【原】7+分型+WGCNA+机器学习+分子对接+实验验证，有点厉害了啊，看完之后大脑都飞速运转！

导语

结果：

DEG 的识别与无监督聚类

MS 的高通量测序数据集 GSE 131282 被标准化并用于本研究。共获得 857 个 DEGs，包括 3 个上调基因和 854 个下调基因，这些均通过 Limma 软件包在 R 中进行差异基因分析从合并数据集中获取（见图）。1A).

DEGs 的识别与无监督聚类。DEGs 的火山图，显示 MS 和 HC 基因表达差异。红点表示上调基因，蓝点表示下调基因，灰点表示无显著差异的基因。B–E 表明，将 142 例多发性硬化症疾病组的无监督聚类分为两组效果最佳，即将其分为两个亚型，即集群 1 和簇 2

本研究采用无监督聚类分析方法，对疾病组患者的转录组数据进行了深入分析。具体来说，通过共识聚类算法（图）。1B–E），最佳分型效果是在将疾病组中的 142 例分为两个亚型时实现的。作者分别将这两个亚型命名为群集 1 和群集 2。

免疫浸润

为了探讨两种疾病组亚型之间的基因表达差异，作者绘制了火山图和热图（见图）。阿拉伯数字A 和 B）。结果显示，第 2 群 823 个 DEG 的表达高于第 1 群，且更接近正常组。为更深入理解这 184 例病例及该疾病组的两个亚型的生物学特征，作者分别对它们进行了免疫浸润分析。184 例病例的结果显示，B_cells_naive、T_cells_ CD4_naive、T_cells_gamma_deIta、NK_cells._resting、NK_cells_activated、Dendritic_cells_activated、Mast_cells_resting、Mast_cells__activated 和嗜酸性粒细胞的免疫浸润数量存在差异（见图 C）。然而，第 1 群的免疫浸润结果（见图 D）无显著差异。在第 2 簇中，Macrophages_M2 细胞免疫浸润数量存在差异（见图 E）。

免疫浸润分析。 这是一张火山图，显示了簇 1 和簇之间基因表达的差异。2. B 热力图，显示簇 1 和簇 2 中 DEGs 的前 10 和底 10 基因。C 显示 184 例多发性硬化症（** P < 0.01，*** P < 0.001）。D 第一群的免疫浸润结果显示无异。E 第二类免疫浸润结果显示，Macrophages_M2 细胞免疫浸润水平存在差异（* P < 0.05）

WGCNA 分析

本研究首先通过 WGCNA 方法对GSE131282 基因表达数据进行了深入分析。为确定合适的软阈值，作者计算了不同软阈值下的网络连接性和规模独立性。结果显示，当软阈值设为 1 时，网络连接性和规模独立性均满足要求。因此，该值被选为后续分析的软阈值（图 3A）。确定软阈值后，作者进行了基因聚类趋势分析。通过分层聚类方法，作者观察到基因表达数据中明显的聚类趋势，表明基因间存在显著的共表达关系。该结果进一步验证了 WGCNA 方法在分析基因共表达网络中的有效性（见图 3B）。为了直观展示基因间的共表达关系，作者绘制了一个相关热图。热图结果显示，基因间的相关系数表现出明显的分布特征，部分基因具有显著的相关性，形成了紧密的共表达模块（图 3 C）。其中蓝色模块的数值差异最大，分别为 0.5 和-0.5，共获得 4909 个基因。这一结果为作者后续研究提供了重要基础。

WGCNA 出版社。A软阈值的选择，显示不同软阈值下的网络连接性和规模独立性，最合适的软阈值为 1。B 基因聚类趋势图，即通过层级聚类法获得的基因表达数据的聚类趋势图。C 相关热图，显示基因间相关系数并形成紧密的共表达模块。D 模块-表型相关图，展示了每个模块与疾病表型之间的相关性。E 模块内相关性散点图，显示蓝色模块内基因相关性的散点图。F 网络热图，显示加权基因共表达网络中选定基因的共表达模式和关系

