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结果： 为调查与活跃性溃疡性结肠炎相关的 SeMet 相关基因的变异，合并了GSE75214 和 GSE87466 数据集，并移除了批量效应。随后，通过 R 中的“limma”包鉴定了差异调控基因（DRG）。如图 1A 所示，27 个 DRG 在 UC 与健康对照组之间表现出明显的表达模式。具体来说，FOS、SELENOM、SELENON、DIO2、GPX1、GPX2、SELENOK、RELA、SELENOS、CREM 和 TRNAU1AP 等基因显著上调，而 SELENBP1、SELENOW、GPX4、TXNRD2 等基因明显下调。带有|log₂FC|选择了> 0.5 和调整后的 P 值< 0.05 进行下游分析。 图 1B 展示了 11 个最显著失调 DRG 之间的相关矩阵。为探讨 UC 中的免疫失调及 DRGs 的参与，作者采用 ssGSEA 技术量化 UC 和对照样本中不同免疫细胞类型的相对丰度。如图 1C 所示，激活的树突状细胞、CD8⁺ T 细胞、B 细胞、自然杀伤细胞（NK）、巨噬细胞和中性粒细胞在 UC 组织中显著富集。DRG 与免疫浸润之间的相关分析显示出明显的关联模式（ 见图 1D）。SELENOM 和 SELENON 与中枢记忆 CD4⁺ T 细胞、效应记忆 CD8⁺ T 细胞和 NK 细胞呈正相关，而 SEPSECS、SEPHS2 和 SELENBP1 则与中性粒细胞和巨噬细胞呈反相关。这些发现表明，DRGs 可能通过调节免疫细胞浸润和活性，影响 UC 的疾病进展。活动性溃疡性结肠炎中 SeMet 相关基因的变异。（A）散点图，显示 UC 与对照组之间 SeMet 相关基因表达差异。（B）饼图大小反映了基因间的相关系数。（C）小提琴图，比较 UC 与对照组的免疫细胞浸润情况。（D）对 11 种差异表达的 DRGs 和免疫细胞类型的相关分析。（E）k = 2 的共识聚类热力图。（F）11 个 DRG 在已识别亚型间的差异表达热图。（G）显示 11 个 DRG 亚型特异表达的箱形图。（H）展示不同亚型免疫细胞浸润差异的小提琴图。（ 一 ）GSVA 结果，比较簇 1 和簇 2 之间通路富集情况。统计显著性表示如下：ns，不显著;*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001;P < 0.0001.基于 11 个上调的 DRG 表达谱，对 161 个活跃 UC 样本进行了共识聚类分析。最优聚类数被确定为 k = 2，并得到多种评估指标的支持，包括共识矩阵结构（图 1E）、累积分布函数（CDF）曲线形状（图 S1A）以及 CDF 面积变化图中的拐点（图 S1B）。因此，识别出与硒蛋白和硒代谢相关的两个分子亚型，并被指定为第 1 簇（n=73）和簇 2（n=88）。热图和箱体图（图 1F 和 G）显示，第 1 群中 SELENOK、SELENOM、SELENOS、CREM 和 DIO2 的表达水平显著高于第 2 群。免疫分析显示，激活的 CD4⁺ T 细胞、活化树突状细胞、效应记忆 CD8⁺ T 细胞、中性粒细胞和巨噬细胞在第 1 簇中相较于第 2 簇显著富集（见图 1H）。基因组变异分析（GSVA）进一步表明，Cluster 1 在多种免疫相关通路中正富集，包括自然杀伤细胞介导的细胞毒性、JAK-STAT 信号、Toll 样受体信号和 NOD 样受体信号，而在硒半胱氨酸代谢和 PPAR 信号通路中则呈负富集（见图 1I）).这些发现表明，第一群患者很可能处于明显炎症反应和血清蛋白功能受损的阶段。 鉴于血清蛋白被划分为家务型和应激相关类型，作者进行了差异表达分析，比较了非活跃与活跃结肠炎患者之间的血清蛋白表达，使用 GSE75214 数据集。本分析发现活动性结肠炎中 SELENOM、SELENOS 和 DIO2 的显著上调（见图 S1C），支持它们在炎症活动期间的参与。