质产生增加。重要的是，GZZSZTW显示出更强的治疗效果，OA进展的剂量依赖性减少（图3B和C）。Micro-CT和三维重建技术揭示了不同治疗组大鼠膝关节的结构变化。与空白组相比，模型组表现出关节面的不规则凹陷、磨损和侵蚀，并伴有软骨下骨腔的形成和关节间隙的变化。然而，这些条件在不同剂量的GZZSZTW组和PC组中有所改善（图4A）。此外，与模型组相比，不同剂量的GZZSZTW组和PC组的骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）和小梁厚度（Tb.Th）均有显著改善（p > 0.05）（图4B）。通过对血清验证生物标志物的研究，结果与空白组相比，模型组血清白细胞介素（IL）-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、炎症因子水平升高（P < 0.001）。与PC组类似，GZZSZTW显著提高了上述水平（p < 0.01）（图4C）。结果表明，GZZSZTW表现出剂量依赖性作用，可以通过增强OA中炎症生物标志物的表达来缓解KOA。为了评估潜在的肝肾毒性，进行了血液学和生化测试。这些分析表明，不同GZZSZTW剂量组的血清ALT、AST、肌酐（Crea）或尿素水平没有显着变化（p > 0.05）。这表明，在目前的实验条件下，干预并没有显着影响肝肾功能（图4D）。 图1.大鼠后肢步态分析结果.A：实验时间线示意图;B：摆动时间（s）;C：制动时间（s）;D：站立时间（s）;E：步幅（厘米）。与空白组相比，*p < 0.01，** p < 0.001;与模型组相比，# p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.001。图2.大鼠后肢负荷的影响。A：爪子放置的持续时间（前）;B：爪子放置的持续时间（后）;C：爪子重量（%）（前）;D：爪子重量（%）（后）;E：爪子面积（毫米）（前）;F：爪子面积（毫米）（后）。与右侧相比，* p < 0.01，** p < 0.001。图3.大鼠膝关节（A）、H&E（B）和番红素O-fast绿染色（C）的负重能力试验。与空白组相比。* p < 0.001;与模型组相比，# p < 0.001。（有关本图例中对颜色的引用的解释，读者请参阅本文的网络版本。图4.GZZSZTW对KOA动物模型的影响A：显微计算机断层扫描和三维重建;B：骨密度和微观结构;C：血清炎症标志物;D：肝肾功能指标。与空白组相比：* p < 0.01，** p < 0.001;与模型组相比，# p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.001。基于“2.1”的结果，GZZSZTW-H组对KOA表现出最佳的剂量反应关系。因此，选择空白组、模型组和GZZSZTW-H组进行LC/MS分析。在正离子和负离子模式下进行数据分析。主成分分析（PCA）评分结果显示，QC具有良好的重现性，表明分析体系稳定[图5 A1-A2]。采用OPLS-DA进行组间比较，结果表明，空白组、模型组和GZZSZTW-H组在两种离子模式下均可区分[图5 B1-C2]。这表明动物体内的某些代谢物水平在病理条件下发生了变化。在偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型中，R2和Q2均达到要求标准;排列检验表明，该模型稳定可靠，适合进一步进行数据分析[图5 D1-E2]。结果表明，GZZSZTW-H可以改善KOA大鼠血清中的代谢异常。图5.血清代谢组学的多因素统计分析。A1-A2：正负离子模式下的PCA评分图;B1-B2：模型组和空白组在正离子和负离子模式下的OPLS-DA评分图;C1-C2：模型组和GZZSZTW-H组在正离子和负离子模式下的OPLS-DA评分图;D1-D2：正负离子模式下模型组和空白组的200次排列试验;E1-E2：200次排列试验，比较模型组和GZZSZTW-H组在正负离子模式下的对比。图6A 说明了比较模型组、空白组和 GZZSZTW-H 组的总体代谢物谱。以“VIP > 1、p < 0.05、倍数变化（FC）< 0.8或FC > 1.2”为阈值，鉴定模型组-空白组和模型组-GZZSZTW-H组的差异代谢物。