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结果： 为识别 PCa 中异常表达的基因，下载并使用 Python 3.9 分析了 TCGA 前列腺腺癌组、GSE21034 和 GSE6919 数据集的数据。在筛选标准为调整后的 P 值< 0.01 和 log2（ 折叠变化）> 1.2 的情况下，共识别出 14 个候选基因差异表达基因（见图）。1 鉴于先前研究已证明 SND1 作为 RBP 发挥作用，作者选择它作为目标基因，研究其在 PCa 进展中作为 RBP 的作用和机制。为探讨 SND1 在 PCa 中的表达，作者下载了癌症基因组图谱（TCGA）、GSE21034 和 GSE6919 数据库的公开数据，显示 PCa 组织中的 SND1 表达相较正常前列腺组织有所升高（见图 1B-D）。GSE141445的单细胞测序数据显示，腔型细胞中 SND1 的相对表达水平显著高于其他细胞类型，其次是 Cell_cycle 细胞（图 1E）。SND1 在管型细胞中的高表达表明，它可能与这些细胞的生物行为密切相关。为进一步确认 PCa 与良性前列腺组织间 SND1 的差异表达，作者基于 32 对临床 PCa 样本进行了 qRT-PCR 和西方印迹法。这些结果与 TCGA 和 GEO 数据集所得结果一致（见图 1F-G）。此外，如图 1H 所示，SND1 在 PCa 细胞系中显著上调，相较于 RWPE-1。SND1 在 PCa 临床样本和细胞系中表达升高。 答： 维恩图显示了 TCGA、GSE21034 和 GSE6919 上调基因的交集情况。B SND1 的表达模式在 497 个 PCa 组织和 53 个相邻正常前列腺组织中进行了分析（TCGA 数据库）。C， D GSE21034 和 GSE6919 的数据显示，PCa 组织中 SND1 的表达高于良性组织。E GSE141445 的单细胞测序数据显示，不同类型 PCa 细胞中 SND1 的相对表达水平。E 在作者对 32 个临床 PCa 样本及其配对正常组织的分析中，22 例 SND1 水平升高（68.75%）。G 对 14 对 PCa 样本进行了 SND1 的西方墨迹分析。分析了 PCa 细胞系和 RWPE-1 中 SND1 蛋白的 H 表达水平。β-肌动蛋白作为内部参考基于 SND1 的高表达，作者旨在研究其在 DU-145 和 PC-3 细胞中的生物功能。最初，针对 SND1 的 siRNA 和过表达质粒被用于体外抑制或增强 SND1 表达。随后通过西部印迹法验证了 KD 和过表达的效率（见图）。2A 和 F）。随后，CCK-8、菌落形成和 EdU 检测显示，SND1 KD 后 PCa 细胞的增殖能力显著受抑制（见 图 2B–D 和 S2A-B）。细胞周期分析显示，SND1 KD 导致细胞周期在 G1 期停止（见图 2E）。相反，SND1 过表达则产生相反结果，显著增强了细胞的增殖能力（见 图 2G–I 和 S2C-D）。与上述发现一致，西部印迹显示，SND1 KD 后下游 CDK2 和 CDK4 的表达水平显著下调（图 2J）。相反，Transwell 和伤口愈合检测显示 PCa 细胞在 SND1 KD 上的迁移能力被抑制（见图 2K-L 和 S2E-F）。同样，SND1 过度表达则产生相反效果，显著增强了细胞的迁移能力（图 2M 和 S2G）。基于 SND1 KD，西方印迹显示迁移相关蛋白（包括 E-cadherin、N-cadherin 和维曼蛋白）发生显著变化（见图 2N）。这些结果表明 SND1 在体外 PCa 增殖和迁移中起着关键调控作用。敲低 SND1 可抑制体外 PCa 细胞的增殖和迁移。