为识别与临床性状高度相关的基因，作者选择了 WGCNA 中 UC 与健康对照样本之间变异性最高的前 25%基因。剔除异常样本 β，并根据无尺度拓扑准则（阈值=0.8;图 S1D）。通过动态树切割算法，识别出九个不同的基因模块，每个模块用独特的颜色表示。模块特征基因与临床性状的相关分析显示，粉色模块（包含 202 个基因）与 UC 状态的关联最强（见图 2A 和 S1E）。基于上述两种 UC 亚型，进行了单独的 WGCNA 研究。软阈值功率为β = 17 时，检测到八个不同的模块（见图 S1F）。与亚型特征的相关分析显示，棕色模块与包含 216 个基因的簇 1 呈正相关最强（见图 2B 和 S1G）。通过交叉粉色和棕色模块的基因集，识别出 19 个交集的候选签名基因供进一步分析（见图 2C）。为降低维度并消除冗余，采用了最小绝对收缩与选择算子（LASSO）回归，并进行了十倍交叉验证，最终选中了 10 个基因（见图 2D 和 E）。随后，对交集基因集应用支持向量机（SVM）模型进行进一步筛选，当包含六个基因时，均方根误差（RMSE）达到最小值（见图 2F 和 G）。结合两种方法的结果，鉴定出六个潜在核心基因：WARS1、犬尿素酶（KYNU）、几丁酶 3 类 1（CHI3L1）、纤溶酶激活剂、尿激酶（PLAU）、葡萄糖 B（GZMB）和 Caspase-4（CASP4）（见图 2H）。为构建 UC 的预测模型，使用并评估了 15 个机器学习算法，并结合合并后的数据集以及三个外部验证队列（GSE47908、GSE48958 和 GSE206171）。前 50 个模型按曲线下面积（AUC）排名，见图 2I。计算了不同模型间的基因特征重要性（见图 S2A），并通过多个模型的综合整合得出预测基因的最终排名（见图 2J）。 签名基因验证及预测模型构建。（A）显示模块特征基因与 UC 状态相关性的热图;红色和蓝色分别表示正相关和负相关。（B）模块本征基因与分子亚型之间的相关热图。（C）疾病相关模块与亚型相关模块之间识别出的共享基因。（D 和 E）使用 LASSO 回归模型进行特征选择。（F 和 G）通过 SVM-RFE 分析关键基因鉴定。（H）维恩图，显示两种机器学习方法识别的共同候选基因。（I）集成热图，展示每个算法在数据集中排名前 50 的 AUC 值。（J）条形图，对六个选定特征基因的重要性评分进行排序。随后进行了分析以验证六个特征基因的表达和诊断潜力。在独立测试集中，六个基因——WARS1、KYNU、CHI3L1、PLAU、GZMB 和 CASP4——在 UC 样本中均显著上调，相较于健康对照组（见图 3A），AUC 值超过 0.80，显示诊断表现稳健（见图 3B）。同样，在外部验证集中，这六个基因仍显著上调（见图 S2B），其 AUC 值也表现出较高的诊断准确性（见图 S2C）。为了阐明这些基因在活跃性溃疡性结肠炎中的潜在生物学功能，进行了基因集富集分析（GSEA）。所有六个特征基因均在多条免疫相关信号通路中正富集，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、B 细胞受体信号传导、T 细胞受体信号传导、Toll 样受体信号传导以及 JAK-STAT 通路（见图 3C）。相比之下，这些基因在与神经退行性疾病相关的通路中呈负富集，如阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症和帕金森病（见图 3C）。鉴于免疫相关通路的富集，作者进一步研究了六个特征基因与 28 种免疫细胞类型浸润之间的关联。观察到这些基因的表达与多种免疫细胞群体之间存在强烈的正相关（见图 3D），表明它们参与免疫激活。此外，六个标志性基因之间的相关分析揭示了潜在的共调控关系（图 3E）。综合来看，这些结果表明特征基因可能通过调节免疫细胞反应来促进 UC 的发病机制，可能通过协同机制。