|
肾小球或小管数据集的合并。差异表达式如图 1 所示。肾小球数据集的火山图显示 66 个上调基因和 148 个下调基因（图 1A），而管状数据集中有 221 个上调基因和 72 个下调基因（图 1B）。共获得 38 个上调基因和 26 个下调基因（见图 1C）。在两个合并数据集中识别差异表达基因。（A）肾小球数据集。（B）管状数据集。（C）肾小球与小管之间相交基因的文氏图。FC，弃牌。WGCNA 与肾小球合并数据区分了四个不同的簇，分别标记为模块（ME）蓝色（613 个基因）、ME 棕色（385 个基因）、ME 绿松石色（684 个基因）和 ME 灰色（1,235 个基因）（图 2A-C）。ME 棕色簇与 DKD 组的负相关性最为强烈（F=–0.66，P=2e-11）（见图 2D）。 在管状合并数据中，识别出五个不同的簇。它们分别是 ME 绿松石（506 个基因）、ME 黄色（342 个基因）、ME 蓝色（447 个基因）、ME 棕色（344 个基因）和 ME 灰色（1337 个基因）（见图 2E-G）。ME 灰簇与 DKD 组呈最强的正相关（F=0.83，P=2e-11）（见图 2H）。计算了肾小球与小管数据集的交点，并与源自差异表达分析的初步 DEGs 合并，形成了新的 DEGs 数据集。展示了 GO 和 KEGG 富集分析，显示主要病理通路包括细胞外基质（ECM）-受体相互作用、局部粘附、磷酰肌醇 3-激酶（PI3K）-Akt 信号通路等。显示了 GO 和 KEGG 分析中代表性的五项。通过加权相关网络分析识别关键表达基因。（A、B、C、D）肾小球合并数据。（E、F、G、H）管状合并数据。法医，模块。免疫浸润分析显示，肾小球数据集中 DEGs 主要富集于中枢记忆 CD4 T 细胞和浆细胞样树突状细胞（图 3A）。与对照组相比，DKD 患者在活化的 CD4 T 细胞（P<0.001）、调控 T 细胞（P<0.001）、记忆 B 细胞（P<0.001）和肥大细胞（P<0.001）中表现出显著活化（见图 3B）。在小管数据集中，DEGs 主要集中于未成熟树突状细胞、CD56dim 自然杀伤细胞、中央记忆 CD4 T 细胞和浆细胞样树突状细胞（见图 3C）。与对照组相比，DKD 患者中自然杀伤细胞（P<0.001）、效应记忆 CD8 T 细胞（P<0.001）、活化树突状细胞（P<0.001）和肥大细胞（P<0.001）均表现出显著活化（Fig. 3D）。因此，肥大细胞参与了肾小球和肾小管的共同免疫浸润模式。肾小球和微管的免疫浸润模式。（A，B）肾小球组织的免疫浸润。（C，D）免疫浸润于小管组织。ssGSEA，单样本基因集富集分析。PPI 网络图。经过对 Cytoscape 的全面计算，发现 15 个核心基因，分别是纤维素 1 型（FN1）、胶原蛋白 I 型α-2 链（COL1A2）、decorin（DCN）、胶原蛋白 III 型α-1 链（COL3A1）、lumican（LUM）、CD44、VCAN、胶原蛋白 VI 型α-3 链（COL6A3）、整合素亚基α-V（ITGAV）、半叶凝集素 3（LGALS3）、软骨寡聚基质蛋白（COMP）、肾病 1 型（NPHS1）、肾病 2 型（NPHS2）， 突触足（SYNPO）、类 podocalyxin（PODXL）进行了 LASSO 回归和 SVM-RFE 分析。通过交叉 LASSO 和 SVM 算法中筛选的枢纽基因，可以确定 DKD 患者肾小球和小管中共表达的枢纽基因。它们分别是 VCAN 和 FN1。ROC 分析显示，肾小球数据集中，VCAN 和 FN1 均表现出较高的诊断准确性，AUC 值均超过 0.7。在小管数据集中，VCAN 和 FN1 也表现出较高的诊断准确性，所有 AUC 值均超过 0.9。结果显示 DKD 患者有显著上调。在测试数据集 1（GSE99325，小管）和数据集 2（GSE30122，肾小球+小管）中。VCAN 在 DKD 患者中均显示显著上调。VCAN 与免疫细胞的关联。浸润肾小球和由 VCAN 介导的微管的免疫细胞主要包括肥大细胞、调节性 T 细胞和活化的 CD4 T 细胞，其中中性粒细胞是主要的抑制细胞。GSE195460 数据集的质量控制结果，样本间异质性低且无显著批次效应。肘部图显示，当主成分（PC）达到约 15–20 时，曲线达到一个平台（见图 4A）。在糖尿病肾病（DN）组内，合并数据可有效简化为 16 个簇（图 4B）和 13 种细胞类型（图 4C），分别是间充质细胞（MES）、肾小球顶叶上皮细胞（PEC）、近端卷曲管细胞（PCT）、亨利细胞环（LOH）、远端卷曲管细胞（DCT）、卷曲管细胞（CT）， 收集导管主细胞（CD-PC）、收集导管插入细胞 A 型（CD-ICA）、收集导管插入细胞 B 型（CD-ICB）、内皮细胞（ENDO）以及白细胞（LEUK）和上皮细胞。