|
结果： DE-CRGs 的鉴定与官能富集分析 在GSE151648 数据集中，共获得 2390 个 DEGs（|log2 （FC） | >0.6 和 P < 0.05），其中 HIRI 组有 591 个基因被下调，1799 个基因被上调（见图。1A）通过将 2390 个 DEG 与 347 个 CRG 积分，最终获得了 19 个 DE-CRG（见图）。1B）为探讨这些 DEGs 在 HIRI 中的作用，作者进行了 GO/KEGG 富集通路分析。如图所示。1C，DEGs 主要富含炎症反应调控、对活性氧物种的反应、金属离子转运调控、细胞因子/趋化因子活性以及热休克蛋白结合。此外，KEGG 结果显示细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞凋亡、Th1 和 Th2 细胞分化、铁剥蚀以及 HIF-1 信号通路均被富集（见图）。1D)DE-CRGs 的鉴定及功能富集分析。（A） 与 HIRI 相关的 DEG 火山图。（b）HIRI 中 DEG 与 CRG 的交汇点。（C）通过生物过程、细胞组分和分子功能对 DEGs 进行去氧气浓集分析。（D）DEGs 的 KEGG 通路分析。CRGs，即与卵巢相关基因;DEGs，差异表达基因;DE-CRGs，即与卵巢切除症相关的差异表达基因;肝缺血再灌注损伤。通过机器学习识别重点 DE-CRGs如上所述，HIRI 共有 19 个 DE-CRG。为确定 HIRI 的特征标志，作者进行了 LASSO 分析，结果显示经过十倍交叉验证后，最佳λ值为 0.0435。GNL3（鸟嘌呤核苷酸结合蛋白类 3）、ALAS1（氨基苯二酸合酶 1）、TSC22D2（转化生长因子β刺激克隆 22 结构域家族成员）、KLF5（克吕佩尔样因子 5）、GTF2B（一般转录因子 IIB）、DNTTIP2（脱氧核苷酸转移酶末端相互作用蛋白 2）、SLFN11（施拉芬 11）和 HNRNPU（异质核糖核蛋白-U）的回归系数分别为 0.063、0.222、0.450、0.027、0.974、0.517， 分别为 0.486 和 2.232（图。阿拉伯数字A，B）。这些系数的 95%置信区间和 p 值。随后，作者分析了 8 个特征 DE-CRG 之间的相关性，以探讨铜管菌是否在 HIRI 的发育中发挥作用。结果显示，除 SLFN11 和 ALAS1 外，所有 8 个基因彼此高度相关。GNL3 与 DNTTIP2 之间的相关性最强（相关系数 0.84）（图）。阿拉伯数字8 个含 DE-CRGs 的热图和表达水平显示，它们在 HIRI 样本中的表达水平显著高于非 HIRI 样本（见图）。阿拉伯数字D-E）。为预测 HIRI，分析了 8 个基因的 ROC 曲线。值得注意的是，DNTTIP2 和 HNRNPU 在 8 个基因中曲线下面积（AUC）最高，值为 0.962。GNL3、ALAS1、TSC22D2、KLF5、GTF2B 和 SLFN11 的其他 AUC 值分别为 0.894、0.902、0.958、0.919、0.896 和 0.845（见图）。阿拉伯数字F）。作者开发了一种通型图以进一步评估 HIRI 模型的预测效果（见图）。阿拉伯数字G). 校准曲线和临床决策曲线也显示线图准确且具有优异的临床净益处（见图。阿拉伯数字H，I）。同样，风险评分的 ROC-AUC 为 0.970，表明模型辨别能力极佳（见图。阿拉伯数字总体而言，这些结果表明所有 8 个包含 DE-CRG 的诊断价值均为优异。 通过机器学习识别特色 DE-CRGs。（A，B）利用 LASSO 回归构建特色 DE-CRGs。（C） 显示交集的铜管链基因关系的弦图。（D，E）8 个 DE-CRG 在 HIRI 与非 HIRI 间的聚类热图及整体表达小提琴图。（F）HIRI 诊断中 8 个 DE-CRG 的 ROC 曲线。（G）基于 8 个基因预测 HIRI 风险的诺莫图模型。（H） 校准曲线的构建。（I）显示该计时图临床价值的决策曲线。（J）用于预测 HIRI 的命名图校准曲线。DE-CRGs，即与卵巢切除症相关的差异表达基因;肝缺血再灌注损伤（HIRI）;ROC，接收机工作特性。