活跃性 UC 特征基因的功能分析。（A）训练集中 WARS1、KYNU、CHI3L1、PLAU、GZMB 和 CASP4 的表达谱。（B） ROC 曲线评估训练集中特征基因的诊断性能。（C） GSEA 结果展示了单个特征基因的通路富集。（D）相关矩阵，显示特征基因与 28 种免疫细胞类型之间的关联。（E）六个特征基因之间的基因间相关性。*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001， ****P < 0.0001.溃疡性结肠炎中与血清蛋白相关基因的单细胞转录组分析使用 Seurat R 软件包对GSE214695 数据集中的六个 UC 组织样本进行了单细胞 RNA 测序分析。通过主成分分析（PCA）和统一流形近似与投影（UMAP）进行聚类和降维，识别并注释了 13 种不同的细胞类型：B 细胞、CD4⁺ T 细胞、CD8⁺ T 细胞、结肠细胞、内皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、杯状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、浆细胞和束细胞（图 4A）).鉴于 SELENOP 是负责运输约 60%总血清硒的关键血清蛋白，进一步分析重点关注在大体转录组数据中升高的血清蛋白，包括 SELENOP。13 种已识别细胞类型中硒蛋白基因的表达谱如图 4B 所示。利用 Seurat 中的 FindMarkers 函数，对 UC 与健康对照样本进行了差异表达分析。结果显示，上皮细胞群体中，尤其是结核细胞和杯状细胞中，多个硒蛋白基因的显著上调（见图 4C）。溃疡性结肠炎中硒蛋白相关基因的单细胞转录组分析。（A） UMAP 分析显示已识别的细胞类型。（B）显示 13 种细胞类型中硒蛋白基因表达的特征图。（C）显示 UC 与对照组间硒蛋白基因表达差异的热图。（D）巨噬细胞亚型的 UMAP：M0、M2、IDA 和 M1。（E）单片镜 2 伪时间分析揭示了巨噬细胞分化轨迹及跨亚型的转录动态。（F）在巨噬细胞极化态上的 Selenop、SELENOK 蛋白的伪时间依赖表达。（G） CellChat 分析显示，肠道上皮细胞通过 LGALS9–HAVCR2 信号轴调控巨噬细胞功能。（H）上皮细胞中不同 LGALS9 表达水平的 SELENOP 差异表达。“×”表示在对应细胞类型中无可检测表达的基因。统计显著性表示如下：ns，不显著;*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001。相比之下，SELENOP 表达在多个免疫细胞群体中显著下调，包括巨噬细胞、CD4⁺ T 细胞、CD8⁺ T 细胞和中性粒细胞（见图 4C）。鉴于巨噬细胞极化在调节 UC 炎症反应中的关键作用，作者进一步探讨了关键硒蛋白——特别是 SELENOP、SELENOK、SELENOM、SELENOS 和 GPX2——在巨噬细胞群体中的功能作用。基于 Alba 等人的分类 ，作者将巨噬细胞分为四个不同的亚型：M0 巨噬细胞、M2 巨噬细胞、炎症依赖性替代巨噬细胞（IDA）和 M1 巨噬细胞（见图 4D）。最新研究表明，常驻巨噬细胞通常属于 M0 或 M2 亚群，而炎症性巨噬细胞则被归类为 M1 型或 IDA 型。30 为更好地理解巨噬细胞群体间的转录关系，作者应用了无监督推断方法单片镜 2（Monocle 2）构建潜在的过渡轨迹（见图 4E 和 S3A），并生成了分面伪时间图，展示每位患者细胞的分布（图 S3B）).以往研究表明，SELENOK 在免疫细胞迁移中起着关键作用，包括 T 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DC）。33–36 相比之下，缺乏 SELENOP 的巨噬细胞迁移能力明显下降。12 此外，受损的 SELENOP 功能与 M2 极化增强相关。