 3.1. 细胞衰老及恶性病变及恶性病变的各种体外模型中 ANT 转录本水平的变化鉴于在体外从生长阶段过渡到细胞衰老期间，TGF-β信号通路的成分积极抑制 ANT2 表达[11， 17， 19， 47]，作者旨在验证这种 ANT2 转录本水平下降是否为体外衰老的普遍现象，以及是否在体内衰老的不同条件下也会发生 .为此，作者分析了各种类型衰老细胞的公开表达谱数据集，以比较体外细胞衰老建立过程中 ANT1、ANT2、ANT3 和 ANT4 转录本的变化（见图 1A）、各种癌前病变和恶性病变（见 S1A ）以及多种人脑肿瘤（见图 1B）。这些分析表明，ANT1（SLC25A4）、ANT2（SLC25A5）和 ANT3（SLC25A6）异构体的表达水平在不同条件下会发生变化，但从数据中无法发现与体外发现一致的模式。注意，ANT4 mRNA 水平通常较低，且在衰老形成过程中未受影响。公开表达分析数据集中 ANT 转录本的变化。对照细胞和衰老细胞（A）以及正常脑和脑肿瘤（B）中 ANT 转录本的变化，其统计显著水平（P 值）由单个点的面积表示，并以折叠变化（FC）值颜色编码。显著变化（P 值< 0.05）用黑圈标出。（A，B）统计学采用了经验贝叶斯调节的 t 统计量。沉睡数据集包含 2 个（E-MEXP-2683，E-MEXP-2283，E-GEOD-11954，E-GEOD-19864），3 个（E-GEOD-77239，E-GEOD-13712，GSE100014），4 个（E-GEOD-16058）和 5 个（GSE35957 个实验复制）。脑肿瘤数据集包含 8 个（GSE13276）、127 个（GSE4290）和 169 个（E-GEOD-50161）样本。借助胶质母细胞瘤患者的单细胞测序数据[35]，作者分析了肿瘤亚群中单个 ANT 异构体的表达。如图 S1B，C 所示，肿瘤内 ANT 同构体转录本的表达高度异质。一定比例的肿瘤来源细胞表达了三种 ANT 异构体（分裂 B 细胞、OPC、分裂 OPC、未成熟星形胶质细胞、成熟 IPC/新生神经元;22.9%细胞）。值得注意的是，存在特定亚群主要表达单一异构体（神经元，分裂神经元，CGE iN;ANT1 2.4%;ANT2 6.5%;ANT3 16.5%）。此外，作者还调查了 ANT2 表达是否与增殖标志物 KI67（MKI67）交集。尽管部分 亚群表达了两种转录本（12.4%细胞），但部分 ANT2 阳性细胞为 KI67 阴性（见图 S1D），表明 ANT2 表达可能不总是与细胞增殖状态相关。3.2. ANT 异构体转录本与蛋白质水平在胶质母细胞瘤与肺癌中的相关性之前的发现让作者质疑 ANT 转录本与蛋白质水平是否相关。为澄清这一点，作者利用了一份此前发表的 99 名胶质母细胞瘤患者的组学分析数据集，包含转录组和蛋白质组数据[38]。作者鉴定出 10,965 种蛋白及其 mRNA 水平（图 2A ）。首先，作者对已识别蛋白与其 mRNA 水平进行了一般相关分析。Spearman 中位相关数为 0.47（见图 2B，mRNA/蛋白质相关模式示例见图 S2A）。线粒体蛋白（来自 MitoCarta3.0 数据库[41]）在转录本与蛋白质水平之间的斯皮尔曼相关性显著低于所有蛋白质（P = 2.88e-56，图 2B ）。线粒体蛋白的中位相关系数为 0.33。ANT 属于线粒体蛋白，与其他线粒体蛋白一样，它们在胶质母细胞瘤中转录本与蛋白质水平之间的相关性较差（Spearman 相关系数：ANT1 0.5;ANT2 0.04;ANT3 0.01;注意，蛋白质水平未检测到 ANT4;图 2C 和图 S2B）。