共获得126种潜在生物标志物（图6B），其中53种代谢物属于人类代谢组数据库。为了可视化模型组、空白组和治疗组之间差异代谢物的变化，使用了聚类热图（图6C）。在热图中，模型组聚类为一类，对照组和治疗组聚类为另一类，表明模型组的差异大于对照组。治疗组与对照组的聚类表明，这些差异代谢物的表达趋势在数量上相对一致，并表现出良好的相关性。图6.火山图、维恩图、热图和已鉴定差异代谢物的 KEGG 富集分析。A-B：比较模型组和空白组之间以及 GZZSZTW-H 组与其他组之间代谢物的火山图。这些图是根据FC和P值构建的，红点表示有统计学意义的上调代谢物，蓝点表示有统计学意义的下调代谢物，灰点表示代谢物无显著差异;B：126种差异表达代谢物的维恩图;C：差异代谢物热图分析，蓝色条带表示代谢物水平降低，红色条带表示代谢物水平升高;D：126 种差异表达代谢物的富集途径。（有关本图例中对颜色的引用的解释，读者请参阅本文的网络版本。图6D 说明了使用 MetaboAnalyst 5.0 在线工具对 126 种差异代谢物进行代谢途径富集分析，结果可视化为气泡图，其中每个气泡代表一条代谢途径。在已确定的途径中，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、组氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、卟啉代谢、丁酸盐代谢、柠檬酸盐循环以及泛酸盐和辅酶A生物合成。值得注意的是，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢表现出最高的P值和影响值，使其成为本分析中最重要的代谢途径。总之，代谢组学结果显示血清代谢改变。GZZSZTW可以通过调节代谢物来缓解KOA症状，减少代谢紊乱。此外，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢;精氨酸生物合成;组氨酸代谢;缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成是GZZSZTW发挥治疗作用的主要代谢途径。使用第5.4.2.1节中描述的色谱和质谱条件，UPLC-Q-TOF-MSE采用技术检测测试溶液和参比溶液。该过程生成了GZZSZTW正离子和负离子的基峰离子（BPI）图（图7A和B）。图7.GZZSZTW在负离子模式（A）和正离子模式（B）下的BPI图谱。MassLynx V4.1软件用于数据采集，化合物可快速与UNIFI平台上的数据库进行匹配。复合错误筛选标准设定为<1×10-5.通过比较对照物质的质谱信息、二次质谱碎片离子数据、参考文献和质谱碎裂模式来完成化合物鉴定。本研究共初步鉴定和表征了196种化合物，包括94种类黄酮化合物、37种有机酸类化合物、29种酚类化合物、21种萜类化合物和15种其他化合物。结果总结在表1中配方中共检出94种黄酮类化合物，主要来源于YYH、GSB和JXT。一小部分类黄酮来源于 GJ、SY、LFZ 和 SDH。以化合物129（tR=13.30 min）为案例研究，研究了8-戊烯基类黄酮苷的片段化模式。在负离子模式下，在m/z 513.1781处观察到准分子离子峰[M-H]。在二次质谱中，[M-H]经历糖苷键裂解，失去鼠李糖（Rha），在m/z 367.1156处形成碎片离子[M-H-Rha]。[M-H-Rha] 进一步丢失 -C3H8 产生 [M-H-Rha-C----3H8]-在 m/z 367.1156。此外，[M-H-Rha] （m/z 367.1156） 也失去了 -C-4H8，在 m/z 311.0561 处产生 [MH-Rha-C4H8]。此后，-OH 的损失和从系统中掺入一个氢原子以实现稳定性导致 [MH-Rha-C-4H8O] 在 m/z 295.0558。考虑到碎片细节（图8A），与参考物质宝花苷I（图8B）和碎片规则（图8C）进行比较，作者鉴定出化合物129为宝花苷I。-图8.保活苷I（样品（A），标准品（B））的质谱图和可能的切割途径（C）。化合物 143 （tR=14.55 min） 在负离子模式下在 721.2341 处产生准分子离子峰 [M+ HCOO]。