通过西方印迹法验证了 SND1 的敲击。通过CCK-8、EdU 和菌落形成分析评估，Snapd1 的 B-D 敲低抑制了 PCa 增殖。E 细胞周期分析显示 SND1 KD 细胞在 G1 期停滞的细胞数量显著增加。通过西部印迹法验证了 SND1 的 F 过表达。SND1 的 G-I 过度表达促进了 PCa 的增殖和迁移。J 通过对 SND1 KD 进行西方印迹检测到 CDK2、CDK4、CCND1 的表达。通过跨孔测定和伤口愈合测定（尺度条=250 微米）评估 SND1 抑制的 PCA 迁移 K， L 敲低。M 用质粒过度表达 SND1 促进了通过转孔检测法评估的 PCa 迁移。N 通过 SND1 KD 的西方墨迹检测到 E-cadherin、N-cadherin 和 Vimentin 的表达。β-肌动蛋白是内部参考生成稳定的 SND1 KD PC-3 细胞，KD 疗效得到确认（图）。3A）探索其体内的生物学功能。在皮下移植模型中，稳定的 SND1 KD 显著抑制体内肿瘤生长（图 3B–E）。西方墨迹法确认了 shSND1 组蛋白水平显著的 SND1 KD（见图 S2H）。IHC 染色显示 shSND1 组 SND1 和 Ki-67 表达减少（见图 3F-G）。在转移性模型中，shNC 组在注射后六周时转移部位数较高（3/5 对 0/5）（见图 3H）。对转移部位进行了影像成像，随后进行了 H&E 染色（见图 3I-J）。总之，SND1 KD 在体内抑制肿瘤生长和转移。敲低 SND1 可抑制肿瘤生长和体内转移。SND1 通过基于 lentivirus 的 shRNA 技术稳定敲低，持续表达荧光素酶 PC-3 细胞系（PC3-luci）。B 通过每 4 天用电子游标卡尺测量肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线（ 每组 n=5）。观察结束时拍摄并记录了 C 皮下异种移植。D 裸体小鼠先被麻醉，然后进行解剖以获得皮下肿瘤，并测量其大小。E 对每组解剖的肿瘤进行了称重。对肿瘤中的 SND1 和 Ki-67 进行了 F、G IHC 染色（尺度条=100 微米）。H 静脉注射尾静脉肿瘤转移模型在体内进行成像，时间为第 6 周。我做了所有转移器官的影像分析，并再次影像以确认转移部位。进行了转移 （肺部）的 H&E 染色以验证转移性肿瘤组织。β-肌动蛋白是内部参考SREBF1 激活了 PCa 中的 SND1 转录鉴于 PCa 中 SND1 的上调，作者假设其转录可能被 ELK1 等因子激活[30]。利用包括 JASPAR、hTFtarget、TFDB 和 GeneCards 在内的在线工具，作者识别出 21 个 SND1 启动子的潜在转录因子（见图 4A）。作者还分析了 LinkedOmics 数据库的数据，以识别与 SND1 表达正相关的基因。这导致识别出三个交集基因：SREBF1、ZBTB7B 和 KLF1（见图 4B），根据 TCGA 数据（见图 S2I–K），这些基因在 PCa 中也被上调。ENCORI 数据显示，SND1 表达与 PCa 中的 SREBF1、ZBTB7B 和 KLF1 呈正相关（见图 4C 和 S2L-M）。为了进一步识别针对 SND1 基因的转录因子，作者首先排除了 KLF1，因其在 PCa 中的表达极低且与 SND1 的正相关性较弱。接着，作者利用 siRNA 通过 qRT-PCR 评估 SREBF1 和 ZBTB7B 的 KD 后 SND1 mRNA 表达。结果显示，SND1 在 SREBF1 KD 后被抑制，但未被 ZBTB7B KD 影响（见 图 4D-E）。SREBF1 KD 标记后，西方印迹观察到类似结果（见图 4F）。