液相色谱基础
HPLC基本知识介绍
?蒸馏
?离心
?电泳
?过滤
?超滤
?色谱
常见的分离方式
色谱法简介
?色谱法(Chromatography)溯源
-Tswett应用吸附原理分离植物色素的新方法
?1906年正式命名(见诸文献)
?30年代开始广泛研究和应用
?高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱分离的机理
分离是一个
物理的过程。
固定相(StationaryPhase)
流动相(MobilePhase)
样品(溶解于流动相中的溶质)
什么是液相色谱？
色谱
液相色谱
柱色谱
纸色谱
薄层色谱
高效液相色谱
HPLC
气相色谱
?HPLC(HighPerformanceLiquid
Chromatography)—高效液相色谱法
?是一种区别于经典液相色谱,基于仪器
方法的高效能分离手段:
高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器…
?广泛应用于各个领域:
医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业…
?无,理,是应用
于段
什么是高效液相色谱(HPLC)？
HPLC的仪器配置及流程
色谱泵器
理
样器
色谱柱
检测器
Waters486
HPLC的的图形图形图形结果结果
----色谱图(Chromatogram)Chromatogram)
色谱:色谱柱流物过检测器生的应
的,?￠￡度,??￠保￥.
?色谱§
(分)
基
currency1
§高
§''
应
“
应
“
应
“
应
“
液相色谱图相关术语(1)
?色谱相??:
?色谱§(Peak):色谱柱流?分?分过检测器生
的应的fi分
?§fl(PeakBase):§的–??–·?的?
?§高(PeakHeight):§??“”§fl的?离
?§''(PeakWidth):§…‰–??§
fl相`…–·的?离
?′(高)§''(PeakWidthatHalfHeight):过§
高的中–???于§fl的?,?§…‰
相`…–·的?离
液相色谱图相关术语(2)
?色谱相??:
?§ˉ?(PeakArea):§?§fl·的ˉ?,˙¨
应“
????()(StandardError):0.607?§高
应§''的一′
??ˇ§(TailingPeak):—?的¨§
?§(LeadingPeak):—?的¨§
?§(GhostPeak):样生的§,¨§
液相色谱图相关术语(3)
?色谱相??:
?基(Baseline):??a,流动相
生的应的
?基(BaselineDrift):基定?的
??化
?基o((N)N)(BaselineNoise):各种素
的基动
?谱?(BandBroadening):于??,质
?素的,??分色谱柱?动
过程中谱''度??的
液相色谱图相关术语(4)
?色谱相??:
?((tt
0
)(Deadtime):固定相滞￥的?分,
从样”§??“需的
?保￥((tt
R
)(Retentiontime):?分从样”
§??“需的
?体?((VV
0
)(Deadvolume):固定相滞￥的?分,
从样”§??“需的流动相体?
?保￥体?((VV
R
)(Retentionvolume):?分从样”
§??“需的流动相体?
液相色谱的应用（一）
?“分析型液相色谱”
?定性定量分析
?灵敏度的要求
?样品的复杂性
?样品量的要求
?精度确度的要求
?容易?用
液相色谱的应用（二）
?“备型液相色谱”
?分离纯化
?化合物的稳定性
?样品的复杂性
?备量的要求
?纯度的要求，纯度的鉴定
?方法的安全性
开发液相色谱方法
?液相色谱实验需的基本参:
?流动相:种类配比(度或梯度)
?固定相:色谱柱类型?径,长短
?流动相输送系统参:流速
?检测器参:检测长,灵敏度
?温度
?样量
以参即构成一个具体的HPLC方法,¨色谱?
评价液相色谱方法的标准
问题∶什么样的分离结果是好的?分辨率?
什么是色谱的分辨率？
分辨率的公式：
)(
2
1
12
12
WW
VV
R
+
?
=
影响分辨率的因素：K’,α,,NN
?分辨率的方程∶
?k‘是容量子，表达了分离?分?柱填料
的?用￡弱。
?α是选择性系，描述…个?分分离的好坏
程度。是化学素。
?N是理塔板，描述色谱§的谱''程
度。
Gf7
Gf7
Gf8
Gf6
Ge7
Ge7
Ge8
Ge6
Gf7
Gf8
Gf6
Ge7
Ge8
Ge6
?