在二次质谱中，发生糖苷键裂解，导致一个葡萄糖分子丢失，形成m/z 513.1781 处的碎片离子 [M-H-Glu]。进一步裂解导致鼠李糖丢失，产生碎片离子 [M-H-Glu-Rha] 在 m/z 367.1156。如果进一步损失一个 CH---3分子发生，碎片离子 [M-H-Glu-Rha-CH3H] 在 m/z 351.0856 处形成。继续这个过程，一个 CO 分子的损失导致碎片离子 [M-H-Glu-Rha-CH-3H-CO]，位于 m/z 323.0916。碎裂模式和规则与淫羊藿苷参考化合物的片段模式和规则相匹配（Chang 等人，2021 年），证实化合物 143 是淫羊藿苷。质谱图和碎裂图如图9A-C所示。-图9.淫羊皮苷（样品（A），标准品（B））和可能的切割途径（C）的质谱图。以化合物74（tR=5.67 min）为例，分析了二氢黄酮醇二糖苷的片段化模式。在负离子模式下，该化合物在m/z 579.1690处表现出准分子离子峰[M-H]。二次质谱揭示了两个主要的碎裂途径：-C 的直接丢失-6H8O 来自 [M-H]-，产生碎片离子 [M-H-C6H8O]在m/z 459.1123处，糖苷键的裂解导致Rha的损失在m/z 403.0006处形成碎片离子[M-H-Rha]。进一步的碎裂导致葡萄糖 （Glu） 的损失，在 m/z 271.0614 处产生碎片离子 [M-H-Rha-Glu]。此外，额外损失 -C---6H8来自 [M-H-Rha-Glu] 的 O 产生碎片离子 [M-H-Rha-Glu-C-6H8O] 在 m/z 151.0074。通过分析碎裂模式（图10A），将其与参考化合物柚皮苷（图10B）进行比较，并应用碎裂规则（图10C），作者鉴定出化合物74为柚皮苷。-图10.柚皮苷的质谱图（样品（A），标准品（B））和可能的切割途径（C）。以化合物18（tR=1.98 min）为例，分析了黄烷醇的碎裂模式。在负离子模式下，它在m/z 289.0755处产生准分子离子峰[M-H]。在二次质谱中，一分子 CO 的损失-2从[M-H]产生碎片离子[M-H-CO-2]-在 m/z 245.0827。进一步失去 C2H2O从该离子中产生碎片离子[M-H-CO2-C2H2O] 在 m/z 203.0755 处，随后又损失了另一个 C-2H2O基生成碎片离子[M-H-CO2-C2H2O-C2H2O] 在 m/z 161.0275 处。根据片段化信息（图11A），对表儿茶素标准品（图11B）的参考和片段化规则（图11C），化合物18被鉴定为表儿茶素。-图11.表儿茶素的质谱图（样品（A），标准品（B））和可能的切割途径（C）。该配方中共检测到37种有机酸化合物，主要来源于SDH、LFZ、JXT、GJ，SY、GSB和YYH的贡献较小。这些有机酸主要由脂肪酸和芳环组成，被酚羟基取代，在质谱条件下往往在羰基处碎裂，形成碎片离子或经历中性损失H2O、COOH 和 CO2分子。通过分析，鉴定出33种酚酸组分和4种脂肪酸组分。以化合物16（tR=1.86 min）为例，检查酚酸的碎裂模式。在负离子模式下，它在m/z 153.0214处产生准分子离子峰[M-H]。二次质谱显示，从[M-H]中丢失一个分子会导致碎片离子[M-H-CO--2]-在 m/z 109.1359。通过分析碎裂数据（图12A），将其与原儿茶酸参考品（图12B）进行比较，并应用碎裂规则（图12C），化合物16被鉴定为原儿茶酸。图12.原儿茶酸（样品（A），标准品（B））和可能的裂解途径（C）的质谱图。该配方中共鉴定出 26 种苯丙烷类化合物，主要来源于 SDH，以及 GJ、JXT、LFZ 和 YYH 的较小贡献。以化合物13（tR=1.79 min）为例，分析了简单苯丙素的碎裂模式。在负离子模式下，它在m/z 353.0871 处产生准分子离子峰 [M-H]。在二次质谱中，失去-C-7H12O6从 [MH] 中，碎片离子 [MHC-7H12O6]- (m/z 179.0392）生成。一分子CO的进一步损失2导致碎片离子 [M-H-C7H12O6-一氧化碳2]- (m/z 135.0483）。此外，在失去 -C 之后9H7O3从二次质谱中的[M-H]，碎片离子[M-H-C-9H7O3]- (m/z 191.0579）成立。随后，CO 和 2H 的损失2O 导致碎片离子 [M-H-C9H7O3-CO-2H2O] （m/z 127.0455）。