|
该研究的流动如图 1 所示。在 GSE184050 和 GSE21321 数据集中，分别识别出 3552 和 4489 个 2 型糖尿病患者与健康对照组的 DEGs。在 GSE184050 数据集中的 3552 个 DEG 中，分别有 2526 个和 1026 个被上调和下调（ 图 2A）。此外，GSE21321 数据集中的 4489 个 DEG 中，分别有 2592 个和 1897 个被上调和下调（ 见图 2B）。这两个数据集的交集包含 738 个共同的 DEGs（ 图 2C），这些 DEG 对其进行了 KEGG 富集分析。结果显示，DEGs 主要富集于免疫相关通路，尤其是与 Th11、Th2 和 Th17 细胞分化相关的通路（ 见图 2D）。T2DM 的 DEGs。（A，B）GSE184050 和 GSE21321 中 DEGs 火山图（p3C 0.05）。（C）GSE184050 和 GSE21321 中共享 DEG 的维恩图。（D） 共享 DEG 的 KEGG 浓缩分析气泡图。在GSE56676 和 GSE42057 数据集中，COPD 患者与健康对照组分别识别出 4149 例和 3448 例 DEGs。在 GSE56676 数据集中的 4149 个 DEG 中，分别有 1267 个和 2822 个被上调和下调（图 3A）。此外，GSE42057 数据集中的 3448 个 DEG 中，分别有 1348 个和 2100 个被上调和下调（图 3B）。这两个数据集的交集包含 1391 个共享的 DEGs（见图 3C），这些 DEG 被进行了 KEGG 富集分析。与 T2DM DEG 的 KEGG 富集分析结果一致，COPDDEG 主要富集于免疫相关通路，尤其是与 Th11、Th2 和 Th17 细胞分化相关的通路（见图 3D）。慢性阻塞性肺病（COPD）的 DEGs。（A，B）GSE56676 和 GSE42057 中 DEGs 火山图（p3C 0.05）。（C）GSE56676 和 GSE42057 共享 DEG 的维恩图。（D） 共享 DEG 的 KEGG 浓缩分析结果气泡图。通过 WGCNA 识别了 T2DM 和 COPD 共享的 DEG 簇，并确定了组合模块与疾病特征之间的相关性。首先，为了确保生物学意义上的无尺度网络，基于 R2 尺度独立性> 0.85 和平均连接性收敛为 0、30 和 7，分别被选为 T2DM 和 COPD 数据集的最佳软阈值功率β（图 4A–D）。其次，在合并相似的基因模块后，T2DM 和 COPD 模型分别识别出五个和九个模块。灰色模与 T2DM 发生率的正相关最强（r=0.44），而棕色模组与 T2DM 发生率的负相关最强（r=-0.26）（见图 4E）。此外，在 COPD 建模集中，灰色模块与 COPD 的正相关最强（r=0.42），而粉色模块与 COPD 的负相关性最强（r=-0.35）（见图 4G）。这些模块可被视为与 T2DM 和 COPD 合并并发症密切相关的共表达基因模块。构建加权共表达网络相关数据集，并识别 T2DM（GSE18405）和 COPD（GSE56676）相关关键模块。（A，B） 针对各种软阈值（β）的网络拓扑分析。左图显示了无尺度拟合指数（尺度无关，纵轴）随软阈度（x 轴）变化;右图显示了软阈值功率（x 轴）的平均连通性（度，纵轴）。（C，D） 通过平均链状层级聚类获得的基因树轮图。树轮图下方的彩色行显示了通过动态砍树方法确定的模块分配。（E，G） 模块-性状关系：热图中的每一行对应一个 ME，每一列对应一个临床特征。每个单元格都包含对应的相关性和 p 值。（F，H） 对共表达基因模块中所有基因的 KEGG 富集分析：T2DM 的灰色和棕色，COPD 的灰色和粉色。T2DM 中灰色和棕色共表达基因模块以及 COPD 中灰色和粉色共表达基因模块中的所有基因都进行了 KEGG 富集分析。结果显示，无论是与 T2DM 还是 COPD 相关的 DEGs，主要富含与免疫相关的通路，尤其是与 Th1、Th2 和 Th17 细胞分化相关的通路，此外，除了关注细胞衰老（见图 4F，H），通过 GSVA 分析发现 T2DM 和 COPD 的细胞衰老评分均较低，因此作者关注免疫性。3.4. 