2009年．第1期知识介绍49
绿色荧光蛋白的发现与发展
——2008年诺贝尔化学奖简介
朱杰1。吴平2
(1．晋元高级中学，上海200333；2．桃浦中学，上海200331)
文章编号：1005—6629(2()09)Ol—0049—04中图分类号：G633．8文献标识码：B
生物发光是一个很普遍的生物学现象。早期的
生物研究大多涉及分类、形成和生态方面，后来重
点转移到生态、生化的研究，目前已进入分子生物
学的研究水平。从不同生物体内提取的荧光蛋白的
结构、性质不尽相同。迄今。腔肠动物门多管水母
属的维多利亚多管水母(aequoreavictoria)的发光蛋
白系统研究得较为深入。
多管水母体内存在着两种发光蛋白，即光蛋
白——水母素(aequorin)和绿色荧光蛋白(GFP，
greenfluorescentprotein)。光蛋白作为分子标记及
Caz+的生物学指示剂．已被成功地应用于哺乳动
物、植物、酵母、大肠杆菌细胞．用于检测很多重
要的生理学和病理学反应。GFP作为良好的细胞、
发育、分子生物学的活体标记。用于监测各种体系
中的基因表达、蛋白定位以及多种细胞活动。利用
GFP进行示踪的研究范围相当广泛．从细胞生物学
的基础研究如细胞骨架和细胞分化、细胞器动力学
和囊泡跟踪．到一些热门的前沿和学科和技术领
域，如器官移植、基因治疗、神经生物学等等。
日本科学家下村修(0samuShimomura)、美国科
学家马丁·沙尔菲(ManinChalfie)和美籍华裔科学
家钱永健(RogerY．Tsien)因在发现和研究绿色荧
光蛋白方面做出贡献而分享了2008年的诺贝尔化学
奖。他们的工作不但在科学上对化学、生物学、医
学等领域具有重要的意义．而且也与人们的日常生
活密切相关。对于提高人类的生活品质以及进一步
改善人类的健康有十分重要的意义。
圈12008年诺贝尔化学奖获奖者．从左至右依次为：
下村修、沙尔菲、钱永健
{图片来源：http：^『nobeIpnze．o呲hemistry／Iau怕ales，
2008^nde×．htmIl
1研究GFP的时间线索
GFP从最初被发现到今天广为应用，经历了半
个多世纪的时间。首先简单回顾一下这半个多世纪
内和GFP相关的主要事件。
1955年人们首次注意到水母体内的绿色荧光
物质。
1962年下村修从维多利亚多管水母中提取并
分离了GFP，证实了绿色荧光物质是～种蛋白质。
它的溶液在日光下略呈绿色。在白炽灯下略显黄
色，而在紫外灯下则发出强烈的绿色荧光。
1969年之前称为绿色蛋白质(greenprotein)
得名“绿色荧光蛋白”。
1974年研究发现光蛋白和GFP两种分子之间
会发生能量转移(图2)。
o
圈2能量在光蛋白和GFP之问转移图3GFP中的生色基团结构
1979年下村修找到了GFP中的生色基团
(Chromophore)(图3，图5)。
1985年普腊石(Dougl鹬Pr鹪her)根据蛋白质
的氨基酸顺序拿到了光蛋白(水母素)的基因。
1992年普腊石拿到了GFP的基因。
1993年GFP中生色基团的结构被确认。
1994年沙尔菲通过大肠杆菌和线虫研究获得
了GFP的生色机理；是年，第一种蓝色荧光蛋白被
报道，并提到了它可用于荧光共振能量转移(FRET)
实验中。
1995年研制出了增强型绿色荧光蛋白
(EGFP)，它的转录速度比野生GFP快四倍。
1996年得到了野生GFP和EGFP的晶体结构。
万方数据
化学教学2009年，第l期
钱永健在EGFP的基础上。利用突变技术，设计并
研制出黄色荧光蛋白。
1997年光蛋白和GFP被用于Ca2+的敏感指示
剂。
1999年后各种各样的荧光蛋白被发明、改造
并用于科学研究。
在研究GFP的50多年间．2008年诺贝尔化学奖
的三位得主做出了至关重要的贡献。
2下村修与维多利亚水母
在下村修以前就有人研究过生物发光现象，例
如萤火虫发出荧光，是由荧光酶(1ucifemse)作为酶
催化氧化底物分子荧光素(1uciferin)以后产生荧光。
而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修的研
究。