破碎信息和裂解规律与文献报道一致（Li et al.， 2021a），证实化合物13为新绿原酸。开裂图如图13所示。-该配方中共检测到20种萜类化合物，主要来源于SDH，SY、GSB、JXT、YYH的贡献较小。通过分析，鉴定出9种环烯醚萜甙、5种单萜、5种五环三萜和1种四环三萜。三萜类化合物是三大次生代谢物之一，根据它们所含的结构单元数量进行分类：单环、双环、三环、四环和五环三萜。其中，四环和五环三萜是最常见的。以化合物185（tR=32.91 min）为例，分析了五环三萜的碎裂模式。化合物185在正离子模式下在m/z 457.3717处产生准分子离子峰[M + H]。在二次质谱中，一个分子的H+2来自[M + H]的O产生碎片离子[M + HH+2O] 在 m/z 439.3626。一个HCOOH分子的进一步损失导致m/z 411.3661处的碎片离子[M + HHCOOH]的损失，随后另一个H++2O 产生碎片离子 [M + HHCOOHH2O] 在 m/z 393.1509。此外，在正离子模式下，m/z 457.3614处的准分子离子峰[M + H]在二次质谱中发生RDA裂解，形成碎片离子[M + HC++14H24O] （m/z 249.1898） 和 [M + HC+16H24O2]+ (m/z 208.0689）。碎片化规则（图14）与文献报道一致（胡等人，2018;Sun 等人，2023 年），证实化合物 185 是熊果酸。GZZSZTW中血液可获取成分的鉴定和靶向网络药理学分析在最后一次给药后一小时采集血清样本。The UPLC-Q-TOF-MSE该方法用于分析空白和含药物血清样品，获得正离子和负离子模式下的BPI色谱图，所示。通过使用UNIFI平台进行快速比较，参考了相关文献、空白血清，并与GZZSZTW体外化学成分的保留时间和碎片离子进行了比较。血清样品中共鉴定出41种原型成分，其中类黄酮类化合物12种，有机酸类化合物8种，环烯醚萜类化合物6种，酚类化合物2种，苯丙烷类化合物2种，苯乙酰甙类化合物1种，其他化合物7种。GSE169077数据集由来自软骨的全基因组表达谱组成，其中包括来自 OA 患者的 5 个样本和来自健康对照样本的 6 个样本。GSE169077使用标准 |logFC|> 0.5，p < 0.05。结果以火山图和热图的形式呈现（图15A和B）。共鉴定出1949个基因，其中上调基因1002个，下调基因947个。此外，分别从 Genecards、CTD 和 DisGeNET 数据库中获得了 511、368 和 445 个 KOA 相关靶标，并删除了重复项，总共产生了 1085 个靶标。使用WeOmics在线绘图平台，计算了从基因表达综合（GEO）获得的疾病靶点与从基因卡、CTD和DisGeNET获得的疾病靶点的交集，得到212个交集靶标（图15C）。图15.“疾病-中医”相关靶点及其交集靶点的识别。A：KOA患者与健康个体比较的GSE169077数据集中DEGs的火山图;B：DEGs的热图;C：DEGs与Genecards、CTD和DisGeNET靶点的交集，代表KOA相关靶点;D：GZZSZTW和KOA之间的交集靶点，代表“疾病-中医”核心靶点;E：“配方-中药-活性成分-核心靶点-疾病”之间关系的多维网络图。基于 GZZSZTW 的 41 个血液可访问原型成分，使用 Swisstargetprediction 和 SuperPred 数据库预测潜在目标点。除未产生结果的Cibotiumbaroside I外，共获得1884个预测靶点，并删除重复项，产生626个唯一靶点。这些靶点与先前确定的212个KOA相关靶点的交集导致了32个交集靶点，这些靶点被选为后续分析的核心靶点（图15D）。利用Cytoscape 3.9.1构建多维网络图，表示“配方-中药-活性成分-核心靶点-疾病”之间的关系。该网络包括 73 个节点和 196 个边缘，在排除与核心目标无关的组件后保留了 32 个活动组件。结果表明，这些化学成分可以作为GZZSZTW治疗KOA的药理学基础（图15E）。