2 型糖尿病和慢性阻塞性肺病（COPD）共享的 DEGs对 T2DM 和 COPD 共享基因的分析得到了 75 个 DEG（见图 5A），这些基因通过 R 中的 clusterProfiler 包进行了 Go 富集分析（见图 5B）。分析结果显示了 879 个 Go 词，包括 682 个生物过程（BPs）、101 个细胞成分（CCs）和 96 个分子功能（MFs）。核心基因主要富含 RNA 代谢过程，BPs 和 CCs 的核质，MFs 则在核酸结合中获得丰富。T2DM 和 COPD 的 DEG 分析（A）T2DM 和 COPD 共享 DEG 的维恩图。（B，C）Go 和 KEGG 富集分析 T2DM 和 COPD 共享 DEGs。75 个 DEG 还接受了 KEGG 通路分析，显示核心基因主要富含神经营养素信号通路、自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性、Th1 和 Th2 细胞分化及其他免疫相关通路（见图 5C）。总体而言，T2DM 和 COPD 在许多分子机制上有许多共同作用，其中大多数与免疫密切相关，主要包括 Th1、Th2 和 Th17 细胞分化。对与 T2DM 和 COPD 相关的 75 个核心基因进一步进行了 LASSO 回归、SVM-RFE 和射频分析，以筛查疾病相关诊断标志物。经过 10 重交叉验证，针对 T2DM 诊断，LASSO 回归、SVM-RFE 和 RF 分别识别出 11、21 和 16 个核心基因（见图 6A–D）。另一方面，在 COPD 诊断中，LASSO 回归、SVM-RFE 和 RF 分别识别出 23、54 和 38 个核心基因（见图 6E–H）。诊断 T2DM 和 COPD 的共同核心基因被视为 T2DM 与 COPD 合并并发症的诊断标志。LASSO 回归与 SVM-RFE 的交汇揭示，Pescadillo 核糖体生物合成因子 1（PES1）是诊断标记基因，而 RF 和 SVM-RFE 的交汇包括七个诊断标志，包括 Calnexin（CANX）、二羰基和 L-木糖糖还原酶（DCXR）、戊二酰辅酶 A 脱氢酶（GCDH）、NOP2 核仁蛋白（NOP2）、磷脂酰肌醇-5-磷酸 4-激酶 2 型β（PIP4K2B）、精瓜胺合酶（SRM）和硫酸酶修饰因子（SUMF2）（图 6I，J）。通过机器学习方法筛查 T2DM 和 COPD 的核心基因。（A，B） 通过 LASSO 回归算法识别的 T2DM GSE18405 诊断标志物。（C，D） 通过 SVM-RFE 和射频识别的 T2DM GSE18405 诊断标志物。通过 LASSO 回归算法识别 COPD GSE56676 的（E、F） 诊断标志物。（G，H）SVM-RFE 和射频识别的 COPD诊断 GSE18405 标志物。（一） 通过 LASSO 和 SVM-RFE 识别的 PES1 维恩图，该基因是 T2DM 和 COPD 的核心基因。（J） 通过射频和 SVM-RFE 识别的七个 T2DM 和 COPD 核心基因的维恩图，包括 CANX、DCXR、GCDH、NOP2、PIP4K2B、SRM 和 SUMF2。随后分析了这两个疾病数据集中这些基因的表达水平（见图 7A、B）。结果显示，T2DM 和 COPD 模型的基因表达水平与健康对照组不同。具体来说，T2DM 和 COPD 模型中的大多数诊断标志基因表达水平低于健康对照组。此外，诊断指标的 ROC 曲线在 R Studio 中绘制以确定其诊断值，显示筛查的八个诊断标志在疾病分类中表现出显著的诊断价值（见图 7C、D）。识别 T2DM 和 COPD 的核心基因。（A，B）PES1、CANX、DCXR、GCDH、NOP2、PIP4K2B、SRM 和 SUMF2 在 GSE18405 和 SUMF2 方面均有显著差异 GSE56676。（C，D） 八个核心基因的 ROC 曲线。（E） 对患者及健康对照组 PBMC 中 PES1、CANX、DCXR、GCDH、NOP2、PIP4K2B、SRM 和 SUMF2 的 mRNA 表达水平进行实时荧光定量 PCR 分析。此外，还采集了 65 名个体的新鲜全血样本（其中包括 25 名健康个体，其中 15 名来自 T2DM 患者和 15 名 COPD 患者，10 名 T2DM 患者与 COPD 患者联合）。随后提取 PBMCs 并使用 RT-qPCR 进一步确认患者样本中鉴定基因的差异表达。