令人惊讶的是，这三种 ANT 蛋白（但 mRNA 水平不在）在所有 99 个样本中都存在强烈的相互相关性，表明它们在蛋白质水平维持上具有同步性（图 2D 和图 S2C）。这些数据表明，ANT 蛋白的水平随线粒体质量而异。事实上，ANT 蛋白与线粒体蛋白的相关性相比所有蛋白质的相关性更强（见图 2E）。与 ANTs 关联最密切的蛋白是 SLC 组的其他成员（SLC25A3、SLC30A9）以及外层线粒体膜的外接受体 TOMM70。 此外，与 ANT1–3 最强相关性的列表略有差异。然而，这三种 ANT 蛋白也与大多数其他线粒体内膜和外膜蛋白（TIMM50、TIMM29、TIMM22、TIMM21、TOMM22 等）、线粒体编码的氧化磷酸化复合体亚基（MT‐ND1、MT‐ND2、MT‐ND4、MT‐ND5、MT‐ND6、MT-CYB、MT-CO1、MT-CO2、MT-CO3、MT-ATP6 和 MT-ATP8）以及调控线粒体动力学的蛋白（如 GDAP1， OPA1、IMMT、SNPH、MFN2、DNM1L 和 MFN1;图 S2D ）。 胶质母细胞瘤中的蛋白质和 mRNA 相关性。（A）记录在转录组和蛋白质组中的基因的维恩图。（B）所有基因和线粒体蛋白的 mRNA-蛋白相关分布。统计学中使用了曼-惠特尼-威尔考克森检验。（C） ANT 的散点图，转录本水平（mRNA）位于横轴，蛋白质强度在纵轴。（D） ANT 转录本水平和 ANT 蛋白强度的三维散点图。（E） ANT 蛋白与所有蛋白质及线粒体蛋白相关分布比较。接着，作者利用此前发表的 108 名鳞状细胞肺癌患者的组学分析数据集，探讨了该现象是一般现象还是胶质母细胞瘤的特异性[39]。总体而言，ANT 的相关性与胶质母细胞瘤相似。ANT 亚型的转录本与蛋白质水平之间无密切相关性（Spearman 相关系数：ANT1 0.17;ANT2 0.25;ANT3 0.26;注意，蛋白质水平未检测到 ANT4;图 S2E，F ），三种 ANT 蛋白在所有 108 个样本中高度相关（图 S2G，H ），ANT 蛋白与线粒体质量相关（图 S2I，J ）。此外，作者询问了 ANT 转录本和蛋白质水平是否与胶质母细胞瘤患者的临床病理状态相关（见图 S2K ）。ANT2 和 ANT3 转录本水平与诊断至死亡时间呈轻微正相关。这三种 ANT 均与肿瘤蛋白水平呈弱正相关，表明能量代谢对肿瘤生长起支持作用。请注意，数据集中的肿瘤大小类别采用了美国联合癌症委员会（AJCC）癌症分期系统。T4 类（肿瘤大于 7 厘米）的胶质母细胞瘤的抗反作用蛋白强度显著高于其他类别（见图 S2L ）。对于肺癌，T4 类别的统计检测数据点不足（仅有 2 例），但趋势显示依赖性与胶质母细胞瘤相似（见图 S2M ）。总之，这些数据表明，胶质母细胞瘤和肺癌中 ANT 异构体的转录本与蛋白质水平之间没有密切相关性。 在这两个数据集中，三种 ANT 蛋白都与线粒体质量高度相关且相关，例如调控线粒体动态的蛋白质和线粒体输入机制。3.3. 质谱法测定 ANT 相对蛋白水平的开发揭示了在辐射诱导衰老过程中 ANT1 和 ANT2 异构体之间的转换基于 ANT 转录本与蛋白质水平之间的无相关性，以及缺乏针对三种 ANT1–3 亚型特异性抗体的现象，作者旨在开发一种快速且可靠的方法，以确定细胞蛋白裂解物中单个 ANT 蛋白异构体的相对水平。为此，作者采用了基于微孔液相色谱并并行反应监测（μLC-PRM）的质谱方法。由于 ANT4 的组织表达受限，仅选中了 ANT1、ANT2 和 ANT3 作为 LC–MS/MS 分析 μ 鉴定对象。简而言之，作者选择了三种 ANT1 独有的肽和两种 ANT2 或 ANT3 独有的肽，用于特异性检测 ANT 蛋白（图 S3A ）。