P< 0.0001， ***P< 0.001.8 个 DE-CRGs 的单基因富集分析进行了单基因 GSEA 检测，以探索 HIRI 中 8 个 DE-CRGs 的潜在机制（见图。3）。有趣的是，GNL3、ALAS1、TSC22D2、DNTTIP2、SLFN11 和 HNRNPU 与白介素信号传导相关，这些白细胞介素在 HIRI 中均上调。此外，GNL3、ALAS1 和 TSC22D2 上调的信号通路也与免疫系统中的细胞因子信号传导相关。然而，作者发现 TSC22D2、GTF2B 和 SLFN11 与细胞衰老呈负相关。ALAS1、TSC22D2、GTF2B 和 HNRNPU 分别与补体级联反应、程序性细胞死亡疾病、生物氧化以及促炎和促纤维介质的概览相关。因此，作者认为 DE-CRGs 与 HIRI 中的免疫反应、氧化应激和细胞死亡之间存在强烈关联。8 个 DE-CRG 的单基因 GSEA。GNL3、ALAS1、TSC22D2、KLF5、GTF2B、DNTTIP2、SLFN11 和 HNRNPU 在通路中的 GSEA。DE-CRGs，即与卵巢切除症相关的差异表达基因;GSEA，基因集富集分析。8 种 DE-CRG 的免疫浸润与细胞死亡分析GO/KEGG 分析显示，免疫反应、凋亡和铁剥离似乎在 HIRI 中发挥作用。此外，发现 8 种 DE-CRGs 与单基因 GSEA 中免疫通路及细胞死亡密切相关。为进一步确认 8 种 DE-CRGs 在 HIRI 中的作用，作者进行了免疫浸润和细胞死亡分析。CIBERSORT 算法计算了每个 HIRI 和正常样本中 22 个免疫细胞的相对含量。热图显示免疫浸润的归一化富集得分。此外，作者对 HIRI 组免疫细胞进行了相关分析，发现活化树突状细胞与活化 NK 细胞之间的相关性最强。鉴别分析结果显示，HIRI 组和非 HIRI 组的 5 个免疫细胞存在差异，分别是 Tregs、M0 巨噬细胞、M2 巨噬细胞、静息肥大细胞和活化肥大细胞（见图）。4A）其他细胞的富集分析见 1CM2 是抑制炎症的物质;但在 HIRI 集团中，其内容被下调了。因此，作者进一步分析了细胞因子，包括 IL1B、IL-6 和 TNF。如图所示。4B 组，HIRI 组的 IL1B、IL-6 和 TNF 水平高于非 HIRI 组。这些结果表明免疫反应在 HIRI 中起到了作用。随后，作者分析了免疫反应与 8 种 DE-CRGs 之间的相关性。作者发现 GNL3 与 CD8 T 细胞、静息 NK 细胞和活化肥大细胞呈负相关。 DNTTIP2 与 CD8 T 细胞、静息 NK 细胞、M2 巨噬细胞和活化肥大细胞呈负相关，KLF5 和 HNRNPU 分别与 M2 巨噬细胞和滤泡辅助 T 细胞呈负相关。然而，ALAS1 和 TSC22D2 分别与原始 B 细胞和活化记忆 CD4 T 细胞呈正相关。同样，8 个 DE-CRGs 似乎与 IL1B、IL-6 和 TNF 呈负相关，但无统计学显著性。8 种 DE-CRG 的免疫浸润与细胞死亡分析。（a）HIRI 组与非 HIRI 组免疫浸润的比较。（B）HIRI 组与非 HIRI 组细胞因子的比较。（C）8 种 DE-CRGs 与免疫细胞的相关分析。（D）HIRI 组与非 HIRI 组细胞死亡的比较。（E）8 种 DE-CRGs 与细胞死亡的相关分析。（F） 8 个 DE-CRGs 中显著的免疫浸润和细胞死亡分析。蓝线表示负相关，红线表示正相关。DE-CRGs，即与卵巢切除症相关的差异表达基因;肝缺血再灌注损伤。P< 0.0001， **P< 0.01， *P< 0.05.接着，作者比较了 HIRI 组与非 HIRI 组在细胞凋亡和铁剥蚀上的差异。作者选择了 MKI67 和 PCNA 作为细胞增殖的指示剂。Caspase 9、FAS、bax 和 bcl-2 被选为凋亡的指示物，ACSL4、PTGS2 和 FTH1 被选为铁凋亡的指示物。结果显示细胞增殖减少，HIRI 组发生了细胞凋亡和铁剥离（如图所示）。4D），此前研究显示了 28,29。