1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生
理学杂志》上报道，他们分离纯化了维多利亚多管
水母中的发光蛋白一水母素。据说下村修用水母提
取发光蛋白时。有天下班前，他将产物倒进水池
里。临出门前关灯，回望了一眼水池，见到水池闪
闪发光。因为水池也排放有养鱼缸的水，他怀疑是
鱼缸成分影响了光蛋白。然而不久之后，他便确定
钙离子能增强光蛋白发光。
1963年．他和另一位研究者约翰森在《科学》
杂志报道钙和光蛋白发光的关系。其后Ridgway和
Ashlev提出可以用光蛋白来检测钙浓度，创造了检
测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分
子．光蛋白成为第一个有空间分辨能力的钙检测方
法．是目前仍用的方法之一。
其实早在1955年，Davenport和Nicol就发现水
母可以发出绿光．但不知其囚。在1962年下村修和
约翰森在那篇纯化光蛋白的文章中，有个注脚，说
还发现了另一种蛋白，它在日光下略呈绿色，在白
炽灯下略显黄色。而在紫外灯下则发出强烈的绿色
荧光。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，
通过纯化他们得到了这种蛋白，当时称之为绿色蛋
白，即现在所谓的称绿色荧光蛋白。Morin和
Hastings提出光蛋白和GFP之间可以发生能量转移。
光蛋白在钙刺激下会发光．其能量可转移到GFP，刺
激GFP发光(图2)。
GFP是一种酸性球状蛋白质，它的发射光谱在
505nm具有吸收峰：激发光谱则在395nm和470
nm具有吸收高峰(图4)。
只有完整的GFP分子才会产生生物荧光，但与
荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为
生色基团的部位。在GFP的初级氨基酸序列上，第
65个至第67个氨基酸(Se卜Ty卜Glv)形成环状六肽
三体，以共价键与GFP蛋白肽键骨架相连(图5)。
生色基团形成的机理目前尚不清楚，但在有分子氧
存在的条件下。酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸，并环化
形成六肽．这可能是形成色基的必然过程。下村修
最先推导了水母GFP色基结构，后来又进行了进一
步验证与修改。
图4从多管水母中提取的野生图5GFP中第65个至第67个
GFP的荧光激发(实践)和发射氨基酸形成的生色基团
(虚线)光谱
下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣，也没
有意识到应用的蕈要性。但他的研究却切切实实地
对之后的生物科学起到了革命性的作用。当他离开
普林斯顿到WoodsHole海洋研究所后，他的同事普
腊石(DouglasPrasher)对生物示踪分子非常感兴趣。
1985年普腊石和日裔科学家SatoshiInouye独立根据
蛋白质顺序拿到了光蛋白的基因(准确地说是
cDNA)。1992年，普腊石拿到了GFP的基因。有了
cDNA，一般生物学研究者就能很好地应用它。比
使用蛋白质更为方便。
1996年．GFP的晶体结构也被研究得到。它是
一个由11个B一折叠的蛋白质以一个a一螺旋蛋白质
为中心轴所形成的笼状圆柱体．生色基团是仅一螺
旋蛋白质的重要组成部分。它的位置非常接近这个
笼状圆柱体的中心位置(图6)。另一种平面的GFP
表示方式如图7，其中绿色的代表B一折叠，红色的
代表d一螺旋。
幽6GFP的三级结构图7GFP结构的另一种表达方式
3沙尔菲将GFP应用于生物示踪
将GFP表达到其他生物体这项工作，1994年由
两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的
沙尔菲实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海
洋研究所的两位日裔科学家Inouve和Tsuji。
沙尔菲在之前的工作中一直和Caenorhabditis
elegans(一种被广泛用于生物研究的线虫)打交道。