图 4D 显示了细胞标记与细胞簇之间的相关性。在 DN 组中，VCAN 表达在 PEC 和 PCT 细胞中显著富集（见图 4E 和 F）。而在对照组中，则不显著（见图 4G 和 H）。单细胞转录组数据中 versican（VCAN）表达水平。（A）注释前的肘部图。（B）主要聚类图。（C）带人工注释的簇图：间充质细胞（MES）、肾小球顶叶上皮细胞（PEC）、近端卷曲管细胞（PCT）、亨勒环细胞（LOH）、远端卷曲管细胞（DCT）、卷曲管细胞（CT）、聚集管主细胞（CD-PC）、收集管夹层细胞 A 型（CD-ICA）、收集管夹层细胞 B 型（CD-ICB）、内皮细胞（ENDO）、白细胞（LEUK）。（D）细胞标记与簇之间的相关性。（E）糖尿病肾病（DN）组肾细胞中 VCAN 的分布。（F）DN 组中 VCAN 的表达。（G）对照组肾细胞中 VCAN 的分布。（H） 对照组中 VCAN 的表达。（I）肾脏整合转录组学（K.I.T.）数据库中默认注释的簇图。（J）对照组中 VCAN 的分布。（K） DN 组中 VCAN 的分布。（L）VCAN 表达的小提琴情节。（M） VCAN 表达的点阵图。PODO，足细胞。K.I.T.数据库显示，细胞类型被注释为：MES、PEC、PCT、LOH、DCT、CT、CD-PC、CD-ICA、CD-ICB、子宫内膜异位症和 LEUK（见图 4I）。对照组在 CD-ICB 和 PEC 细胞中检测到 VCAN 表达（见图 4J）。在 DN 组中，VCAN 主要在 PEC 和 MES 细胞群体中表现出显著的表达水平升高（见图 4K-M）。PEC 和 PCT 细胞的伪时间分析。VCAN 的表达在中间 PEC 细胞中达到峰值，在未成熟 PEC 细胞中表达最低，表明与细胞分化相关的富集模式。PCT 细胞经历了两个关键分支点的轨迹。VCAN 在中间 PCT 细胞中表达最高，成熟 PCT 细胞中表达最低。免疫评分。ENDO 和 LEUK 是免疫反应中主要参与的细胞类型，而 PEC 和 PCT 则在免疫反应中有一定参与。大多数细胞参与了免疫上调反应，VCAN 主要介导免疫细胞的浸润，而非抑制。VCAN-DKD 和 DKD-VCAN 共计 60 个 SNP 和 98 个 SNP。平均 F 统计量分别为 19.14 和 18.71，表明磁共振分析中使用的静脉注射的稳健性。VCAN-DKD 的 MR 计算及其反向相关性。在 VCAN-DKD 关联分析中，基于 IVW 的结果显示比值比为 1.088（95%置信区间，0.151 至 1.017;P=0.014 <0.05），五种分析方法的β方向一致，表明 VCAN-DKD 可能存在因果关联。血清 VCAN 蛋白是 DKD 的风险因素。在 DKD-VCAN 分析中，五种计算方法的β方向不一致，表明它们之间没有反向因果关联。散点图、漏斗图和留一图见图5。敏感性分析。VCAN 与 DKD 呈正因相关（图 5A）。漏斗图显示 SNPS 双侧对称，显示无显著偏差（图 5B）。未剔除图显示所有 SNP 均位于等效线的一侧，表明磁共振分析无显著异质性（图 5C）。VCAN 与 DKD 之间没有反向因果关系（见图 5D-F）。散点图、漏斗图和 Versican（VCAN）的遗漏图。（A、B、C）VCAN 与糖尿病肾病（DKD）的因果关系。（D，E，F）DKD 到 VCAN 之间的因果关联。MR，孟德尔随机化;SNP，单核苷酸多态性;SEIV，仪器变量的标准误。观察到 DKD 患者血清 RNA 中 VCAN 表达水平显著上调，与 GFR 呈显著负相关（图 6A）。此外，VCAN 与尿蛋白水平呈正相关，而 FN1 则无显著相关（见图 6B）。中心基因的临床相关性。（A）糖尿病肾病（DKD）患者的血清 versican（VCAN）mRNA 水平。（B）DKD 患者的血清纤维内凝蛋白 1（FN1）mRNA 水平。DN，糖尿病肾病;肾小球滤过率（GFR）;MDRD，肾病饮食的调整。P%3C0.0001（未配对 t 检验）。 总结 总之，通过识别 DKD 肾小球和管状病变中观察到的共同特征，发现了许多不同基因，强调了在 ECM 形成和炎症途径中的作用。此外，还鉴定了 VCAN 诊断标志物，为临床诊断提供了补充选择。VCAN 在肾小球 PEC 和 PCT 细胞中表达显著较高。它主要参与免疫基因的上调以及肥大细胞等免疫细胞的浸润。MR 分析确认血清 VCAN 蛋白水平是 DKD 的风险因素，且无反向关联。该研究在估算 DKD 中 GFR 和蛋白尿方面具有良好诊断潜力，从而为 DKD 病理学提供了新见解，并可能成为 DKD 的诊断标志物。
|