此外，作者发现 DNTTIP2 和 HNRNPU 与 PCNA 呈负相关，表明 DE-CRGs 抑制细胞增殖。此外，GNL3、DNTTIP2 和 HNRNPU 与 ACSL4 呈正相关，表明铜管虫作用与铁坏死之间可能存在串扰（如图所示）。4E）。总的来说，作者导出了一个 CRGs-免疫细胞-细胞死亡相关网络，以展示图中上述发现。4 楼。HIRI 无监督聚类识别与分析为了确定 8 个 CR-DEGs 是否能区分 HIRI 中的样本，作者使用了分层聚类算法，识别出 23 个 HIRI 样本中表达了 8 个 CR-DEGs。最后，作者将 23 个 HIRI 样本分为两组，即 A 组（n=5）和 B 组（n=18）（见图）。5PCA 显示两组间有显著差异（见图。5B）。两组的差异分析显示，A 组 ALAS1、TSC22D2、KLF5、GTF2B、DNTTIP2 和 HNRNPU 的表达低于 B 组（图。5 此外，作者共识别出 2455 个 DEGs（|log2 （FC） | >0 和 P < 0.05），火山图如图所示。5D。作者进行了 GO/KEGG 富集分析，以探讨两组之间的特征。卵巢切除物结果显示，DEGs 与自噬调控、凋亡信号通路调控、对内质网应激的响应以及巨噬细胞趋化性正向调控相关（图。5E）。如图所示。5F，DEGs 主要富集于 Ras 信号通路、TNF 信号通路、凋亡（多物种）和铁凋亡。HIRI 无监督聚类识别与分析。（A） A 组和 B 组间 8 个 DE-CRG 的表达热图。（B） 两组主成分分析图。（C） 两组间 8 个 DE-CRG 的表达小提琴图。（D）两组 DEGs 的火山图。（E，F）对两组 DEGs 进行 GO/KEGG 分析。肝缺血再灌注损伤（HIRI）;DE-CRGs，即与卵巢切除症相关的差异表达基因;肝缺血再灌注损伤。**P< 0.01， *P< 0.05.8 个 DE-CRG 的初步验证最后，作者选择 GSE14951 验证 HIRI 中 8 种 DE-CRGs 的表达和诊断价值。与 GSE151648 试验基因组的结果类似，除 SLFN11 外，HIRI 组中有七个基因高于非 HIRI 组（图）。6A）。所有 8 个 DE-CRG 的对应 AUC 值均大于 0.86（见图）。6B).初步验证了 8 个 DE-CRG。（A）GSE14951 数据集中 8 个 DE-CRGs 的整体表达小提琴图，涵盖 HIRI 和非 HIRI。（b） GSE14951 数据集中 HIRI 诊断中 8 个 DE-CRGs 的 ROC 曲线。（C）GSE171539 数据集中的 tSNE 图谱。（D） GSE171539 数据集中 8 个 DE-CRG 的整体表达小提琴图，涵盖 HIRI 和非 HIRI。（E）小鼠及 sham 组和 HIRI 组中血液木精和伊松蛋白的一般图像。（F）sham 组和 HIRI 组的血清 ALT 和 AST 水平。（G）假组和 HIRI 组中 8 个基因的相对 mRNA 表达。DE-CRGs，即与卵巢切除症相关的差异表达基因;肝缺血再灌注损伤（HIRI）;ROC，接收机工作特性。（ 每组 N=5 个） ****P< 0.0001， ***P< 0.001， **P< 0.01， *P< 0.05.此外，GSE171539 的 snRNA 测序数据中的两个样本进行了质量控制并标准化，保留了 8841 个细胞进行分析。如图所示。6C，tSNE 图谱展示了九种细胞类型的注释，包括 NK/T 细胞、单核吞噬细胞、B 细胞、内皮细胞、浆细胞、甲状腺细胞、肝细胞、星状细胞和胆管细胞。根据所有簇的不同锚定基因，肝细胞被注释为 SAA1。作者首先评估了 8 个基因的分布，发现 GNL3 和 GTF2B 主要在浆细胞中表达。TSC22D2 和 DNTTIP2 主要在内皮细胞中表达。KLF5 主要表达于胆管细胞中。HNRNPU 在除肝细胞外的各种细胞中广泛表达。此外，作者对 HIRI 与非 HIRI 进行了差异分析，发现 GNL3、KLF5、DNTTIP2 和 HNRNPU 在 HIRI 样本中的表达高于非 HIRI 样本。然而，ALAS1 和 GTF2B 在 HIRI 中的表达低于非 HIRI。