此外，作者计算了蓝色模组内的相关性，并绘制了模组相关性的散点图。散点图（图。3E）确认了蓝色模块成员与 MS 基因显著性之间的显著相关性（cor = 0.65，P < 1e−200），验证了该模块与疾病发病机制的相关性。为了探讨共表达模块与疾病表型之间的关系（见图 3D），作者计算了每个模块与表型之间的相关性，并绘制了模块-表型相关图。结果显示特定模块与 MS 表型之间存在显著相关性，其中红色和黄色模块关联最为强烈。

最后，为了更直观地展示加权基因共表达网络中所选基因的共表达模式和关系，作者绘制了一个网络热图。在网络热图中，作者随机选取了 400 个代表性基因进行展示。网络热力图（图 3F）可视化蓝色模块内的共表达模式，深色代表更高的拓扑交集度量（TOM）。左上象限的基因对表现出强烈的共表达，尽管未对特定基因名和 TOM 值进行注释。

GO 分析与 GSEA

作者结合了 MS 疾病基因、DEGs 基因、WGCNA 蓝色模块中的基因以及预测的 PCB2 基因的交叉基因，获得了 25 个交叉基因（见图）。4A）。接着，作者对这 25 个基因进行了分解分析（图 4B）。结果显示，这 25 个基因在 GO BP 中显著丰富了大多数生物过程都与氧化应激相关，如“对氧化应激的反应”、“细胞对氧化应激的反应”、“对活性氧物种的反应”、“细胞对活性氧物种的反应”等。为了进一步探讨上述与氧化应激相关通路中 DEGs 的功能，作者构建了多条基因通路图谱。结果显示，MS 组这些基因的表达确实低于 HC 组（图 4D）。为了更直观地展示 GO BP 中显著富集的生物过程之间的关系，作者构建了 BP_cnetplot 网络图和 BP_emapplot 富集图，展示了不同生物过程之间的相互作用与连接，并揭示了它们之间潜在的调控关系（图 4 C 和 4E）。

GO 分析和 GSEA。交叉基因的维恩图，显示多发性硬化症疾病基因、DEGs 基因、WGCNA 蓝色模块基因及 PCB2 预测目标基因的交叉情况。BGO BP 富集分析，展示了 GO 生物过程（BP）中交叉基因的富集状况，主要与氧化应激相关。C BP_cnetplot 网络图，展示了 GO BP 中显著富集的生物过程之间的相互作用与连接。D GSEA，展示了 GSE131282 数据集中与氧化应激相关通路的富集状况。E BP_emapplot 富集图，展示了 GO BP 中显著富集生物过程之间的富集图关系

八种机器学习算法

为了识别 PCB2 预测靶点中对临床表现影响最大的基因，作者采用了八种先进的机器学习算法。作者以预测的 49 个 PCB2 靶基因为核心基因，筛除了 GSE131282 数据集中的相关基因。

为评估模型的预测表现，作者计算了残差的反向累积分布。作者随机抽取了 70%的数据作为训练集，剩余 30%分配给测试集进行测试。结果表明，所有算法在预测 PCB2 目标基因时都表现出良好的预测能力。残差曲线的逆向累积分布是平滑的，随着残差值的增加，累计分布比例逐渐下降，表明预测结果具有显著的准确性（见图）。5A）。ROC 曲线（图 5B）进一步证明，八个算法的 AUC 均大于 0.8，GBM 达到最高（0.927），GLM 最低（0.805），展示了模型间的一致预测能力，同时凸显了性能差异。AUC 指标通过反映不同分类阈值的排名准确性，进一步验证了基于机器学习的目标基因筛查的可靠性。

机器学习算法筛选关键基因。残差曲线的逆向累积分布，展示了不同机器学习算法在预测 PCB2 目标基因时残差的逆向累积分布。B ROC 曲线，展示了不同机器学习算法的预测性能。C 特征重要性排序，显示不同基因对模型预测贡献的排序。D 预测残差箱型图，展示了不同算法预测的残差分布。E 维恩图交叉基因，展示了 8 种机器学习算法和 25 个交叉基因筛选出 33 个重要基因的交叉情况。F 关键基因排名，显示根据特征重要性出现频率排序后选出的前 8 个关键基因