C．elegans这种线虫只有959个细胞的一个脑，并且
万方数据
2009年．第1期知识介绍51
其三分之一的基因和人类基因有关。更重要的是，
C．ele鼬ns是透明的，研究人员可以很方便的应用
显微镜对其进行观察研究。
1988年当沙尔菲得知GFP后。他意识到可以使
用这一工具对C．elegans进行研究，它可以作为变
化的绿色信号对线虫不同细胞闻的活动送行示踪观
察。他将CFP基因与其他不同基因结合成可发出荧
光的蛋白质的想法付诸于实践后，就能观察到细胞
中不同蛋白质的形成。
沙尔菲使用DNA技术，将GFP的基因作为一个
片段注射到成熟的线虫的性腺细胞核中(图7A)，
由于线虫是雌雄同体。它可以使自已受精。GFP基
因就出现在它的卵中(图7B)，这些卵分裂后形成新
的细胞核在紫外光照射下可发出荧光(图7C和D)，
图7E中显示了两个这样的细胞核。
图8沙尔菲的买验过程
光蛋白和GFP都有重要的应用．但光蛋白是荧
光酶的一种。它需要荧光素才能发光，而GFP蛋白
质本身即能发光，在原理上有重大突破。在上世纪
90年代。科学家一般认为荧光物质在细胞中是通过
许多步骤得到。每一步都需要蛋白质来控制，并且
此过程需要一些特殊的蛋白质(荧光素)来产生
GFP中的生色基团。但沙尔菲用实验证实了这个假
设是错误的。沙尔菲的研究向人们展示了绿色荧光
蛋白作为发光的示踪分子的作用。
当时沙尔菲的论文引起了巨大轰动，很多生物
学研究者纷纷将GFP引入自己的系统。在一个新系
统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章，
其实不过是跟风性质，没有原创性。
将GFP用作示踪分子。具有以下优点：①荧光
稳定；②检测方便；③无种属特异性，也没有细胞
种类和位置的限制；(DGFP对受体细胞基本无毒
害；⑤由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出
现假阳性结果；⑥不需任何反应底物和辅助因子；
⑦可制成永久标本；⑧灵敏度高。
尽管GFP作为报告基因或示踪分子有许多优
点，但野生GFP发出的荧光较弱。其次，荧光反应
不是酶反应．不能通过添加某些物质来加强信号，
且不易对荧光进行定量检测。另一方蟊，GFP基因
在植物细胞内的表现频率并不高，甚至在某些植物
细胞中并不表现。所以有更多的科学家对GFP进行
了改进。
从1961年到1974年。下村修和约翰森的研究遥
遥领先．而很少被人注意。在1974年以后，特别是
八十年代后的后继工作．很多研究生都能够完成。
其中例外的是钱永健所在实验室所发现的变种出现
新颜色，这一发现却非显而易见。
4钱永健改造并发展了GFP的应用
随着生物信息学、定点突变，DNA—shuming等
一系列理论和技术的应用。绿色荧光蛋白的家族成
员不断扩大，出现荧光光谱、温度敏感性等改变的
多种变异型。具有不同光谱特性的GFP突变体的获
得拓宽了GFP的应用范围，解决了许多单独运用
GFP不能解决的问题。GFP基因的改进目前主要通
过以下几个途径得到突变体GFP：①更换GFP生色
团氨基酸；②改变碱基组成；③除去GFP基因中隐
蔽剪接位点；④插入植物内含子；⑤更换强启动子
等突变体GFP；⑥增加荧光强度和热稳定性。
目前已有的具不同光谱的突变型有EBFP(增强
型蓝色荧光蛋白)、ECFP(增强型青色荧光蛋白)、
EGFP(增强型绿色荧光蛋白)幂HEVFP(增强型黄色
荧光蛋自)，分别呈现蓝、青、绿、黄四种颜色。至
今所获得突变型的最大发射波长为529nm，为黄绿
色荧光。
钱永健是；}疆下村修研究相关的一位重要科学
家。从八十年代一开始．他的工作就非常引人瞩
目。同时他十分肯定下村修的工作，较早公开介绍
下村修的发现。在他的研究工作中，有两项重要工
作都与下村修有一定联系。
一项是研究钙染料。1980年钱永健发明检测
Ca2+浓度的染料分子。1981年改进了将染料引入细
胞的方法，以后发明了更多、更好的染料，被广泛
地应用。检测钙的方法有三种：选择性电极、光蛋
白、钙染料。在钱永健研制的钙染料没有出现以
前，具有空间检测能力的只有光蛋白，但当时光蛋
