·短篇论著·
百令胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织转化生长因子-β1和
结缔组织生长因子表达的影响3
方敬爱①邓安国①刘建社①杨晓①张春①
3本课题为山西省教委基金资助项目(No.99022)
①华中科技大学同济医学院附属协和医院(武汉430030)
糖尿病肾病是一类以进行性肾纤维化为特征的肾脏疾
病,生长因子和细胞因子在糖尿病肾病的发生、发展过程中
起重要作用。而TGF-β1和CTGF都是其病理进程中的关
键因子。研究显示,某些中药成分可通过作用于TGF-β1
和CTGF,起到延缓糖尿病肾病大鼠疾病进展的作用。我
们以往研究显示,纯中药制剂百令胶囊可以明显降低糖尿
病肾病大鼠的血压,减少大鼠的24h尿蛋白定量,减轻肾组
织免疫病理损伤,改善肾功能\[1\]。为此本研究进一步探讨
百令胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1和CTGF表达
的影响。
材料与方法
1实验动物及主要试剂Wistar大鼠,雄性,体重
220～260g,8周龄,购于山西医科大学实验动物中心。链
脲佐菌素(STZ,Sigma公司);百令胶囊(杭州中美华东制药
有限公司提供);RNA抽提液Trizol(Invitrogen公司);
TaqE、dATP、dCTP、dGTP、dTTP及RT试剂盒(Promega公
司);兔抗鼠TGF-β1及兔抗鼠CTGF多克隆抗体(DAKO
公司);免疫组化LSAB试剂盒(华美生物技术开发公司)。
2糖尿病肾病大鼠模型制备动物适应环境1周后,
切除右侧肾脏。2周后阴茎背静脉注射35mg/kgSTZ。2d
后,剪大鼠尾尖约1mm收集10μl血液测定血糖。凡静注
STZ的大鼠血糖均高于11mmol/L,而对照组大鼠血糖大
约在4mmol/L。
3实验分组及给药方法24只大鼠随机分为对照组、
糖尿病肾病模型组(模型组)、百令胶囊治疗组(治疗组),每
组各8只。治疗组STZ复制模型2d后每日灌胃百令胶囊
(2.5g/kg),对照组大鼠静脉注射相应体积的不含STZ的
柠檬酸盐溶液,并每日给予等量的饮用水,模型组每日给予
等量的饮用水,从给百令胶囊的第1d起,于12周末结束。
4肾组织病理学检查实验末取血后,将左肾沿纵向
切开,一半放入10%福尔马林溶液固定,石蜡包埋,常规切
片,行HE、PAS染色,最后光镜观察。
用半定量的评分方法将损伤等级划分为0～++++。
0,正常;+,轻度肾小球损伤,如轻度的系膜基质增生。这
种情况在<25%的肾小球中发生,则定为+;++,25%～
50%的肾小球硬化;+++,50%～75%的肾小球硬化;+
+++,超过75%的肾小球硬化\[2\]。肾小球硬化指数由所
有肾单位的损伤等级加权平均计算而得。
观察肾小管间质损害(间质炎症、纤维化、小管萎缩和
小管扩张),损伤等级划分为0～+++;0级,正常;+,视
野内损伤<25%;++,视野内损伤25%～50%;+++,视
野内损伤>50%。肾小管(间质)损伤指数由每个肾脏所有
视野的损伤等级加权平均计算而得。
5肾组织TGF-β1、CTGFmRNA表达的检测
5.1组织总RNA提取取肾皮质100mg移入匀浆
器中加入Trizol约1ml,用力匀浆,静置室温5min,移入
1.5mlEP管中。按照Trizol试剂盒的说明书操作方法,提
取总RNA。
5.2RT-PCR及PCR产物半定量分析根据已报
道的大鼠TGF-β1、CTGF与β-actin基因序列,利用
PrimerDesigner5.0软件设计。TGF-β1扩增片段为
201bp,CTGF扩增片段为207bp,β-actin扩增片段为
584bp。应用RT试剂盒进行TGF-β1、CTGF和β-actin第
一链合成,操作过程严格按照试剂盒说明,Olig(dT)为引
物。总体积为20μl,其中RNA样品3.0μl。取TGF-β1、
CTGFPCR产物7μl,在2%琼脂糖凝胶上进行电泳,稳压
电泳80V/cm约40min,然后紫外灯下观察产物条带并拍
照,计算灰度值,
6免疫组化检测采用免疫组化法检测肾组织中
TGF-β1、CTGF表达,3μm厚的石蜡切片常规脱蜡至水,
加一抗1∶100兔抗鼠TGF-β1和兔抗鼠CTGF多抗,4℃
过夜。再加1∶400稀释的生物素化羊抗兔免疫球蛋白,室
温30min;加1∶100链亲和素-辣根过氧化物酶标记的抗
生物素抗体,室温20min。最后DAB-H2O2显色,苏木素
复染,封片镜检。同时用PBS代替一抗作阴性对照。结果
判断采用半定量分析方法:根据光镜下染色部位及强度分
为0～3分,即0分:无染色;1分:偶有染色;2分:局灶染
色;3分:弥漫染色。
7统计学方法所有数据以(x±s)表示,应用SPSS
10.0统计软件处理数据。采用方差分析,P<0.05为有统
计学差异。
结果