在模型训练过程中，作者还计算了特征重要性，以评估不同基因对模型预测的贡献。结果显示，这些基因与 PCB2 预测靶点高度相关，且在特征重要性列表中排名靠前，进一步验证了筛选结果的可靠性（见图）。5C）。作者列出了每个算法中重要性最高的十个基因，然后将它们汇总，得到了 33 个重要基因。

为了更直观地展示预测残差的分布，作者绘制了箱线图。结果显示，不同算法预测的残差分布范围相对集中，中位数接近零，表明预测结果具有显著的稳定性和一致性。LASSO 和 GLM 算法表现更好（见图。5D).

随后，作者对 8 个机器学习算法筛选的 33 个重要基因和图中 25 个交叉基因进行了交叉。4，获得了21 个交集基因（图 5E）。然后，作者根据八个机器学习算法特征重要性的出现频率对它们进行了排名，并选出了前 8 个基因（见图 5 F）。

命名图和诊断模型的构建与效果评估

作者获得的八个交叉基因既可作为 PCB2 的靶点，也可作为多发性硬化症的诊断生物标志物基因。为了全面理解这些生物标志物基因的诊断效果和重要性，作者构建了一个命名图（见图）。6A）并利用 ROC 曲线评估其诊断价值，旨在评估这些基因在多发性硬化症诊断中的特异性和敏感性。测试结果显示 AUC 为 0.888，高于标准 0.7，证明它们具备较高的预测和辨别能力。

《组图与诊断模型的构建与效应评估》。 一项命名图，展示了八个交叉基因在 MS 诊断中的综合预测效应。B 型交叉基因曲线，显示单个基因和组合基因在 MS 诊断中的 ROC 曲线。四个关键基因（KCNH2、PTGS1、ESR1 和 VEGFA）的 AUC 值均大于 0.7。C 校准曲线，显示训练组和验证组的命名图校准曲线。D PPI 网络图，展示了八个交叉基因的 PPI 网络图。E 基因相关热力图，展示了八个交叉基因之间的相关性。F Violin 基因表达图，显示了 GSE131282 数据集中 MS 组和 HC 组四个关键基因的表达

随后，作者对每个基因进行了单独的 ROC 分析，并评估了命名图的效果。其中四个关键基因，分别是 KCNH2（AUC = 0.742）、PTGS1（AUC = 0.802）、ESR1（AUC = 0.823）和 VEGFA（AUC = 0.857），均展现出可靠的预测能力（见图）。6 图 6C 显示训练组和验证组的校准曲线与标准曲线高度一致，表明该组在预测 MS 方面具有很高的准确性。图 6D 展示了八个基因的 PPI 网络构建过程，结果显示 PTGS1 和 ESR1 密切相关。图 6E 显示 PTGS1 与 ESR1 的相关性为 0.71。图 6F 显示了 AUC 大于 0.7 的四个关键基因的图，MS 组的基因表达均低于 HC 组（均为 P < 0.0001）。

基因-转变体-微型 RNA 调控网络的构建

作者初步通过预测相关转录因子（TFs）和 miRNA 来探索这四个关键基因的上游调控机制。使用 Cytoscape 中的 iRegulon 插件，作者预测了 46 个 TF。通过 miRWalk 3.0 数据库筛选和验证，共获得 172 个 miRNA（见图）。7A）。通过整合上述预测结果，作者构建了一个候选基因-TFs-miRNA 调控网络（Hub MitoDEGs-TFs-miRNAs 调控网络），包含 222 个节点和 271 个边缘。网络分析显示（图 7B）四个关键基因的度数值（Degree）分别为 122（ESR1）、79（VEGFA）、57（PTGS1）和 13（KCNH2）。当作者对四个关键基因的 miRNA 交叉时，发现没有 miRNA 能同时调控这四个关键基因（图 7C）。当作者对四个关键基因的 TFs 交叉点进行交叉时，发现 SRF 能够同时调控这四个关键基因的 miRNA（见图 7D）。该网络的构建为候选基因上游调控机制的进一步研究奠定了重要基础，同时也为揭示 PCB2 在治疗多发性硬化症中的潜在机制提出了新的方向。