一系列功能性测定显示，PCa 细胞在 SREBF1 KD 上的增殖和迁移减少（见图 4G–I 和 S2N-O）。 SREBF1 激活 PCAA 中 SND1 的转录，JASPAR、hTFtarget、TFDB 和 GeneCards 均用于预测 SND1 潜在转录因子。B 根据 Linkedomics 和在线网站的数据，筛出了三位目标。进行了 SND1 与 SREBF1 之间的 C 相关分析。在用 siRNA 敲低 SREBF1 或 ZBTB7B 后，用 qRT-PCR 评估了 SND1 mRNA 的表达水平。 在用 siRNA 敲低 SREBF1 后，通过 western blot 评估了 SND1 的 F 表达水平。通过 CCK-8、菌落形成测定和转孔测定评估，SREBF1 的 G-I 敲低抑制了 PCa 的增殖和迁移能力。J 结合位点的主题是从 JASPAR 下载的。使用 SREBF1 抗体进行了 K ChIP-qPCR 的检测和分析。L 双荧光素酶报告测定由 SREBF1 质粒和 SND1 启动子驱动。使用生物素标记探针进行了 M 级 DNA 拉下测定。β-肌动蛋白是内部参考为进一步确认转录因子 SREBF1 对 SND1 启动子区域的调控作用，作者首先进行了 SREBF1 ChIP-seq，结果显示 SND1 启动子区域的峰与在线网站提供的结合序列一致（见图）。4 接着，作者进行了 ChIP-qPCR，确认 SREBF1 直接结合 SND1 启动子（见图 4K）。为确定特定结合区，进行了双荧光素酶报告检测，结果显示 SREBF1 过表达增强了野生型报告细胞的荧光素酶活性，而对突变报告体无影响（见图 4L）。此外，设计了生物素标记的 SND1 启动子探针以捕获 SREBF1，随后的 DNA 下拉分析验证了 SREBF1 与 SND1 启动子区域的相互作用（见图 4M）。这些发现表明 SREBF1 作为一种致癌转录因子，激活 SND1 转录。SND1 通过 MTDH 的相互作用调控 SESN2 表达水平此前，大多数关于 SND1 的研究集中在其转录调控功能[31， 32]。近年来，许多研究证实 SND1 作为 RBP 调控 RNA 代谢，如 RNA 稳定性、翻译和剪接[33]。为明确 SND1 在 PCa 细胞中的分布，作者进行了 IF 和核细胞质蛋白提取测定，结果显示 SND1 主要定位于细胞质中（见 图 5A-B）。然而，SND1（一种 RNA 结合蛋白）在 PCa 中发挥促致癌作用的具体机制尚不明确。为识别与 SND1 协同调控 RNA 代谢的蛋白质，进行了 Co-IP-LC/MS 分析，质谱显示 MTDH 是 SND1 拉出的最丰富的相互作用蛋白，位列所有结合蛋白中第一（见图 5C）。基于这些发现，作者将研究重点放在 SND1 与 MTDH 之间的相互作用上。SND1 通过 MTDH 相互作用调控 SESN2 的表达水平，A 间因子显示了 SND1 在亚细胞中的定位。B 细胞核和细胞质提取物的分离显示了 SND1 蛋白在 PCa 细胞中的定位。列出了通过 LC/MS 鉴定出与 SND1 结合丰度最高的 C 蛋白。进行了 D 共 IP 验证 MTDH 与 SND1 之间的相互作用。进行了 E IF 以验证 MTDH 与 SND1 之间的相互作用。F 截断质粒的示意图如所示。进行了 G Co-IP 以验证 SND1 与 MTDH 结合的区域。H Venn 图建议通过 eCLIP-seq、RNA-seq 和 RIP-seq 初步筛选交集基因数量（48 个以上）。对 SND1 和 SESN2 进行了相关分析 。J 通过 qRT-PCR 检测到潜在靶向 mRNA 的表达，适用于 SND1 KD。