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结果： 3.1 来自 TCMSP 数据库的主动组件 通过在 TCMSP 数据库中检索 WPTLD 活性成分，共检索到 166 种活性成分。其中包括 6 种読、7 种贵治、4 种炸香、88 种甘草、20 种生黄耆、15 种乳花、18 种双花菊和 8 种一木草;通过草药数据库和文献检索筛查了 36 种活性成分。筛选后保留了 144 种活性成分。采用涵盖质谱和色谱的 UHPLC-HRMS 分析 WPTLD，检测到 960 种化合物。与“第 3.1 节”中的 144 个活性组分相交，并通过确保 OB 为 30%，DL≥为 0.18，识别出 15 个有效生物活性组分≥。具体来说，UHPLC-HRMS 检测到的化合物类别见图 2A;化合物的色谱图见图 2B;质谱见图 2C 和 D。UHPLC-HRMS 分析结果。（A） 草药成分的成分分布和分类;（B） 鞣糖酸及其 MS/MS 谱的萃取离子色谱（EIC）与 LuMet-TCM 标准文库的比较;（C） 正离子模式下的 BPC（基峰色谱图）;（D） 负离子模式下的 BPC 图。通过 SwissTargetPrediction 对已识别组分进行目标预测，去除交集后得出 509 个靶点。对多来源疾病相关基因的综合分析识别出 1568 个 CRS 靶点，484 个铁遁相关基因和 919 个 anoikis 相关基因。维恩图分析（图 3A）揭示了 39 个组分-疾病相互作用靶点。WPTLD 靶点筛查与组织网络。（A） 组成部分-疾病靶点维恩图。（B，C）PPI 网络图。（D） 相互作用靶点-组织/器官网络图。使用 STRING 构建的 PPI 网络（图 3C）包含 33 个节点和 105 条边。基于中位度中心性（DC：6.364）、接近中心性（CC：0.015）和中间中心性（BC：34.909）的拓扑分析，确定了 8 个核心靶点（见图 3B），包括铁剥蚀/anoikis 相关 SIRT1、PTGS2 和 PRKCA。由于 BioGPS 数据不可得，YWHAG 被排除，剩余 38 个相互作用靶点可供组织定位。“目标组织/器官”网络显示，主要定位于肾脏、胸腺、肺、脂肪细胞、肾上腺和心脏组织（见图 3D）。富集分析通过 Metascape 平台进行，图表采用调整后的 P 值（q 值）绘制。KEGG 通路在 PI3K-Akt 信号通路、AMPK 信号通路、凋亡及其他信号通路中富集（图 4A）;Go 富集分析显示，生物过程对氧气水平、凋亡信号通路等有所富集，细胞组分在膜筏中富集，夹层盘，分子功能在蛋白激酶活性中富集，等（见图 4B）。“组分-靶向-通路”网络（图 4C）优先考虑七个生物活性成分：Paeoniflorin、Kaempferol、Isorhamnetin、甘香锥、格拉布里丁、鞣菜酸和黄芩碱。KEGG 通路映射进一步注释了信号级联中的核心靶点（见图 4D）。富集分析与 WPTLD 组分筛选。（A）KEGG 通路富集分析。（B） 全能富集分析。（C） 组分-靶点-通路网络。（D）PI3K - Akt 信号通路。主要选定的生物活性成分包括 paeoniflorin、kaempferol、isorhamnetin、甘香锥、格拉布里丁、鞣花酸和黄芩碱。分子对接验证使用铁磷遁症和 anoikis 的交叉靶点，即 SIRT1（PDB ID： 4ZZI）、PTGS2（PDB ID： 5F19）和 PRKCA（PDB ID： 4DNL）。结果如图 5 所示。结合能小于 0 kcal/mol 表示组合可以自发发生，结合能越低，结合能力越强。在该研究中，预测的主要生物活性成分与核心靶点之间的结合能范围为−5.5 kcal/mol 至−10.9 kcal/mol，显示出良好的结合能力。SIRT1-鞣花酸的分子对接模型（图 6）表明，SIRT1-鞣花酸在 SIRT1 上的结合位点位于原始激活剂上。因此，本研究对 SIRT1-鞣糖酸和 SIRT1 原始激活剂复合系统进行了 100 纳秒的 MD 模拟分析，包括均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）、旋转半径（Rg）、溶液可达表面积（SASA）以及整个过程氢键变化的统计分析，以研究分子结合的动态特性。如图 6A 中鞣花酸与 SIRT1 分子结合模型所示，鞣花酸与 SIRT1 的最佳结合构象与原始激活剂交集，且更接近蛋白质的片状区域β。