3．微粒子化学发光免疫分析(microparticlechemiluminescenceimmunoassay，MLIA)
以顺磁性微粒作为载体包被抗体，利用磁性微粒能被磁场吸引，在磁力的作用下发生力学移动的特性，迅速捕捉到被测抗原。加入碱性磷酸
酶标记的第二抗体，形成磁性微粒包被抗体-抗原-酶标记抗体复合物经洗涤去掉未结合的抗体后，加入ALP的发光底物AMPDD，AM
PDD被复合物上ALP催化发光,发射光所释放的光子能量被光量子阅读系统记录，通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗
原的浓度。原理:AMPDD一侧的芳香基团上的磷酸酯被水解，失去一个磷酸基而生成一个中等稳定的中间体AMPPD(半衰期2
～30min)，此中间体通过内部电子转移而裂解为一分子的金刚烷酮和一分子激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当回到基态时发出波长为470
nm的光)常用标记物:ALP反应特点:①可采用竞争法和夹心法,多采用双抗体夹心法②采用磁性微粒作为固相载体，
以碱性磷酸酶作为标记物，固相载体的应用扩大了测定的范围,检测水平可茯Pg·mL-1，重复性好。五、相关仪器介绍ADVIAC
ENTAUR全自动免疫分析仪(一)ADVIACENTAUR检测原理利用化学发光和磁性微粒子分离技术相结合的测定方
法，用高敏感性的吖啶酯作为化学发光标记物，以极细的磁性颗粒(PMP)作为固相载体，提供最大的包被面积。1．液相吖啶酯(AE)
。2．固相氧化铁(Fe2O3)。包被面积大,减少了扩散时间,增加了捕获效率(二)ADVIACENTAUR的反应
类型1．双抗体夹心法2．竞争法包括AE标记抗原法和AE标记抗体法。第十一章化学发光和荧光
免疫技术及仪器第一节化学发光免疫分析技术第二节电化学发光免疫分析第三节时间分辨荧光免疫分析法第四节荧光偏振免疫分
析法第五节化学发光免疫分析的临床应用内容概述:教学目标和要求掌握化学发光免疫分析技术的基本原理、反应的底
物和标记方法以及反应类型。熟悉电化学发光免疫分析的基本原理和标记物，时间分辨荧光免疫分析法的基本原理及其标记物和螯合物。
了解荧光偏振免疫分析法的基本原理和技术特点，化学发光免疫分析的临床应用
第一节化学发光免疫分析技术基本原理反应的底物标记方法反应类型相关仪器一、基本原理化
学发光，是指伴随化学反应过程所产生的发光的发射现象。某些物质在进行化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应物分子形成电子
激发态，当电子从激发态返回到稳定的基态时，多余的能量就以光子的形式发射出来。这一现象称为化学发光。A+BC
+D,CC+h?(一)产生化学发光反应的条件和过程化学发光与荧光的区别:化学能
光能化学发光反应的条件:反应必须提供足够的激发能焓变(△H)介于170～300kj·mol-1之间，才能在可见光
范围观察到化学发光现象吸收了化学能后处于激发态的分子或原子，必须以光子形式将能量释放出来，或者将能量转移到另一种物质的分子上
并使该分子激发，当被激发的分子回到基态时，也以光子的形式释放能量(二)化学发光效率化学发光反应的发光效率(φCl)又称为化学
发光总能量的产生率φCl取决于生成激发态产物分子的化学激发效率(φCE)和激发态产物分子的发射效率(φEM)。
一般化学发光反应，φCl值约为10-6(三)强度与反应物质浓度之间的关系反应物的浓度反应速度化学发光反应所发出的光的
强度(四)化学发光的反应类型直接化学发光间接化学发光1．直接化学发光化学反应释放的化学能激发的是反应产物分子
A+BC+D,CC+h?2．间接化学发光(敏化的化学发光)
在化学反应中，激发能传递到另一个未参加化学反应的分子上，使该分子达到电子激发态，再由激发态分子返回到基态时发光；或反应
首先生成一种高能量的中间体，此中间体再将能量转移给另一个未参加化学反应的分子，使该分子达到电子激发态，再由激发态分子跃迁回到基态时
发光的过程。A+BC+D,C+FF+E,F
F+h?二、反应的底物(发光剂或发光底物)在化学发光反应中，参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能
量的化合物发光免疫技术中常用的化学发光底物:１．氨基苯二酰肼类主要有鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼，luminol)和异鲁米
诺(5-氨基苯二甲酰肼，isolumino1)及其衍生物。2．眯唑类化合物较常用的是2，4，6-三苯基咪唑，即洛粉碱(lop
hine)。3．吖啶酯类典型代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸酯，即光泽精(1ucigenin)。4．苯酚类化合物其中主要有邻