K， L 通过 qRT-PCR 检测到 SND1 KD 或 MTDH KD 时，SESN2 的 mRNA 水平。M SESN2 的蛋白质水平通过西方印迹检测到 SND1 KD 或 MTDH KD。β-肌动蛋白是内部参考先前研究报告称 MTDH 与 SND1 相互作用，促进乳腺癌进展[34]。然而，这种互动在 PCa 中尚未得到确认。作者进行了共免疫和间因子实验，证明 SND1 与 MTDH 相互作用（图 5D-E）。基于郭等人[35]的报告，作者设计了带 FLAG 标签和截断 SND1 质粒（16–339， 340–910）的全长 SND1 质粒，以及携带 HA 标签的截断 MTDH 质粒（364–582）（见图 5F），并进行了 Co-IP 实验。与之前的发现一致，SND1 的 16–339 区与 MTDH 的 364–582 区相互作用（图 5 G）。进一步的功能性分析和西方印迹法显示，MTDH KD 通过影响细胞周期和迁移相关的蛋白质表达，抑制了 PCa 细胞的增殖和迁移（见图）。第三季A–F）。作者的结果表明 SND1 与 MTDH 相互作用，促进 PCA 进展。为探索 SND1 的 mRNA 调控作用及筛选潜在下游靶点，在 PC-3 细胞中进行了 mRNA 测序和 RIP 测序。Scadden 等人报告了 SND1 作为 RISC 复合物的组成部分，促进双链 RNA 的切割[8]。此外，Shen 等人进行的一项重要研究表明，MTDH-SND1 复合物介导 Tap1/2 mRNA 降解[36]。因此，作者重点关注在 SND1 KD 上调的 mRNA。通过整合 RIP-seq 结果与 eCLIP 数据，作者识别出 48 个候选基因，并聚焦于 SND1 KD 之后上调最显著的十个基因（见图。5 随后作者与 SND1 进行了相关分析。结果显示，SESN2、TPM4、ADM、PPP1R15A、ABCA1 和 HMOX1 与 SND1 呈显著负相关（见图。5I 和 S3G–K）。根据 TCGA 数据库，ABCA1 和 HMOX1 被排除在 PCa 中进行上调。后续 PCR 验证显示，SND1 KD 后 SESN2、TPM4 和 PPP1R15A 表达增加，其中 SESN2 变化最显著，而 ADM 表达保持不变（见图 5J）。因此，作者初步选择 SESN2 作为由 SND1 调控的下游靶点，该指标已被报道在多种癌症中下调并抑制膀胱癌进展，但其在 PCa 中的作用尚不明确[24， 37]。因此，作者假设 SESN2 可能在 PCa 中发挥肿瘤抑制作用，MTDH-SND1 复合物靶向 SESN2 mRNA 进行降解，从而促进 PCa 的进展。进一步实验表明，SND1 或 MTDH 的 KD 显著促进 SESN2 表达，证实了它们对 SESN2 的调控作用（见图）。 5K–M）。Meng 等人采用小分子筛选系统，鉴定 C26-A6 作为破坏 MTDH-SND1 蛋白-蛋白质相互作用的特定抑制剂。据报道，C26-A6 显著抑制了三阴性乳腺癌的生长和转移。然而，其对 PCa 中 MTDH-SND1 复合物的药理作用尚未被充分探讨。作者首先确定了 DU-145 和 PC-3 中 C26-A6 的半最大抑制浓度值（见图。第四季随后，功能性实验表明，随着药物浓度的增加，增殖和迁移能力会逐渐被抑制（见图 6A-B 和 S4B-D）。同样，C26-A6 在体内抑制肿瘤生长和转移（图 6C-E 和 S4E-G）。此外，作者发现破坏 MTDH-SND1 蛋白与 C26-A6 的相互作用可提升 SESN2 mRNA 和蛋白质水平（见 图 6F-G）。