基因-转变体-微小 RNA 调控网络。调控网络构建，展示了四大关键基因的 TFs 和 miRNA 调控网络。B 显示四个关键基因的度数值，显示四个关键基因的度数值。C miRNA 的交集情况，展示了调控四个关键基因的 miRNA 的交汇情况。D TFs 的交集情况，展示了调控四个关键基因的 TF 的交汇情况

分子对接与单基因大东南派

分子对接旨在探索小分子药物成分 PCB2 与蛋白受体 KCNH2、PTGS1、ESR1 和 VEGFA 之间的相互作用模式及结合亲和力（见图。8A）。结合结果显示 PCB2 与每个受体的结合能力不同。以结合能（Kj/mol）为测量指标，具体数据如下：KCNH2 为− 22.09152 kJ/mol，VEGFA 为− 23.51408 kJ/mol，PTGS1 为− 15.4808 kJ/mol，ESR1 为− 14.05824 kJ/mol。所有这些数值均小于− 5 kJ/mol，表明它们之间具有较强的结合亲和力，能够自发平滑结合[14]。

分子对接与单基因大东南原子酶。A分子结合结果，展示了 PCB2 与 KCNH2、PTGS1、ESR1 和 VEGFA 的分子结合结果。B 单基因 GSEA，展示了 GSE131282 数据集中氧化应激相关通路中四个关键基因的富集情况

随后，对四个关键基因——KCNH2、PTGS1、ESR1 和 VEGFA——进行了单基因 GSEA 检测（见图）。8 结果显示，在 GO BP（生物过程）中，“对氧化应激的反应”通路存在富集现象，该通路的富集结果显示出显著差异。这一结果与图 4 中的结果一致，进一步验证了先前研究的科学性和合理性。

PCB2 提升了 CPZ 小鼠的行为表现

在建立 CPZ 小鼠模型和用药过程中，作者密切监测了每组小鼠的体重（见图）。9C）从建模后的第二周开始，CPZ + NS 组和 CPZ + PCB2 组的体重均显著下降。然后，从第三周开始，这些剂量开始缓慢增加。值得注意的是，在第 11 周停止 CPZ 喂养并开始用药后，与 CPZ + NS 组相比，CPZ + PCB2 组在治疗最后两周体重显著增加（P < 0.05）。

PCB2 能提升 CPZ 小鼠的行为表现。 答 ：PCB2 对各组小鼠在建模和处理过程中体重变化的影响，以及 12 周结束时体重的影响（±标准差，n = 10）。* P < 0.05，*** P < 0.001，正常+PCB2 组与正常组的比较，其他组与 CPZ + NS 组的比较（与 Tukey 事后检验的双向方差分析）。B PCB2 对 CPZ 小鼠行为表现（OFT、EPM、T-Maze 和 CPT）的影响（±SD，n = 10）。* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001， 正常+PCB2 组与正常组的比较，其他组与 CPZ + NS 组的比较（与 Tukey 事后检验的双向方差分析）。C 建模与用药过程示范，演示 CPZ 小鼠模型和用药过程的建立

行为评估：鉴于 CPZ 小鼠模型中可能存在认知和行为障碍，包括记忆障碍和焦虑，作者评估了 PCB2 对这些参数的影响（见图）。9B）。在 OFT 中，CPZ + NS 组中心区域的总运动和活动增加（P < 0.0001，P < 0.01），表明多动和焦虑。 相比之下，CPZ + PCB2 组的指标下降（P < 0.0001，P < 0.001），表明 PCB2 对 CPZ 引起的行为变化具有缓解作用。