构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络与基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析为了进一步探索GZZSZTW治疗KOA的机制，将32个核心靶点导入STRING数据库和Cytoscape软件，创建PPI网络（图16A）。排除无连接目标后，PPI网络由29个目标和118条边组成。使用Cytoscape中的CytoHubba插件进行拓扑分析，采用度中心性（DC）、中心性之间（BC）和紧密度中心性（CCe）作为标准，单独识别前10个节点。这三个标准的交集表明，缺氧诱导因子1（HIF-1）、基质金属蛋白酶（MMP）9、MMP2、细胞周期蛋白D1（CCND1）、阿贝尔森酪氨酸蛋白激酶1（ABL1）、溶质载体家族2成员1（SLC2A1）和髓过氧化物酶（MPO）是GZZSZTW解决KOA的关键靶点（图16B）。这七个靶点对应于配方中7种中药成分中的21种活性化合物。图 16.关键靶点的识别和GO/KEGG富集分析。A：核心标的PPI网络;B：翻转图显示了DC、CCe和BC排名前10个目标的交集，确定了关键目标;C：核心靶点GO富集分析;D：核心靶点的KEGG富集分析。将32个核心靶点纳入DAVID数据库，进行GO和KEGG富集分析。分析揭示了 108 个生物过程 （BP） 术语、26 个分子功能 （MF） 术语和 21 个细胞成分 （CCo） 术语。使用气泡图可视化基于P 值的前 5 个 BP 项、前 5 个 MF 项和前 5 个 CC 项，以及按 P 值计算的前 20 个 KEGG 通路。主要的 BP 术语包括对缺氧、DNA 模板化、胶原分解代谢过程和细胞外基质分解的反应。MF 术语包括丝氨酸型内肽酶活性、组蛋白去乙酰化酶结合和 ATP 结合。CC项主要与细胞外区域和细胞表面相关，如图16C所示。KEGG富集结果表明，核心靶点参与HIF-1信号通路、IL-17信号通路和Th17细胞分化等通路，如图16D所示。HIF 是一种异二聚体复合物，由连续表达的 HIF-β 亚基和氧敏感 HIF-α 亚基组成（Semenza，2003）。HIF-1 信号通路显着促进 OA 的病理发展，包括炎症反应、血管生成和各种细胞类型的代谢变化（Fernández-Torres 等人，2015 年;Semenza，2003 年;Yang 等人，2021 年;Yudoh 等人，2005 年）。研究表明，HIF-1α 促进促炎细胞因子的产生，如 TNF-α、IL-1β 和 IL-6（Capó 等人，2023 年;Chen 等人，2024a;Malkov 等人，2021 年）。这些细胞因子在驱动关节炎相关炎症方面起着至关重要的作用。此外，HIF-1α 促进巨噬细胞的激活并产生炎症介质，从而加重关节炎症（Fang 等人，2009 年;McGettrick 和 O'Neill，2020 年）。HIF-1α 是血管内皮生长因子 （VEGF） 的主要转录因子（Ahn 等人，2014 年）。在 OA 的滑膜组织中，高 VEGF 水平会促进血管生成，增强关节的局部血液供应，从而加剧炎症和组织损伤。此外，HIF-1α 可以促进其他血管生成因子的表达，包括血管生成素和血小板衍生生长因子，它们共同有助于 OA 的血管生成。关于细胞代谢，HIF-1α 促进从有氧代谢到无氧代谢的转变，促进糖酵解，这是软骨细胞的关键能量产生途径（Arai 等人，2024 年;Kong 等人，2021 年;Semenza，1999 年;Stegen 等人，2019 年）。这种代谢转变在炎症细胞中尤为显着（Zhang 等人，2015 年），因为它提供快速能量来支持炎症反应。HIF-1α 调节氨基酸代谢，促进炎症介质的产生和细胞增殖（Bouthelier 和 Aragonés，2020）。在 OA 中，软骨细胞细胞死亡是关节结构恶化的关键因素。HIF-1α通过调节抗氧化酶的表达和细胞凋亡相关蛋白的作用来影响软骨细胞的存活和细胞衰亡（Bohensky等人，2007年;胡等人，2020 年;Schipani 等人，2001 年）。同时，OA中的成纤维细胞有助于滑膜增生和炎症介质的释放;HIF-1α促进成纤维细胞的活化和增殖，进一步加剧炎症反应（Liu等人，2014）。关节炎中的软骨下骨、关节软骨和滑膜组织通常表现出缺氧微环境，这促进了 HIF-1A 的稳定和激活（Arai 等人，2024 年;Zhang 等人，2023 年）。