作者的初步发现表明，用 C26-A6 破坏 MTDH-SND1 复合物还能调节 SESN2 表达并影响 PCa 的进展。MTDH-SND1 复合物促进 SESN2 mRNA 的衰变，而 C26-A6 抑制该效应，A，B 的 C26-A6 在体外抑制了 PCa 的增殖和迁移。C-E C26-A6 抑制了体内 PCa 的增殖和迁移。F、G C26-A6 显著提升了 SESN2 mRNA 和蛋白质水平。H RIP-PCR 检测澄清了 MTDH、SND1 和 SESN2 mRNA 的关联。 我用 RIP-PCR 检测澄清了 MTDH 对 SESN2 的调控依赖于 SND1。J RIP-PCR 检测法澄清了 SND1 至 SESN2 的调控依赖于 MTDH。K RNA 拉下分析证实了 SND1 与 SESN2 mRNA 之间的相互作用。在 SND1 KD 或 MTDH KD 细胞中，检测到 SESN2-WT 和 SESN2-Mut 的相对荧光素酶活性。M-P RNA 稳定性测定显示，SND1 KD，或 MTDH KD，或 C26-A6 延长了 SESN2 mRNA 的半衰期。β-肌动蛋白是内部参考MTDH-SND1 复合物促进了 SESN2 mRNA 的降解Shen 等人报告称，MTDH-SND1 复合物直接与 Tap1/2 mRNA 相互作用并降解，从而损害肿瘤抗原呈现并抑制 T 细胞激活。为了探讨 MTDH-SND1 复合体在 PCa 中 SESN2 mRNA 中的作用，作者首先进行了 RIP-qPCR 以评估 SND1 与 SESN2 以及 MTDH 与 SESN2 之间的相互作用。结果显示，SESN2 mRNA 相比 IgG 在 SND1 或 MTDH 中显著富集（见图）。6 利用慢病毒介导的 SND1 或 MTDH 的 KD 检测，作者观察到 SND1 KD 显著抑制 MTDH 与 SESN2 mRNA 的结合，表明 SND1 对 MTDH 与 SESN2 的结合至关重要。相反，在 MTDH KD 的肿瘤细胞中，SND1 与 SESN2 的结合明显减弱，表明 MTDH 在促进 SND1-SESN2 相互作用中起关键作用（图 6I-J）。还进行了 RNA 拉下分析，反向结合，结果显示生物素标记的 SESN2 RNA 寡果能够与 SND1 结合（见图 6K）。此外，后续的双荧光素酶报告检测显示，抑制 SND1 或 MTDH 显著增强了 SESN2 野生型报告者的荧光素酶活性，但对 SESN2 突变报告者的活性无影响（见图）。6L-M 和 S4H）。作者在采集前 4、2 和 0 小时用放线霉素 D 进一步处理细胞，后续的 PCR 结果显示 SND1 或 MTDH 的 KD 或 C26-A6 治疗可抑制 SESN2 mRNA 的衰变速率（图 6N-P）。这些结果表明 MTDH 和 SND1 可以直接结合 SESN2 mRNA，且 SESN2 的负向调控依赖于 MTDH-SND1 复合物的形成。SESN2 负责 SND1 和 MTDH 诱导的 PCa 进展调控多项研究证实 SESN2 促进多种癌细胞类型的凋亡，包括肺腺癌、结肠癌、人类头颈癌等[37， 38， 39]。然而，SESN2 在 PCa 中的作用仍然难以捉摸。对 TCGA 数据库的分析显示，与良性前列腺组织相比，PCa 组织中的 SESN2 被下调（见图 7A），这一现象在作者中心的临床样本中也得到了确认（见图 7B）。一系列功能性实验显示，SESN2 的过度表达抑制了 PCa 的进展（见图 7C-E 和 S5A-B），而沉默 SESN2 则产生相反结果（见图 7F-I 和 S5C-D）。此外，SESN2 过表达抑制了细胞周期相关蛋白和间充质标志物的蛋白质水平，从而抑制了细胞周期和上皮-间充质转变（见图 7J）。