作者进行了基础分析，以合理选择肽，以排除分析上不合适的肽（见图 S3B –H）。作者优化了 μRPE-1 细胞的 LC–MS/MS 分析，证明即使在 6 μg 中识别出的 1700 多种蛋白背景中，也能根据这些独特肽区分 ANT1、ANT2 和 ANT3（见图 S3I –K）。最后，ANT 重标记肽的浓度被定义为对 μLC-PRM 方法的优化（见图 S3L –Q）。为了验证 LC-PRM 的可用性μ，作者利用已建立的人类端粒酶永生化 RPE-1 细胞中电离辐射诱发衰老（IRIS）模型，跟踪 ANT 同工型蛋白水平的动态变化。为此，RPE-1 细胞暴露于 20 Gy 以诱导 IRIS，如前所述[25， 48]。IR 后，在第 2、4、8、16 和 32 天采集了对照和照射后的 RPE-1 细胞，分别通过 RT-PCR 和 μLC-PRM 测定了 ANT 转录本和蛋白质水平。衰老型表型的发展通过第 14 天 EdU 合成试验中测定的衰老相关β-半乳糖苷酶（SA‐β-gal）活性升高及细胞增殖缺失得到证实（见图 S3R，S ）。如图 3A 所示，根据先前对 ANT2 mRNA 对静眠和氧化应激诱发衰老的检测，在 IRIS 发育过程中 ANT2 mRNA 水平显著下降[11， 17]。相比之下，ANT1 mRNA 仅在 IR 后 32 天的最后观察时间发生显著变化。ANT3 mRNA 水平并未显示明确趋势，作者观察到显著升高（D4）但同时下降（D8 和 D32），相较于增殖对照组。μ 对 ANT 同构肽的 LC-PRM 分析（见图 3B 和图 S3T）显示，ANT2 信号在 IRIS 发育过程中持续下降，IR 发生后 32 天出现最大下降。相反，与 RPE-1 细胞增殖相比，IR 后第 8 天 ANT1 蛋白水平显著上调。在 IRIS 发育过程中，ANT3 蛋白水平在 32 天内未见显著变化，且与 ANT3 转录本水平相符。在 IRIS 发育过程中，ANT 转录本与蛋白质水平的相关性显示，mRNA 与 ANT1 和 ANT3 的蛋白质水平高度不一致。相比之下，ANT2 在 IRIS 形成的第 16 天和第 32 天，mRNA 和蛋白质水平均显著下调。因此，与作者对患者数据的分析一致，蛋白质水平的变化与转录本水平的变化无相关性（图。3C）。总之，LC-PRM 被证明μ 监测 ANT 蛋白异构体变化的合适方法。在 IRIS 的帮助下，作者发现 IRIS 伴随着 ANT2 下降，但 ANT1 蛋白水平上升，而 ANT1 的 mRNA 水平并未随之上升。3.4. 辐射诱导的衰老性 RPE-1 细胞表现出高代谢表型作者还进一步探讨了在 IRIS 期间 ANT 异构体蛋白水平的变化是否会反映在能量代谢的变化中。因此，作者让细胞暴露在一次 20 Gy 剂量的 IR 下，让 IRIS 发育 14 天。作者通过 μLC-PRM 验证了 ANT1 蛋白升高、ANT2 蛋白下降及 ANT3 略有变化（见图 4A）。在本例中，作者还利用市售的 ANT1 和 ANT2 抗体进行免疫印迹法测定了 ANT1 和 ANT2 的蛋白质水平，结果与 μLC-PRM 结果相同（见图 4B;ANT1 和 ANT2 抗体的特异性通过 RNA 干扰验证，见图 S4A–C）。与之前的 IRIS 实验一样，作者在测量 ANT 异构体转录本水平时也得到了相同的结果（图 4C ）。IRIS 表型的发育通过测定 SA‐β加仑活性升高得到证实（见图 S4D ）。IRIS RPE-1 细胞的代谢参数。在γ照射后 14 天（D14）μ 增殖对照组中，通过 LC-PRM 检测到的 ANT1、ANT2 和 ANT3（A）蛋白水平，（B）通过免疫印迹检测到的蛋白水平（以α-微管蛋白为负荷对照），以及通过 qPCR 检测到的转录本水平趋常化为β-肌动蛋白，以及增殖对照组的检测结果。