研究表明，关节面上的软骨细胞遇到大约 6-10% 的 O2，而关节软骨最深层的人仅经历约 1-6 % O2 (Kiaer 等人，1988 年）。缺氧诱导的转录因子 HIF-1 促进了对这种缺氧环境的适应（Charlier 等人，2016 年;科英布拉等人，2004 年;Kiaer 等人，1988 年）。基于靶点的药理学和代谢组学，建立了相互作用网络，以阐明GZZSZTW对抗KOA的机制。利用 Cytoscape 软件中的 MetScape 插件，分析了来自人类代谢组数据库的 53 种差异代谢物，从而创建了“代谢物-反应-酶-基因”相互作用网络。该网络展示了生物信息如何从基因传递到代谢物。该网络中共有 189 个基因与靶点药理学中揭示的 32 个核心靶点进行了比较。分析表明，MPO是两组之间的共同靶点（图17A）。与MPO相关的重要代谢物包括黄嘌呤和尿酸盐，它们影响嘌呤代谢途径（图17B）。此外，MPO 被公认为 PPI 网络的核心目标。这些结果表明，MPO可能对GZZSZTW治疗KOA的治疗效果至关重要，并通过MD和MD模拟进一步证实了这一点。图 17.鉴定非靶向代谢组学和靶点药理学之间的交集靶点。A：维恩图显示了非靶向代谢组学中“代谢物-反应-酶-基因”相互作用网络中涉及的靶点与“GGZSZTW-KOA”核心靶点之间的交集;B：“代谢物-反应-酶-基因”相互作用网络中交集靶标调控的代谢途径和代谢物图。MD 是使用七种关键靶受体大分子及其相应的原型化合物进行的，这些原型化合物以小分子配体的形式进入血液。该评估旨在评估所选核心靶标与活性化合物之间的结合活性。按最佳结合能排名的前五名对接结果包括：SLC2A1-泡桐素 （-10.6 kcal/mol）、MMP9-原花青素 C1 （-10.2 kcal/mol）、MMP9-槲皮素 （-9.9 kcal/mol）、MPO-槲皮素 （-9.8 kcal/mol） 和 SLC2A1-Cibotiumbaroside A （-9.4 kcal/mol）。平均结合能为-9.98 kcal/mol，表明受体和配体之间具有优异的亲和力。这些发现如图 18A-E 所示。图 18.MD 结果的可视化。A：SLC2A1-泡桐素;B：MMP9-原花青素C1;C：MMP9-槲皮素;D：MPO-槲皮素;E：SLC2A1-辛脂苷A。均方根偏差（RMSD） 是蛋白质-配体构象稳定性的可靠衡量标准，表明原子位置偏离其初始结构的程度;较低的 RMSD 值反映了更高的稳定性。如图19所示 A：MPO-槲皮素在10 ns后达到平衡，波动在2.4 Å左右;MMP9-槲皮素在10 ns后稳定，在3.8 Å左右波动;MMP9-原花青素C1在65 ns后平衡，波动在4.0 Å左右;SLC2A1与Cibotiumbaroside A和Paulownin的复合物稳定在5 ns内，均在1.8 Å左右波动。这些发现表明，槲皮素、原花青素 C1、Cibotiumbaroside A 和 Paulownin 与 MPO、MMP9 和 SLC2A1 靶蛋白形成高度稳定的结合。图 19.蛋白质-配体复合物的 MD 模拟。答：蛋白质-配体复合物随时间变化的RMSD值;B：蛋白质-配体复合物随时间变化的Rg值;C：蛋白质-配体复合物随时间变化的SASA值;D：蛋白质-配体复合物随时间变化的HBonds值;E：蛋白质-配体复合物的RMSF值。回转半径（Rg） 反映了整体结构变化并测量蛋白质的致密性，Rg 变化越大表明系统扩张越大。MPO-槲皮素、MMP9-槲皮素和MMP9-原花青素C1复合物在模拟过程中表现出轻微的波动，表明配体-靶点相互作用的构象调整。相比之下，SLC2A1-Cibotiumbaroside A和SLC2A1-泡桐素复合物表现出稳定的Rg谱，表明在整个动力学过程中没有明显的结构膨胀或收缩（图19B）。在这些模拟中，在目标蛋白质-配体界面处测量了用于评估蛋白质表面形貌的溶剂可及表面积（SASA）（图19C）。研究结果显示，所有五种复合物的微小波动逐渐稳定，表明配体结合影响结合微环境并导致 SASA 发生可观察到的变化。氢键在配体-蛋白质相互作用中至关重要。图19d说明了小分子和目标蛋白质之间动力学过程中形成的氢键数量。MPO-槲皮素形成在 0 到 7 之间，具有大约 3 个氢键，大多数络合物表现出大约 3 个。