有趣的是，SELENOP 可能抑制促炎免疫极化，从而减轻炎症驱动的肿瘤发生。38 这表明巨噬细胞行为和免疫稳态中具有复杂的调控作用。此外，巨噬细胞中的 SELENOS 缺乏通过靶向泛素 A-52 核糖核蛋白（Uba52）抑制 YAP 泛素化和降解，促进 M1 极化。39 在作者的分析中，分化轨迹显示了 SELENOK 和 SELENOP 表达的显著变化（见图 4F）。在将巨噬细胞分为常驻亚型和炎症型后，作者观察到溃肠炎患者的炎症性巨噬细胞显著上调 SELENOK 和 SELENOS，同时降低 SELENOP（见图 S3C）。综合来看，这些发现表明多种血清蛋白协同调节巨噬细胞极化和功能，在溃疡性结肠炎相关炎症中发挥关键作用，并塑造免疫微环境。为了研究免疫细胞与上皮细胞之间潜在的串扰，作者使用 CellChat 进行了进一步分析。结果显示，肠道上皮细胞可能通过 LGALS9–HAVCR2 信号轴调控巨噬细胞功能（见图 4G）。值得注意的是，SELENOP 表达较高的上皮细胞也表现出升高的 LGALS9 水平，表明该信号通路在这些细胞中可能更为明显（见图 4H）。作者应用相同算法分析单细胞层面特征基因的表达（见图 S3D–F）。其中，WARS1、CASP4、KYNU 和 PLAU 在大多数细胞类型中普遍上调。GZMB 主要在免疫细胞中上调，而 CHI3L1 在成纤维细胞中表达最高。值得注意的是，溃疡性结肠炎患者的炎症性巨噬细胞显示出 WARS1、CASP4 和 KYNU 显著上调。为进一步验证这些结果，作者分析了 GSE231993 数据集中的 12 个额外样本，其中包括 8 名患者的 UC 和正常组织样本。在降维和聚类后，作者使用 SingleR 软件包识别出九种不同的细胞类型（见图 S4A）。随后对单核细胞聚集的细化揭示了四个亚群：常驻巨噬细胞、浸润巨噬细胞、DCs 和少量增殖巨噬细胞群体（见图 S4B）。随后，作者评估了这九种细胞类型中硒蛋白基因和特征基因的表达差异及分布模式（见图 S4C–F）。与早期发现一致，大多数血清蛋白在上皮细胞中显著上调，而 SELENOP 在大多数非上皮细胞类型中显示明显的下调。签名基因在几乎所有细胞类型中也普遍升高。最后，驻留型与炎症性巨噬细胞之间的差异分析得出了与前述类似的结果（见图 S4G）。需要进一步研究来阐明这些差异背后的生物学功能。为了研究血清蛋白基因和六个特征基因的差异表达，作者建立了由 DSS 诱导的小鼠结肠炎模型。诱导后，作者采集了对照组和 DSS 处理小鼠的结肠组织，进行分子和组织学分析。此外，还采集了五名溃疡性结肠癌患者和五名健康个体的结肠组织样本以进一步验证。qPCR 显示 DSS 组中多个关键硒蛋白基因（包括 DIO2、GPX2、SELENOM、SELENON 和 SELENOS）较对照组显著上调（见图 5A）。其中，GPX2、SELENOM 和 SELENON 在蛋白层面通过 IHC（图 5B 和 S5A–B）和 Western blotting（图 5C）进一步验证，均持续确认其在炎症结肠组织中的表达升高。鉴于血清蛋白在维持氧化还原稳态和缓解氧化应激中的作用已确立，作者接着考察了它们在体外氧化应激下的诱导性。细胞被用过氧化氢（H₂O₂）处理以模拟氧化损伤，并随时间监测基因表达动态。值得注意的是，在 H₂O₂刺激后，GPX1/2、SELENOM 和 SELENON 的蛋白质水平呈时间依赖性上升，表明它们参与细胞抗氧化防御机制（见图 5D）。验证溃疡性结肠炎中硒蛋白的差异表达。（A）实时 PCR 分析结果展示了几个关键血清蛋白基因的表达水平。（B）免疫组化实验，验证患有 UC 的 WT 小鼠结肠中 GPX1/2、SELENOM 和 SELENON 的表达。（C）患有溃疡性结肠炎的 WT 小鼠结肠中的 GPX1/2、SELENOM 和 SELENON 蛋白水平。（D）在 H2O2（200μM）刺激下，HCT116 细胞和 NCM460 细胞中 GPX1/2、SELENOM 和 SELENON 的动态表达进行西方印迹分析。