EPM 用于评估与焦虑相关的行为。结果显示，CPZ + NS 组在闭臂时间较少，进入张臂的频率更高（两者均为P < 0.0001），这是一种与焦虑增加相关的行为。然而，CPZ+PCB2 组在闭臂时间较长，进入张臂的频率较低（ 分别为 P < 0.0001 和 P < 0.05），表明 PCB2 具有潜在的抗焦虑作用。

在 T-Maze 测试中，该测试评估空间学习和记忆，CPZ+NS 组小鼠进入诱饵组的次数显著减少，活动距离显著减少（ 分别为 P < 0.01 和 P < 0.0001）。相比之下，CPZ + PCB2 组的这些参数有所增加（分别为 P < 0.001 和 P < 0.01），表明 PCB2 可能在脱髓鞘作用下增强空间学习和记忆。

在测量运动协调和谨慎的 CPT 中，CPZ + NS 组下降时间更快且误差较多（均为P < 0.001），表明运动功能受损。相反，CPZ+PCB2 小鼠的性能有所提升，下降时间延长，误差更少（均为 P < 0.05），表明 PCB2 具有神经保护潜力。

PCB2 促进 CPZ 小鼠髓鞘修复

为探讨 PCB2 对 CPZ 小鼠髓鞘再生的促进作用，作者进行了髓鞘的病理和免疫荧光染色。Luxol Fast Blue（LFB）和 TrueGold 染色（见图）。10A）CPZ + NS 组胼胝体（CC）区域髓鞘染色显著减少（P < 0.01，P < 0.0001）。 值得注意的是，CPZ+PCB2 组的髓鞘染色显著增加（P < 0.05，P < 0.001 ）。CC 区的免疫荧光染色显示（图 10B）CPZ+NS 组 MBP 表达显著降低（P < 0.001），而 CPZ + PCB2 组 MBP 表达显著增加（P < 0.05）。与此同时，APC 和 NG2 的染色结果显示，CPZ + NS 组的荧光强度显著增加（均为 P < 0.05），且 CPZ + PCB2 组的免疫荧光强度也显著高于 CPZ + NS 组（P < 0.05，P < 0.01），表明 PCB2 具有促进髓鞘修复和再生的效果。图10.

PCB2 对 CPZ 小鼠 CC 区髓鞘修复的影响。 答 ：PCB2 对 LFB（比例杆=2.5 毫米，±标准差，n=3）和真金（比例尺=2.5 毫米，±标准差，n=3）组织学染色的影响。* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，正常+PCB2 组与正常组比较，其他组与 CPZ + NS 组的比较（与 Tukey 事后测试的方差双向分析）。B PCB2 对 MBP（绿色，放大倍数 5×，比例条=500 微米，标差±标差，n=3）、APC（红色，放大倍率 10×，比例条=200 微米，±标差，n=3）和 NG2（绿色，放大倍率 10×，比例条=200 微米，±标差，n=3）中 CPZ 小鼠的影响。* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， 正常+PCB2 组与正常组的比较，其他组与 CPZ + NS 组的比较（与 Tukey 事后检验的双向方差分析）

PCB2 对 CPZ 小鼠炎症反应和氧化应激的影响

为检测 PCB2 对 CPZ 小鼠炎症反应和氧化应激的影响，作者使用微酶联结免疫吸附测定法和 ELISA 检测脑均质体内的 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、CAT、SOD 和 GSH-Px。结果显示（图。11A， 11B）中，CPZ + NS 组 TNF-α、IL-1β和 IL-6 的分泌水平显著升高（均为 P < 0.0001）。用药后，PCB2 治疗下调了 TNF-α、IL-1β和 IL-6 的分泌水平（P < 0.001，P < 0.01，P < 0.001）。 CPZ + NS 组 IL-10 分泌水平及 CAT、SOD 和 GSH-PX 活性显著降低（P < 0.01、P < 0.01、P < 0.001 和 P < 0.0001）。与 CPZ+NS 组相比，用药后 PCB2 治疗提高了 IL-10 分泌水平及 CAT、SOD 和 GSH-PX 活性（P < 0.01，P < 0.05，P < 0.5，P < 0.01）。