1百令胶囊对肾组织TGF-β1mRNA表达的影响
·417·中国中西医结合肾病杂志2005年12月第6卷第12期
RT-PCR结果显示:对照组肾组织可低水平表达TGF-β1
mRNA,模型组肾组织TGF-β1mRNA的表达较对照组明
显上调(P<0.05);而经百令胶囊治疗后,大鼠肾组织的
TGF-β1mRNA的表达显著下调,与模型组比较有统计学
差异(P<0.05)。见表1。
2百令胶囊对肾组织CTGFmRNA表达的影响
RT-PCR结果显示:对照组肾组织可低水平表达CTGF
mRNA,模型组肾组织CTGFmRNA的表达较对照组明显
上调(P<0.05);经百令胶囊治疗后,大鼠肾组织的CTGF
mRNA的表达显著下调,与模型组比较有统计学差异
(P<0.05)。见表1。
表1TGF-β1、CTGFmRNA转录水平检测结果(x±s)
组别例数TGF-β1mRNACTGFmRNA
对照组80.1226±0.075230.0899±0.04793
模型组80.3761±0.16420.2889±0.1520
治疗组80.1649±0.110830.1091±0.10623
注:与模型组比较,3P<0.05
3百令胶囊对肾组织TGF-β1、CTGF表达的影响
对照组肾组织中,可见TGF-β1在肾小管和肾小球中少量
表达,CTGF不表达或弱表达,与对照组比较,模型组大鼠
肾组织的TGF-β1、CTGF表达均上调,且CTGF表达在肾
小球、肾小球毛细血管外区域,系膜增生区表达较明显。经
百令胶囊治疗后,大鼠肾组织TGF-β1、CTGF的表达明显
减少。
4肾组织TGF-β1、CTGF表达与肾组织病理损伤的
关系进一步相关分析显示,TGF-β1、CTGF表达随肾组
织病变程度加重而明显上调,两者的表达量与肾小球硬化
指数与肾小管损伤指数明显相关(均P<0.05)。见表2。
表2TGF-β1、CTGF表达与肾脏病理损伤的相关关系
项目肾小球硬化指数肾小管损伤指数
TGF-β10.45330.3893
CTGF0.41230.4253
注:3P<0.05
讨论
肾小球硬化和肾小管间质纤维化是包括糖尿病肾病在
内的各种肾脏疾病进展至终末期肾病的共同病理特征。一
系列生长因子与细胞因子参与了此过程的发生发展。
TGF-β1是已知的在糖尿病肾病中致硬化作用最强的细胞
因子,而CTGF在糖尿病肾病过程中作为TGF的下游调节
因子。研究发现,某些中药成分可通过作用于TGF-β1和
CTGF,起到延缓肾病大鼠肾组织纤维化的作用。我们以往
研究显示,纯中药制剂百令胶囊可以明显降低糖尿病肾病
大鼠的血压,减少大鼠的24h尿蛋白定量,减轻肾组织免疫
病理损伤,改善肾功能。为此本实验进一步探讨百令胶囊对
糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1和CTGF表达的影响。
近年研究表明,TGF-β1在细胞增殖及纤维化中具有
重要作用,是促进ECM沉积和组织硬化最关键的细胞因子
之一\[3\]。糖尿病肾病大鼠肾小球超滤液中的TGF-β1是
诱导近曲肾小管上皮细胞产生CTGF增多的主要原因\[4\],
而CTGF与胰岛素样生长因子-1(IGF-1)相结合作用于
间质成纤维细胞,使ECM过量合成而沉积,最终导致糖尿
病肾病大鼠肾间质纤维化\[5,6\]。目前认为,TGF-β1可能为
DN发病机制的后期共同通路,TGF-β1高表达是肾小球硬
化和肾间质纤维化的重要致病因素,它通过刺激诱导其他
促纤维因子(如CTGF)的合成和/或ECM的合成与聚集导
致了DN的发生与发展。即使在DN早期,肾小球中的
TGF-β1就已增加。
本实验结果显示,对照组肾组织可低表达TGF-β1
mRNA,模型组肾组织TGF-β1mRNA的表达明显增加。
且大鼠TGF-β1的表达增强与肾小球硬化指数及肾小管损
伤指数呈正相关,进一步证实TGF-β1的表达增加促进了
肾小球和肾间质ECM沉积和肾小球硬化及肾小管损伤。
而经百令胶囊治疗后,大鼠肾组织的TGF-β1mRNA的表
达及免疫组织化学的表达显著减少。推测百令胶囊通过抑
制TGF-β1表达,抑制肾小球细胞及肾间质成纤维细胞合
成ECM,进而使肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞转分化
成肌成纤维细胞后合成及分泌间质胶原减少,最终延缓了
疾病的进展。
参考文献
1.方敬爱,邓安国,周明群,等.百令胶囊对糖尿病肾病大鼠
生化指标及肾组织病理学改变的影响.中国中西医结合
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(收稿:2005-09-01修回:2005-11-07)
·517·中国中西医结合肾病杂志2005年12月第6卷第12期
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