从鞣花酸的二维结构（图 6B）可以发现鞣花酸具有 4 个羟基和 2 个内酯环结构。推测这些基团使鞣糖酸能够与β-片区形成更稳定的相互作用。随后，对这两个复杂系统的可视化分析进行了分析。从三维和二维图可以看出，原始激活剂仅与 SIRT1 的 Asn226 残基形成氢键，并且与周围氨基酸存在疏水性相互作用（见图 6C）。相比之下，鞣鞣酸可以与 SIRT1 的 Thr209 形成 1 个氢键，与 Asn226 形成 1 个氢键，与 Glu230 形成 2 个氢键，并且还能与周围氨基酸形成疏水性相互作用。因此，认为鞣糖酸可以与 SIRT1 形成比原始激活剂更稳定的复合物。SIRT1 - 异长酸分子对接模型。（A） 异相酸与 SIRT1 的对接模型。（B） 异异性质酸的二维结构。（C，D） 对接结果的示意图。MD 结果显示，两个复杂系统的 RMSD 曲线（图 7A）在 40 纳秒后逐渐趋向平衡，且两者的 RMSD 波动范围均在 1 纳米以内，表明原始激活剂和鞣花酸均可与 SIRT1 形成稳定的复合系统。此外，为研究小分子结合对蛋白质氨基酸残基柔韧性的影响，计算了 SIRT1 氨基酸的 RMSF 值。如 RMSF 结果（图 7B）所示，在 100 纳秒模拟过程中，原始激动剂出现了 3 次剧烈波动，而鞣花酸在整个 MD 过程保持稳定，表明小分子鞣花酸能够连续稳定结合 SIRT1。值得注意的是，与原始激活系统相比，鞣鞣酸的结合显著降低了该区域氨基酸残基的柔韧性。这一结果进一步表明，鞣鞣酸在该区域与氨基酸残基形成比原始激活剂更稳定的相互作用，从而减少该区域氨基酸的波动，帮助鞣花酸保持连续稳定性（见图 7E）。Rg 分析显示，两个复杂系统的 Rg 曲线具有相同的趋势和交集，表明模拟过程中 SIRT1 蛋白紧致度的变化相同（见图 7C）。SASA 分析显示，鞣花酸结合后，蛋白的 SASA 值低于原始激活系统，30 纳秒后，表明鞣花酸与 SIRT1 形成更多疏水相互作用，降低了蛋白质的亲水性（见图 7D）。如图 7F 所示，原始激活剂系统中的氢键数为 1 至 5，鞣糖酸系统中为 4 至 7。鞣岩酸与 SIRT1 形成的氢键比原始激活剂更多，这有助于鞣花酸与 SIRT1 之间形成更稳定的复合物系统。吉布斯自由能图描述了受体-配体复合物的稳定性。如图 8A 所示，SIRT1-原始激活剂复合物的吉布斯自由能三维拓扑相对粗糙，二维图显示存在两个最小能区。相比之下，SIRT1-鞣花酸复合物的吉布斯自由能三维拓扑形成一个几乎单一且平滑的能量簇，与二维图（图 8B）一致。该结果表明，在所选化合物中，鞣糖酸在 MD 模拟中具有最稳定的动态构象，这与 RMSD 分析的 MD 结果一致。根据 MD 计算结果，SIRT1-原始激活剂复合物的总结合自由能为−7.71 kcal/mol，而 SIRT1-鞣糖酸复合物的总结合自由能为−10.89 kcal/mol。SIRT1 - 鞴酸配合物的 100 纳秒 MD 模拟分析。（A） 配合物的 RMSD 曲线。（B） 小分子 RMSD 曲线。（C） 配合物的 Rg 曲线。（D） 配合物的 SASA 曲线。（E）SIRT1 的 RMSF 曲线。（F） 配合物的氢键变化曲线。复合吉布斯自由能分析。（A）SIRT1——原始激活剂复合物的三维和二维自由能景观。（B）SIRT1——异邦酸复合物的三维和二维自由能景观。蓝色和紫色阴影区域表明，在最低自由能区内，配合物的稳定构象可以在较低能量下被映射出来。弱或不稳定的相互作用会导致自由能景观中出现多个粗糙的簇，而强且稳定的相互作用则形成单一光滑的簇。总结 总之，本研究利用质谱法鉴定 WPTLD 的活性成分，并结合网络药理学、分子对接和分子动力学（MD）模拟，首次揭示 WPTLD 含有鞣花酸和黄芩碱等生物活性化合物。这些成分通过 SIRT1/PTGS2/PKCA 串联调控 AMPK 和 PI3K/Akt 信号通路，从而靶向心肾细胞中的铁消亡和 anoiks，以对抗 CRS。虽然本研究揭示了铁消亡和 anoikis 在 CRS 致病机制中的潜在作用，提供了分子机制的新见解，并为传统中医配方的现代化提供了科学验证，但由于缺乏体内和体外实验确认，仍受限于研究。需要进一步研究以阐明铁性磷遁症与阿诺伊基斯之间的相互作用，以及它们在 CRS 进展中的时空动态。
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