通过三次实验重复计算，显示处理与增殖 RPE-1 之间的平均折叠变化。标准误以误差条表示。在相同的实验条件下，使用海马分析仪分析 IRIS RPE-1 细胞（20 Gy;D14;完成了三次生物复制）。（D） 显示了氧气消耗率（OCR）及其衍生特征（E），以及细胞外酸化速率（ECAR）（F）及其特征（G）。（H） OCR/ECAR 比值表示依赖糖酵解或氧化磷酸化。（D–H）显示了至少三次实验重复中标准误获得的平均值。（E、G、H）统计学中使用了曼-惠特尼-威尔考克森检验。同时，利用 Seahorse 实时代谢分析仪，在增殖细胞及其衰老细胞中，检测了细胞代谢表型的变化，表现为氧气消耗率（OCR）和细胞外酸化速率（ECAR）。OCR 测量（见图）。4D，E）结果显示 IRIS 细胞的基线呼吸和最大呼吸显著增加。有趣的是，衰老细胞表现出质子泄漏增加，这可能表明线粒体受损。ECAR 测量（图 4F，G）显示衰老诱导后基础糖酵解和糖解能力增加。总体而言，作者观察到 OCR 上升，ECAR 更显著地上升，表明 IRIS 模型正向糖酵解方向转变（见图 4H ）。总之，OCR 和 ECAR 测量显示了辐射诱导衰老细胞的高代谢表型。3.5. ANT1 蛋白水平的增加是衰老发展的普遍特征为了确认 ANT 水平的变化是否是衰老细胞的普遍特征，作者分析了正常细胞、未转化细胞和癌细胞中多种额外的衰老类型。具体来说，作者考察了：（a）由多西他赛（DTX）诱导的正常人类皮肤成纤维细胞 BJ，导致药物诱发衰老（DIS）;（b）RPE-1 细胞中由多西环素（DOX）调控的 CDK 蛋白抑制剂 p21waf1（p21）或 p16INK4A（p16）异位表达诱导的衰老样表型;[25， 26]）;以及（c）两种胶质母细胞瘤细胞系 U-87 MG 和 A-172 中由抗癌药物替莫唑胺（TMZ）诱导的类似衰老型表型。SA‐β-Gal 测定（见图 S5A–E）验证了衰老的确立。此外，研究还比较了 RPE-1 细胞中的细胞衰老与接触抑制诱导的静止状态。在所有衰老和静止细胞群体中，μLC-PRM 分析显示未处理细胞相关的 ANT1 蛋白水平有所升高。然而，ANT2 和 ANT3 因细胞类型和衰老诱导因子的不同表现出不同的变化（图 5A ）。请注意，已呈现的 IRIS RPE-1 细胞分析（20 Gy;再次显示 D14），以便对所有衰老模型进行更便捷的比较。使用市售抗体进行免疫印迹检测确认 ANT1 和 ANT2 蛋白水平的变化（见图 S5F ）。值得注意的是，通过 RT-qPCR 测定的 ANT 转录本（图 5B ）同样未能与所有模型中 ANT 蛋白亚型的水平高度相符。通过 RT‐qPCR 测定的 l-PRM 与 mRNA 测量的蛋白质水平 μ 相关分析显示 ANT1 的相关性较弱（Spearman 0.250，P = 0.589），而 ANT2 的相关性强（Spearman 0.821，P = 0.023）和 ANT3 则 有强健显著相关性（Spearman 0.857，P = 0.014 ;图 5C ）。ANT1、ANT2 和 ANT3 蛋白及转录本水平在不同类型细胞衰老中的变化。在不同衰老模型及相应增殖对照中，测定了μLC-PRM 检测到的 ANT1、ANT2 和 ANT3（A）蛋白水平，以及 qPCR 检测到的与β-肌动蛋白转录本水平趋一化的（B）转录本水平。通过三次实验重复计算出处理组与增殖对照组之间的折叠变化平均值。（A，B）IRIS RPE-1 细胞的数据（20 Gy;图 4A、C 中的 D14） 再次显示，便于比较所有衰老模型。误差条表示标准误。