苯三酚，即焦性没食子酸。5．芳香草酸酯类主要有双-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和双-(2，4-二硝基苯基)-
草酸酯(DNPO)。6．(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物三、标记方法化学标记生物标记化学标记
:用于化学发光(酶)免疫测定直接用发光物质(如鲁米诺、吖啶酯类等)标记抗体或抗原以催化剂(如HRP、GOD等)和／或协
同因子(如ATP、NAD等)标记抗体或抗原按照标记物的应用:按照被标记物的结构或性质:对小分子物质(如甾体激素、药物等)
的标记对大分子抗原、抗体的标记(如蛋白质、核酸等)以及对某些配基和载体的标记按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点:
直接偶联间接偶联通过偶联反应，使标记物分子中的反应基团直接连接在被标记分子的反应基团上。在标记物与被标记物之
间插入一条链或一个基团，使两种物质通过这种引入的“桥”连结成结合物碳二亚胺缩合法、过碘酸盐氧化法、重氮盐偶联法和混合酸酐法琥
珀酰亚胺活化法、O-(羧甲基)羟胺法、异硫氰酸酯衍生物和戊二醛法常用的标记方法1．碳二亚胺（EDC）缩合法此法
可用于蛋白质分子中的游离羧基或游离氨基的标记。常用的缩合剂有l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和二环己基碳二亚
胺(DCC)直接偶联2．重氮盐偶联法(又称重氮化法)此法简易、成本低、重复性好，但不适用于脂肪伯胺基发光剂
，因其生成的重氮盐不稳定，即使在０℃也会生成氮气。此外，ABEI等伯胺基位于侧链者也不适用此法。芳香伯胺直接偶联3．过
碘酸盐氧化法标记物可用发光剂或催化剂，适用于芳香伯胺或脂肪伯胺发光剂，标记方法稳定标记物不易脱落，但此法不适用于无糖基
的蛋白质和含有糖基但氧化后会影响免疫学活性的蛋白质。直接偶联4．戊二醛法间接偶联芳香伯胺基
氨基由于戊二醛在溶液中以单体和聚合体形式存在，后者占多数，所以在标记反应中双方分子间构成较大的距离，减少了在抗原抗体反
应时的空间位阻；但因偶联不易定量控制且缺乏特异性等而未得到广泛应用双功能偶联剂5．琥珀酸酐法(环内酸酐法)间接偶联
此法没有双功能交联剂的不良反应，能实现标记物和蛋白质分子间的单向定量缩合，标记效率高，已有商品化试剂供应。6．异硫氰酸酯
衍生物法此法标记温和、稳定，获得的标记物不易脱落，且不损失蛋白质等的生物活性发光标记物标记物间接偶联7．
O-(羧甲基)羟胺法O--羧甲基衍生物8．混合酸酐法四、反应类型化学发光免疫分析化学发光酶免疫分析微粒子
化学发光免疫分析根据发光免疫分析中发光反应的不同体系和标记方法不同1.化学发光免疫分析(chemiluminescence
immunoassay，CLIA)用化学发光剂直接标记抗原或抗体,免疫反应后生成标记的免疫复合物,通过启动发光试剂
(NaOH-H2O2)作用于AE而发光，发光强度依赖于免疫反应物中化学发光剂的浓度。原理:常用化学发光剂:吖啶酯(acrid
iniumester，AE)类化合物反应特点:CLIA检测小分子抗原采用竞争法；大分子抗原则采用夹心法。与大分子的结合不
会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。强烈的直接发光在1s内完成，为快速的闪烁发光。应用:1)直接化学发光使用吖
啶酯(AE)作为标记物，无需附加催化剂。AE氧化直接发光，氧化反应在430nm处快速发光并在1s内达到峰值。发光强度是I125在
1min内发光强度的十万倍，因此系统该具有高速度、产光强等特点。2)AE有甲基，增加了试剂的稳定性，使试剂的稳定性好，有
效期更长。3)AE作为化学发光标记物，对温度及pH等外界环境的变化不敏感，故其具有很高的精密度。4)AE相对分
子质量水常小(MW：481)，使其对结合反应的空间位阻作用减少，增加扩散率，提高了灵敏度，可达l0-15mol·L-1。
5)AE是以共价键结合抗体而不影响抗体结合抗原的反应，故不影响发光。6)AE加碱后，发光是在一暗盒中进行，其光量值与浓度
有着良好的线性关系，且本底较低。吖啶酯的特点2．化学发光酶免疫分析(chemiluminescentenzymeimmn
unoassay，CLEIA)采用参与发光效应的酶作为标记物标记抗体或抗原，免疫反应后形成酶标记抗原抗体复合物，利用鲁米诺作为发光底物在酶和启动发光试剂(NaOH-H2O2)的催化下，产生发光反应，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。原理:底物产物发光Ag+AbAg-Ab常用标记物:辣根过氧化物酶(HRP)或ALP反应特点:①标记物常标记抗体；②标记物作为发光反应的催化剂，本身不发光。 |
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