MMP9-槲皮素形成 0-6，在大多数情况下大约有 4 个氢键。MMP9-原花青素C1之间的氢键数为0-9。氢键的数量。SLC2A1-CibotiumbarsideA 复合物范围为 0 至 8，在大多数情况下约为 5。SLC2A1-泡桐素络合物范围为0至6，在大多数情况下，络合物约有4个。这些结果表明，所有复杂系统都表现出强烈的氢键相互作用。RMSF分析如图19E所示，测量蛋白质中氨基酸残基的柔韧性。MPO-槲皮素、MMP9-槲皮素、MMP9-原花青素C1、SLC2A1-CibotiumbarsideA和SLC2A1-泡桐素络合物的RMSF值普遍较低（多在4 Å以下），表明稳定性较高。总体而言，这些复合物表现出高稳定性和有效结合。预测靶点的定量实时荧光定量PCR （qRT-PCR） 验证不同实验组膝关节软骨组织qRT-PCR分析显示，与Blank组相比，Model组MMP9、CCND1、MMP2、MPO、HIF-1A和ABL1的mRNA水平显著升高（p < 0.01）。相反，SLC2A1 mRNA 水平明显较低。用不同剂量的 GZZSZTW 治疗导致 MMP9、CCND1、MMP2、MPO、HIF-1A 和 ABL1 表达的剂量依赖性降低 （p < 0.01）。相反，SLC2A1蛋白水平以剂量响应方式增加（图20）。图20.不同剂量组大鼠关节软骨中靶mRNA的表达。与空白组相比：*p < 0.001;与模型组相比：# p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.001。膝关节关节软骨组织IHC分析显示，模型组HIF-1α、MMP2、MMP9水平显著升高。所有接受GZZSZTW治疗的组均表现出HIF-1A，MMP2和MMP9表达的剂量依赖性降低（图21A）。图 21.大鼠关节软骨中靶蛋白表达的分析。A：靶蛋白表达的IHC分析;B：靶蛋白表达的WB分析;C：WB蛋白表达水平的定量。与空白组相比：*p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001;与模型组相比：# p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.001。对各组动物的膝关节进行WB实验，以验证预测目标。与空白组相比，模型组的ABL1、HIF1A、MMP2、MMP9、CCND1和MPO蛋白表达水平显著升高，而SLC2A1蛋白表达量明显较低。用不同浓度的GZZSZTW处理后，MMP9和MPO的表达水平呈剂量依赖性下降，而SLC2A1蛋白表达相应增加（图19B和C）。图 21.大鼠关节软骨中靶蛋白表达的分析。A：靶蛋白表达的IHC分析;B：靶蛋白表达的WB分析;C：WB蛋白表达水平的定量。与空白组相比：*p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001;与模型组相比：# p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.001。对各组动物的膝关节进行WB实验，以验证预测目标。与空白组相比，模型组的ABL1、HIF1A、MMP2、MMP9、CCND1和MPO蛋白表达水平显著升高，而SLC2A1蛋白表达量明显较低。用不同浓度的GZZSZTW处理后，MMP9和MPO的表达水平呈剂量依赖性下降，而SLC2A1蛋白表达相应增加（图19B和C）。总结 代谢组学提供了一种通过全身分析了解疾病进展的综合方法，与中医的多靶点治疗方法一致。这项研究使用模式识别工具（如主成分分析）来分析治疗组之间的代谢特征和生物标志物的变化。作者的结果表明，GZZSZTW 具有显着的抗骨关节炎作用，经过验证的生物标志物证实了其减少氧化应激和炎症的能力。主要目的是阐明 GZZSZTW 如何对 KOA 起作用。这项研究证实了涉及调节 MMP9、MMP2、MPO、ABL1、HIF1A、CCND1 和 SLC2A1 的多靶点机制。此外，它还提供了一个方法论框架，结合了代谢组学、网络药理学和实验验证来研究中药制剂。总体而言，这些基础见解支持GZZSZTW治疗骨关节炎的临床开发。
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