结果显示，PES1、CANX、SUMF2 和 DCXR 的表达趋势与上述预测一致，尤其是 SUMF2，不仅在 T2DM 和 COPD 患者中有所减少，且在有共病的患者中与健康对照组相比显著减少。与此同时，作者发现一个有趣的现象：除 NOP2 外，所有基因的表达水平在 COPD 患者中显著高于 T2DM 患者（图 7E）。根据 GSEA 结果，在 T2DM 中，除中央记忆 CD8 T 细胞、活化 CD4 T 细胞、1 型 T 辅助细胞、2 型 T 辅助细胞和浆细胞样树突状细胞外，两组间无其他免疫细胞数量有显著差异（见图 8A、C）。值得注意的是，大多数 COPD 组的免疫细胞含量高于对照组。具体来说，13/28 个免疫细胞（活化 CD8 T 细胞、中枢记忆 CD8 T 细胞、中枢记忆 CD4 T 细胞、1 型 T 辅助细胞、活化 B 细胞、未成熟 B 细胞、骨髓系来源抑制细胞、活化树突状细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、单核细胞和中性粒细胞）在两组之间表现出显著差异（图 8B，D ）。），其中中枢记忆 CD8 T 细胞和 1 型 T 辅助细胞的水平差异更为显著。同时，分析了免疫细胞与四个核心诊断基因之间的相关性，发现 PES1、CANX 和 SUMF2 表达与 T2DM 和 COPD 组大多数免疫细胞密切相关（见图 8E、F）。在同时患有 T2DM 和 COPD 的病例中，28 个免疫细胞和 4 个核心基因的相关分析。（A，B）28 个免疫细胞表达评分热图，适用于 T2DM 和 COPD。（C，D） 比较 Ctrl 和 T2DM 样本中 28 个免疫细胞评分，以及 Ctrl 和 COPD 样本。（E，F） 对 2 型糖尿病患者和 COPD 患者中 4 个共同核心基因与 28 个免疫细胞的 Spearman 相关分析（*p <0.05 和**p，***p <0.01 对对照组）。3.7. 单细胞转录组数据中共享 DEGs 的表达水平首先，从 NCBI GEO 数据库下载了 T2DM 和 COPD 单细胞测序数据集，均为小鼠样本，GSE216886 T2DM 和 COPD的 GSE205078。随后进行了归一化、尺度调整、聚类及高度变异基因筛选。随后，基于这 2000 个高度变异基因的 umap 生成了一个降维聚类二维图谱（图 9A 、B）。还生成了 T2DM 和 COPD 共享的四个 DEG 细胞簇表达图谱（图 9C–F）。此外，Kruskal-Wallis 检测还验证了不同免疫细胞中 T2DM 和 COPD 共有的 DEG 表达水平，尽管 SUMF2 在免疫细胞中表达较低，但结合图 7E 的 RT-qPCR 数据与 COPD 患者结合，发现与健康个体相比， 仅 SUMF2 的表达水平在统计学上存在差异（见图 9G）。SUMF2 在 COPD 和 T2DM 组的 T 细胞中均被下调（见图 9H），这与作者以往所有人类血液验证结果一致。分析小鼠单细胞转录组数据集（GSE216886、GSE212726 和 GSE205078）中 PES1、CANX、SUMF2 和 DCXR 的表达水平。（A， B） 在三组单细胞转录组数据集中识别出的 11 种主要细胞类型的 t 分布随机邻居嵌入（t-SNE）。（C–F）PES1、CANX、SUMF2 和 DCXR 表达的 t-SNE 图谱。（G） 气泡图显示不同细胞类型中 PES1、CANX、SUMF2 和 DCXR 的表达。每个点的大小代表表达式的百分比;平均表达用颜色表示。（H） 单细胞转录组数据，显示 CANX 在 T2DM 和 COPD 中 11 种主要免疫细胞类型中的表达。 总结 据作者所知，这是首个利用生物信息学分析探讨 T2DM 和 COPD 的共同通路及遗传诊断标志的研究。作者的研究结果表明，T 细胞相关通路可能与 T2DM 和 COPD 的发病机制相关，SUMF2 是 T2DM 与 COPD 联合的潜在诊断标志。此外，作者的免疫浸润相关分析显示，T2DM 和 COPD 的发病机制可能与先天免疫失衡密切相关。总体而言，本研究为探讨 T2DM 与 COPD 合并发病机制提供了新颖视角。尽管如此，仍需更多涉及体外和体内实验的研究，以进一步探讨 T 细胞相关通路及 SUMF2 表达变化的机制。
|