TSC22D2 和 SLFN11 无显著差异（见图。6 当然，数据集只包含 64 个肝细胞，这是肝脏中最大的细胞群体。因此，作者需要扩大样本量以支持上述结果。为了进一步验证作者的发现，作者建立了 HIRI 小鼠模型（见图）。6E-F）。与上述结果一致，HIRI 小鼠（排除 SLFN11）的 mRNA 水平显著上调（见图）。 6G），表明 GNL3、ALAS1、TSC22D2、KLF5、GTF2B、DNTTIP2、SLFN11 和 HNRNPU 可能参与 HIRI。为验证 HIRI 中铜死亡的发生及与凋亡的交互作用，作者再次添加铜促作用诱导剂和抑制剂以治疗 HIRI 小鼠。作者发现葡萄干草抑制剂改善肝损伤，但乳烟草诱导剂则显示相反效果（见图。7A-B）。此外，作者发现 HIRI 小鼠的铜含量增加，抑制剂和诱导剂的使用也影响了铜含量（见图。7C-D）。而铜管松作用抑制剂降低了 7 个基因的表达，但诱导剂则增加了表达（见图。7 最后，作者发现铜葡萄糖抑制剂可以减少细胞凋亡的发生，这证实了铜死亡与细胞凋亡之间的交叉作用（见图）。7 综合来看，这些发现支持 8 个 DE-CRGs 是 HIRI 的关键角色。HIRI 中铜死亡的发生以及与凋亡的交互作用。（A）小鼠与苏木精和伊红在使用诱导剂和抑制剂后拍摄的一般图像。（B）注射铜管促导剂和抑制剂后血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平。（C）肝脏中的铜含量。（D）肝脏中的铜红碱染色。（E）。8 个基因的相对 mRNA 表达。（F）肝脏的调音染色。肝缺血再灌注损伤。（ 每组 N=5 个） ***P< 0.001， **P< 0.01， *P< 0.05。转录因子-DE-CRGs 网络和 miRNA-DE-CRGs 网络的构建为了进一步探讨 miRNA/TFs 与 8 个 DE-CRGs 之间复杂的分子相互作用机制，作者创建了 miRNA-mRNA 和 TF-mRNA 网络关系图，如图所示。8A-B。TF-mRNA 复合物网络显示，17 个 TF 可能调控 DE-CRGs 的 mRNA。SLFN11 被排除，因为其预测仅在一个数据库中。POLR2A 和 CREB1 是发挥最多监管作用的 TF。作者还预测了能够与 8 个去离 CRG 相互作用的 miRNA。miRNA-DE-CRGs 相互作用网络共计 192 个 miRNA，HNRNPU 分别与 SLFN11 和 DNTTIP2 共享 2 个和 4 个 miRNA。而 GNL3 只有一个 miRNA 可以相互作用。这 8 个 DE-CRGs 具有多重 TF 和 miRNA 结合位点，这有助于指导作者对其机制的进一步研究。TF-DE-CRGs、miRNA-DE-CRGs 及药物相互作用网络。（A）TFs 对 8 个 DE-CRG 的预测。（B）8 种 DE-CRGs 的 miRNA 预测。（C） 预测 8 个 DE-CRG 上的药物-基因相互作用。DE-CRGs，即与卵巢切除症相关的差异表达基因;转录因子。药物-基因相互作用的预测共筛选了 10 种可能与 DE-CRGs 具有调控关系的药物，其中与 KLF5 相互作用的药物数量最多（见图。8C）。然而，作者最终获得了 3 种 DE-CRGs 的药物预测，包括 GNL3、KLF5 和 SLFN11。随着研究的发展，作者将获得更多药物预测。总结 综上，作者通过一系列生物信息学分析筛查了八个与 HIRI 和铜管菌相关特征基因（GNL3、ALAS1、TSC22D2、KLF5、GTF2B、DNTTIP2、SLFN11 和 HNRNPU）。此外，作者的研究还表明 DE-CRGs 与免疫浸润之间存在关联，以及 HIRI 患者亚组之间的异质性。基于八个 DE-CRG 的最佳机器学习模型能够准确预测 HIRI 发生风险并评估 HIRI 亚型。此外，作者构建了 miRNA/TFs 网络，并预测了基因靶向药物的效果。因此，本研究为 HIRI 的临床异质性和预后提供了新的见解，并为 HIRI 的病理生理过程及未来潜在治疗方案提供了理论基础。
|