PCB2 对 CPZ 小鼠中四个关键基因的炎症反应、氧化应激以及 mRNA 和蛋白质表达水平的影响。A、B ELISA 和酶检测显示 PCB2 对 CPZ 小鼠全脑炎症和氧化应激反应的影响（±标准差，n = 3）。* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001，与 CPZ + NS 组（与 Tukey 事后检验的方差双向分析）。C 西方印迹检测结果显示 PCB2 对 CPZ 小鼠脑同质体内 NF-κB p65、P-NF-κB p65、xCT 和 GPX4 蛋白表达水平的影响（±SD， n = 3）。* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， 正常+PCB2 组与正常组比较，其他组与 CPZ + NS 组比较（与 Tukey 事后检验的双向方差分析）。D RT-PCR 检测结果显示 PCB2 对 CPZ 小鼠脑均原型中 KCNH2、PTGS1、ESR1 和 VEGFA 的 mRNA 表达水平有影响（±SD，n = 3）。** P < 0.01，*** P < 0.001，**** P < 0.0001，正常+PCB2 组与正常组的比较，其他组与 CPZ + NS 组的比较（与 Tukey 事后检验的方差双向分析）。Ewestern 印迹检测结果显示 PCB2 对 CPZ 小鼠脑均质体内 EGR、PTGS1、ERα和 VEGFA 蛋白表达水平的影响（±SD， n = 3）。* P < 0.05， ** P < 0.01， *** P < 0.001， **** P < 0.0001， 正常+PCB2 组与正常组比较，其他组与 CPZ + NS 组比较（与 Tukey 事后检验的双向方差分析）

同时，作者还使用 Western blot 检测小鼠脑均质蛋白中 NF-κB p65、P-NF-κB p65、xCT 和 GPX4 的蛋白表达水平（图。11 结果显示，CPZ + NS 组中 P-NF-κB p65 的蛋白表达水平显著增加（P < 0.001），而 CPZ + PCB2 组中 P-NF-κB p65 的蛋白表达水平显著下降（P < 0.5）。CPZ + NS 组 xCT 和 GPX4 蛋白表达水平显著下降（P < 0.01，P < 0.001）， 而 CPZ + PCB2 组 xCT 和 GPX4 蛋白表达水平显著升高（P < 0.5，P < 0.01）。

为验证 PCB2 对四个关键基因（KCNH2、PTGS1、ESR1 和 VEGFA）及其对应蛋白（EGR、PTGS1、ERα和 VEGFA）表达的影响，作者分别使用 RT-PCR 和 Western Blot 进行验证。结果显示，与正常组相比，四个关键基因的表达水平（见图）。11D）及其对应蛋白质（见图 11E）在 CPZ+NS 组小鼠脑中下降（P < 0.01，P < 0.001，P < 0.0001，P < 0.001 ; P < 0.01，P < 0.05，P < 0.001，P %3C 0.01）。与 CPZ + NS 组相比，CPZ+PCB2 组小鼠大脑中四个关键基因及其对应蛋白的表达水平有所上升（P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01，P < 0.001; P < 0.0001、P < 0.05、P < 0.05 和 P < 0.01），表明 PCB2 能调控这四个关键基因的基因表达和蛋白质分泌水平，其对 CPZ 小鼠的治疗效果可能与此有关。

总结

 总的来说，本研究创新地整合了药物靶点数据库、疾病相关公共数据库和 GEO 资源，并结合了网络药理学和生物信息学技术。研究探讨了 PCB2 如何调节与氧化应激相关的关键基因靶点，揭示了它们作为诊断和治疗标志的双重作用。该框架解释了从药物发现到疾病诊断和治疗的转化研究范式，为其他药物-疾病配对提供了多功能的模板。研究结果为个性化多发性硬化症治疗提供了理论基础，并突出了潜在的治疗靶点。未来的研究将对这些关键基因进行临床验证，并探索 PCB2 的机制