（C）计算了 ANT mRNA 与蛋白质水平对数 2 倍变化的相关性。显示了斯皮尔曼相关系数 （斯皮尔曼） 和 P 值。测试模型包括接触抑制（RPE‐1 CI）、虹膜（RPE-1 20 Gy）、RPE-1 和 P21 CDK 抑制剂过表达（RPE-1 p16 和 RPE-1 p21）在 RPE-1 细胞中，多西他赛诱导的正常 BJ 成纤维细胞衰老（BJ DTX），以及 TMZ 诱导的胶质母细胞瘤细胞系衰老（A-172 TMZ 和 U-87 MG TMZ）。 计算结果基于三次实验重复。统计学中使用了斯皮尔曼排名相关系数。综上μ，LC-PRM 分析显示所有检测衰老类型在细胞衰老建立过程中 ANT1 蛋白水平均有所上升。同时，ANT2 和 ANT3 的衰老类型也存在变异变化。ANT1 蛋白水平的上升并未紧随其后，ANT1 转录本水平的上升。3.6. 衰老细胞代谢活动的增加与总 ANT 蛋白水平的增加相关随着作者证明 IRIS RPE-1 细胞表现出高代谢表型，接着作者确定了所有测试模型中增殖细胞及其生长抑制对应细胞的代谢表型（OCR 和 ECAR）变化（见图）。S6A、B 分别用于 OCR 和 ECAR 谱，图 S6C、D 用于衍生代谢特征）。与 IRIS 类似，RPE-1、A-172 TMZ 和 U-87 TMZ 衰老细胞在基线、ATP 相关呼吸、最大呼吸、备用容量和质子泄漏方面表现出增强的 OCR 特性，相较于增殖控制;而 RPE-1 p21 和 BJ DTX 在某些后续 OCR 特征上显著提升。值得注意的是，RPE-1 p16 细胞在 ATP 相关呼吸、最大呼吸和备用容量 OCR 特性显著下降。此外，除 RPE-1 p16 外，所有衰老模型（A-172 TMZ、U-87 TMZ、BJ DTX 和 RPE-1 p21）均表现出显著增加的糖解能力，与 IRIS RPE-1 相似。其他 ECAR 特征的变化则各异。对静止 RPE-1 细胞的分析显示，最大呼吸、质子泄漏和备用容量相较于增殖控制，这一趋势与 IRIS RPE-1 观察到的相似。相反，静止的 RPE-1 细胞基线和糖解能力均低于对照组。关于线粒体 OXPHOS 与糖酵解作为细胞能量来源的利用，RPE-1 接触抑制、p21 诱导衰老以及 TMZ 处理的胶质母细胞瘤显示出整体显著的氧化磷酸化（OXPHOS）代谢转变。相反，RPE-1 IRIS 和 p16 引起的衰老导致细胞向糖酵解作为能量来源的显著转变（见图。第六季）。随着作者的生物信息学分析揭示了 ANT 蛋白水平与线粒体质量之间的关联，作者预期 ANT 蛋白水平与 OCR 之间存在相关性。事实上，ANTs 的汇聚折叠变化与 OCR 变化呈强劲相关（Spearman 相关系数 0.929，P = 2.52e-03），表明在细胞衰老建立过程中 ANT 蛋白增加导致氧气消耗率升高（图 6A）。单独分析（见图 S6F），ANT1 蛋白水平与 OCR 无相关性，而 ANT2 和 ANT3 水平则显示强相关性（Spearman 相关系数 0.786，P = 0.036，Spearman 相 关系数 0.857，P = 0.014）。 有趣的是，作者的结果表明，ECAR 既不与单个 ANT 蛋白（见图 S6G）或合并的 ANT 蛋白（见图 6B）相关。由于作者观察到衰老细胞中质子泄漏 OCR 增加，作者比较了 ANT 与质子泄漏 OCR 的水平。然而，单个或整体 ANT 蛋白的变化与质子泄漏 OCR 的变化无显著相关（图 6C 和图 S6H）。LC-PRM 检测到的 ANT 蛋白变化μ 最大呼吸 OCR 的相关性。