SESN2 负责 SND1 和 MTDH 诱导的 PCa 进展调控。SESN2 的表达模式绘制于 497 个 PCa 组织和 52 个正常前列腺组织，数据来源于 TCGA 数据库。B 三对 PCa 样本对 SND1 进行了西方印迹分析。SESN2 的 C-E 过度表达抑制了 PCa 肿瘤的生长和转移，通过集落形成分析和转孔测定（尺度条=250 微米）获得。F-I 敲低 SESN2 促进了 PCA 肿瘤的生长和转移，这些均可通过 CCK-8、菌落形成测定和跨孔测定（尺度条=250 微米）实现。J 在 SESN2 过表达后，通过 western blot 检测到 CDK2、CCND1、E-cadherin、N-cadherin 和 vimentin 的表达。K 通过 SESN2 过表达后，通过 western blot 检测到 AMPK、p-AMPK、mTOR 和 p-mTOR 的表达。L， M Western 墨迹显示，SESN2 的敲低部分逆转了 SND1 KD 或 MTDH KD 诱导的 SESN2 表达增加。N、O CCK-8 及转孔测定法，均可单独敲低 SND1 或与 siSESN2 共转染（尺度条=250 微米）。P：敲低 SND1 后 p-AMPK 的表达被检测到。β-肌动蛋白是内部参考SESN2/AMPK/mTOR 通路对于调节细胞能量代谢、应激反应和癌症进展至关重要[26]。Yu 等人报告称，miR-615-3p 通过抑制该信号通路促进骨肉瘤的进展[40]。因此，作者研究了该通路中蛋白质的表达和激活。结果显示，SESN2 过表达导致 AMPK 在 Thr172 处磷酸化，激活 AMPK 并部分抑制 mTOR 信号（见图 7K）。综合来看，这些发现表明 SESN2 通过激活 AMPK/mTOR 通路，在 PCa 进展中起抑制作用。为了进一步澄清 SND1 和 MTDH 促进 PCa 进展是否依赖于 SESN2，进行了救援实验。CCK-8 和菌落形成实验表明，SND1 的 KD 或 MTDH 极大地抑制了 PCa 细胞的增殖，这一增殖部分被 SESN2 KD 挽救（见图）。7N 和 S5E-G）。Transwell 测定（图 7O 和 S5H）也观察到类似结果。功能性测定结果通过西方印迹法得到确认（图 7L-M）。最后，在 SND1 KD 之后，作者观察到 Thr172 处 AMPK 的磷酸化和活化，进一步证实了作者的假设（图 7 P）。作者的研究表明，在 PCa 中，SND1 基因被 SREBF1 转录激活，SREBF1 与 MTDH 相互作用并降解 SESN2 mRNA，从而抑制 AMPK 激活并促进 mTOR 信号传导。该信号通路可被 MTDH-SND1 特异性抑制剂 C26-A6 逆转。拟议的 SREBF1/SND1/SESN2/AMPK/mTOR 通路可能为 PCa 治疗提供新见解。总结 迄今为止，已有大量研究进展，发表了大量重要论文，内容涵盖 MTDH-SND1 复合体在乳腺癌进展中的作用、靶向该复合物的抑制剂设计及其肿瘤抑制效果。这些发现表明针对该复合物的药物设计具有广泛的应用前景。PCa 和乳腺癌有一些共同的生物学行为;然而，该药物对 PCa 的影响尚未得到完全验证。作者的研究显示，抑制 MTDH-SND1 复合物与 C26-A6 的形成，可以有效抑制 PCa 细胞在体外和体内的生长和转移。这表明 C26-A6 具有进一步临床应用的潜力。在后续研究中，作者需要收集更多临床样本，改善 PCa 的病理结果，并探索 C26-A6 在 PCa 治疗中的临床价值。
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