Gf7
Gf8
Gf6
Ge7
Ge8
Ge6
+
=
4
1
1''
''N
k
k
R
α
α
色谱柱的柱效NN
理论塔板数计算公式：
Wσ方法
W
tan
16法
W
h
5.54′§高
W
3σ
93σ
W
4σ
164σ
W
5σ
255σ
2
1
Gf7
Gf8
Gf6
Ge7
Ge8
Ge6
=
W
V
Nσ
容量因子kk′′′
?改?k''“的方法∶
?调节流动相的极性、pH、离子￡度
?梯度淋洗
与峰高的关系与R的关系
选择性系数α
?定义∶
?α=1…?分分开，
?改?α的途径
?改?固定相
?改?流动相
?改?温度
?改?样品的本身性质
1
2
01
02
''
''
k
k
tt
tt
R
R
=
?
?
=α
α
α1?
∝R
αα，，k''，N∶分辨率分辨率?
开发液相色谱方法的因素
?分辨率是色谱分离中主要考虑的素
?除分辨率·外,开色谱方法,以a几
个素也都要考虑:
?灵敏度
?载样量
?分析速度
?溶剂损耗
?成本
?容易?用
?色谱柱命
?效率
色谱图常见
?色谱问题主要…类:
?色谱§§问题
?§,''§,§,§,§¨
?色谱§保￥问题
?保￥稳定
色谱图常见分(一)
?色谱§§问题:
?色谱中§:
?样问题:样或样品分解
?流动相问题:泵输液或流动相确
?检测器确,或检测器问题
?一个或几个§是§
?流动相吸本fl高
?样过程中了气
?离子分离中的系统§
?样品?分的吸(RI或UV)于流动相
色谱图常见分(一)()
?色谱§§问题:
?的§￠§:
?电?或检测器输极性
?学达”?
?的§都是''§
?系统?或达”化学?
?溶样的溶剂比流动相￡
?色谱柱类型或确
?色谱柱或保柱或?
?温度?化色谱柱的
色谱图常见分(一)()
?色谱§§问题:
?￠洗￡的§?''§
?样体?过?或样品￥度?高
?样器问题,定量环(Loop)?§合currency1
?过滤器,保柱,色谱柱或''“??
?''“问题:?径或''确
?''“?问题:??或fifl确
?检测器确
色谱图常见分(一)()
?色谱§§问题:
?§比–的要§
?样品?度过?
?样器问题或样体??
?检测器确,定量环(Loop)体?确
?检测器输·
?用了确的检测器输
?检测
?检测器的??能问题
色谱图常见分(一)()
?色谱§§问题:
?§或§
?样量或样品￥度过?
?保柱或色谱柱???
?保柱或色谱柱或?效
?§
?样量或样品￥度过?
?溶样的溶剂相于流动相?￡
?保柱或色谱柱或?效
色谱图常见分(一)()
?色谱§§问题:
??ˇ§
?保柱或色谱柱问题:或?效
?样问题
?检测器确
???§
?检测器确
?样体???或样品￥度?高
?色谱§保￥问题:
?保￥”定(各?…?·)
?系统稳定或达化学?
?泵‰?稳(泵?气?)
?样体?过?或样品￥度过?
?温度动
?流动相合`
?色谱柱
色谱图常见分(二)
?色谱§保￥问题:
?保￥??或′?(各?…?·)
?系统稳定或化学??
?泵流速?化
?温度?化
?色谱柱,柱效a
?流动相
?溶剂ˉ?过滤器?或''“??
?系统?˙
色谱图常见分(二)()
色谱图常见分(二)()
?色谱§保￥问题:
?保￥改?”一个新的¨定“
?流动相确或?成确
?泵流速?化
?实输液的流速确(泵?灵或??)
?环温度?化?柱温确
?色谱柱或类型确
?色谱柱
?流动相?稳定剂或稳定剂生?化
?输液系统的梯度滞—体?确
液相色谱基础(一)
?色谱分析的基本原理是什么ˇ
?—“固定相”“流动相”ˇ
?—样品都能用液相色谱法分析ˇ
?一高效液相色谱系统基本
?成ˇ
?—保￥ˇ—测定ˇ
?色谱§,一定是仪器问题ˇ
?色谱§§好,一定是仪器问题ˇ
液相色谱基础(二)
?色谱分辨率的定义式
?分辨率的主要素?
?柱效(理塔板)的素?
?—“容量子”?—改?·?容量子
?好?
?品的色谱柱的选择性,?
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