白需要注射到细胞内，应用不方便。钱永健的钙染
料可以通透裂细胞里面去。
钱永健的第二项工作是研究GFP。1994年起。
钱永健开始研究并改造GFP，并获得了多项发现。
世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种。
改造后的GFP促进了生色基团的折叠。改善了其荧
光特性，甚至可以得到红色、黄绿色、蓝色等多种
颜色的荧光蛋白，有的可激活、可变色，大大拓宽
万方数据
52化学教学2009年．第1期
了CFP研究的领域。他被公认为这方面的先驱。
钱永健对人们理解GFP及GFP族的化学荧光特
性做出了重要的贡献．他使不同的GFP产生的荧光
颜色覆盖了整个可见光谱。同时他改善了生色基
团，增强了GFP的荧光效应，也使荧光的稳定性增
强。他发展了GFP，使之成为极有效的研究动态生
命过程的基因标记工具。
5结束语
科学上一个偶然的发现往往会引起巨大的科学
革命。新工具的出现会使研究取得意想不到的新成
果。当年下村修研究了GFP，但他并没有意识到
GFP重要的应用前景。沙尔菲恰恰在自己的实验研
究过程中采用了最新的GFP研究成果，并发展了
GFP的应用领域。而当今世界上用的GFP大多数是
钱永健实验室改造后的变种。
获得2008年诺贝尔化学奖的三位科学家在发现
和研究GFP的过程中各有贡献．而且可以看出他们
的研究是一脉相承的。随着分子生物学理论与技术
的发展。对GFP研究的进一步深入，GFP在分子生
物学领域的应用进一步加强。GFP工程，包括GFP
蛋白工程和GFP基因工程，尤其GFP基因作为新型
报告基因越来越受到关注。当然在应用GFP作为研
究工具时，也遇到了一些问题。例如将GFP作为选
择标记基因成功构建多种表达外源基因的重组质粒
时发现一些因素影响着GFP的检测。此外。在细胞
生物学的研究过程中发现新生GFP通过折叠和加工
成为具有活性的形式过程十分缓慢。但随着生物技
术的发展．对GFP的基础理论研究的进一步深入和
新型突变体的不断出现．有理由相信这些问题终将
会得到解决。从而使GFP更好地为科学研究服务。
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htIllfEB／oL]．2()08—10—10．
三聚氰胺一食品与饲料加工中的非法添加剂
石海信
(钦州学院生化系，广西钦州535000)
摘要：概述了三聚氰胺的理化性质、合成工艺路线、生物学毒性及检测方法。
关键词：三聚氰胺；理化性质；合成方法；生物学毒性；检测
文章编号：1005—6629(2009)0l一0052一03中图分类号：0626文献标识码：E
2007年3月，美国食品药物管理局(FDA)在对连
续死亡猫狗的调查中发现．导致宠物死亡的罪魁祸
首，是作为宠物饲料的小麦蛋白粉和大米蛋白浓缩
物里含有的一种名为三聚氰胺的化学物质。这种物
质对人体和动物的危害尚未被完全认知。但已知的
是，“如长期和反复接触作用．该物质可能对肾发生
作用”l”。
2008年中国婴幼儿奶粉污染事件再次将三聚氰
胺的毒性引入公众视野。由于不法分子为增加原料
奶或奶粉的蛋白含量而人为加入部分批次的三鹿牌
婴幼儿奶粉中。结果导致甘肃等地发生多起婴幼儿
泌尿系统结石病例。
本文就三聚氰胺的理化性质、合成工艺、生物
学毒性及检测方法作一综述。
1三聚氰胺(MeIamine)的理化性质
三聚氰胺，又名蜜胺，氰脲酰胺。三聚氰酰
胺。化学名称为2，4，6一三氨基一l，3，5一三嗪．分子式
为C3H“6或C，N3(NH2)3，相对分子质量为126．13，是
一种白色单斜晶体，密度(20℃)1．573咖m3，熔点
354cc，沸点升华；低毒，不可燃嘲，微溶于水，无味，
溶解度随温度升高而逐渐上升．溶液呈弱碱性。三
聚氰胺在二乙醇胺、三乙醇胺、甘油、热乙二醇中
具有一定溶解度，但不溶于醚、苯和四氯化碳，可
与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等形成盐。在中
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