ANT 蛋白水平在静止 RPE-1（接触抑制;CI）以及不同的衰老模型（IRIS RPE‐1;20 Gy）、RPE‐1 细胞中的 CDK 抑制剂过表达（p16）和（p21）、正常 BJ 成纤维细胞中的 docetaxel 诱导衰老（DTX）以及胶质母细胞系 A-172 和 U-87 MG 中的 TMZ 诱导衰老。ANT 蛋白水平的叠层变化与最大呼吸 OCR（A）、糖解容量 ECAR（B）和质子泄漏 OCR（C）相关。通过三次实验重复计算得出的斯皮尔曼相关系数（ 斯皮尔曼 ）和 P 值。（A–C）统计学中使用了斯皮尔曼排名相关系数。总之，衰老细胞会提升其整体代谢活动。ANT 蛋白水平的累积变化对应于衰老诱导后氧气消耗速率的变化。3.7. 在替莫佐米特诱导衰老后，胶质母细胞瘤细胞系的线粒体质量和抗抗性抗体蛋白水平增加为探讨衰老诱导对细胞蛋白质组变化的更广泛影响，作者利用二维液相色谱与数据依赖质谱分析（2D LC–MS/MS）结合，分析了人类胶质母细胞瘤细胞系（U-87 MG）在 TMZ 治疗前后（100 μ 米 ）的整个蛋白质组。在 TMZ 诱导的 U-87 MG 细胞的蛋白质组中，有 1649 个蛋白质被上调。同时，暴露 14 天后，829 个蛋白在用 TMZ 处理细胞后下调。其中，ANT1、ANT2、ANT3 以及线粒体基因组编码蛋白（MT‐ND1、MT‐ND2、MT‐ND4、MT‐ND5、MT‐ND6、MT‐CYB、MT‐CO1、MT‐CO2、MT‐CO3、MT‐ATP6、MT‐ATP8）表现出显著的上调（见图 7A）。注意，未检测到 ANT4。此外，所有与线粒体动力学相关的蛋白质（GDAP1、DNM1L、OPA1、MFN1、MFN2、IMMT）和线粒体膜蛋白（TOMM70、TOMM40、TOMM22、TOMM20、TOMM50、TIMM44、TIMM29、TIMM23、TIMM22、TIMM21、TIMM13、TIMM10、TIMM9、TIMM8A）均上调，大多数显示出显著变化（见图 7A）。与胶质母细胞瘤和肺癌数据集类似，ANT 蛋白与线粒体蛋白（来自 MitoCarta3.0）的相关性比所有蛋白质更强（图 7B ）。ANT 蛋白甚至与大多数线粒体蛋白高度相关。值得注意的是，对照组 U-87 MG 细胞与 TMZ 后细胞之间的 ANT 蛋白相互相关性存在差异（图 7C ）。在对照组 U-87 MG 细胞中，ANT1 与 ANT2 呈强正相关，与 ANT3 呈强负相关。然而，ANT2 和 ANT3 在对照细胞中无相关性。 相反，在 TMZ 后细胞中，三种 ANT 均显示出强烈的正相关性，类似于作者在胶质母细胞瘤患者数据集中的观察。结合 TMZ 诱导的 ANT1、ANT2 和 ANT3 表达，以及作者 μ 的 LC-PRM 结果，强韧的相互相关是由所有 ANT 的增加以及线粒体总质量的增加所诱导的。暴露于 TMZ 的 U-87 MG 细胞的蛋白质组分析。（A）TMZ 处理后 ANT 蛋白及线粒体膜蛋白、线粒体动态和线粒体基因组的变化。星号表示根据经验贝叶斯调节的 t 统计量具有统计显著性。（B）ANT 蛋白与所有蛋白及线粒体蛋白的斯皮尔曼相关性。（C）对照 U-87 MG 细胞中单个 ANT 蛋白与 TMZ 后细胞之间的皮尔逊相关性。数据来自五次实验重复，每个点代表一次实验重复。总之，ANT 蛋白与线粒体蛋白有显著相关性。在 TMZ 处理下，ANT 蛋白水平的增加与线粒体质量的增加同时发生。总结 本研究分析了胶质母细胞瘤和肺癌患者的转录组和蛋白质组数据集，以评估 ANT 转录本和蛋白质水平。作者发现 ANT 转录本与蛋白质水平之间存在弱相关性，但线粒体质量与线粒体输入机制之间存在强强的相关性
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