统计显著性表示如下：ns，不显著;*P < 0.05;**P < 0.01。特征基因分析验证了生物信息学预测，显示 DSS 处理组存在显著上调（见图 6A）。鉴于 WARS1 在多种机器学习算法中基因重要性排名最高，作者对该基因进行了进一步研究。在细胞内，WARS1 主要将色氨酸（Trp）与其对应的 tRNA 连接，进行蛋白质合成。在细胞外，它还具有先天免疫激活剂的作用。40 项先前研究报告称，间充质干细胞（MSCs）中 IFN-γ介导的 WARS1 分泌有助于抑制过度炎症和 IBD 的进展，41 强调其免疫调节潜力。最新研究表明，WARS1 下调影响细胞质翻译和线粒体蛋白合成，激活线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt），这是细胞应激和炎症中的重要通路。总体而言，这些发现表明 WARS1 可能在 UC 中发挥重要作用。WARS1 作为溃疡性结肠炎潜在治疗靶点。（A）实时 PCR 分析结果展示了特征基因的表达水平。（B）多个 GEO 数据集中 WARS1 mRNA 的表达水平。（C）对溃疡性结肠炎患者炎症肠道组织及对照组正常组织中 WARS1 表达的免疫组化染色图像。（D）患有 UC 的 WT 小鼠结肠内 WARS1 蛋白水平。（E）在 H2O2（200μM）刺激下，HCT116 和 NCM460 细胞中 WARS1 动态表达的 Western blot 分析。（F）西方印迹确认 HCT116 和 NCM460 细胞中的 WARS1 敲低。（G）qPCR 显示 WARS1 基因降和调控 HCT116 和 NCM460 细胞炎症因子的变化。统计显著性表示如下：ns，不显著;*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001;P < 0.0001.为了进一步探讨 WARS1 的功能，作者利用基因表达综合录（GEO）中的四个公开数据集（GSE75214、GSE13367、GSE38713 和 GSE9452）分析了溃疡性结肠炎患者和健康对照组的结肠黏膜样本中的基因表达特征。与健康对照组和非活跃性结肠炎患者相比，WARS1 表达在活跃性结肠炎患者中显著更高（ 见图 6B）。作者通过免疫组化（ 见图 6C 和 S5C）和西方印迹（ 见图 6D）进一步确认了 DSS 处理组中 WARS1 蛋白水平升高。值得注意的是，暴露于 H₂O₂的细胞中 WARS1 表达逐渐增加，表明其在氧化应激反应中起作用（ 见图 6E）。此外，作者在活跃的 UC 患者样本中观察到 WARS1 与炎症性细胞因子（如 TNF-α、IL-1β和 IL-6）呈强正相关（ 见图 S5D），暗示其参与炎症级联反应。为验证这一点，作者在 HCT116 和 NCM460 细胞系中敲低了 WARS1（ 见图 6F），结果 TNF-α、IL-1β和 IL-6 显著上调（ 见图 6G）。综合来看，这些发现表明 WARS1 可能作为溃疡性结肠炎炎症和氧化应激的调节剂，并有望成为一个有前景的治疗靶点。然而，仍需进一步研究以阐明其具体作用和潜在机制。总结 总之，本研究鉴定出 11 个与 SeMet 相关的基因在结肠结肠炎患者中显著上调，揭示了其与免疫细胞的关联。此外，鉴定出六个特征基因（WARS1、KYNU、GZMB、CHI3L1、PLAU 和 CASP4），并基于这些基因构建了一个高度准确的预测模型。其中，WARS1 在应对氧化应激时明显上调，其敲低导致炎症性细胞因子水平升高，凸显了其在溃疡性结肠炎发病机制中的关键作用。单细胞 RNA 测序表明，硒蛋白主要在上皮细胞中表达，可能保护上皮细胞免受氧化应激。这些发现为 UC 的早期诊断和潜在治疗目标提供了新的见解。。
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