[文章编号]16712587Ⅹ(2009)0220352204
[收稿日期]2008206224
[基金项目]吉林省科技厅科技发展计划重大项目资助课题(2002050324)
[作者简介]阚瑛(1972-),女,吉林省长春市人,副主任医师,医学硕士,主要从事内分泌代谢系统疾病的研究。
[通讯作者]李才(Tel:0431285619702,E2mail:lic@jlu1edu1cn)
血管紧张素Ⅰ转换酶基因多态性与2型糖尿病肾病的关联性
阚瑛1,赵焱2,阚3,李才4
(11吉林省人民医院内分泌一疗区,吉林长春130021;21吉林省人民医院急诊内科,吉林长春130021;31辽宁
省沈阳市妇幼保健所遗传室,辽宁沈阳110032;41吉林大学药学院实验药理与毒理学教研室,吉林长春130021)
[摘要]目的:探讨血管紧张素I转换酶(ACE)基因多态性与2型糖尿病肾病的关系。方法:2型糖尿病
并发肾病组(DN)患者80例,单纯2型糖尿病组(DM)患者60例,60名健康人作对照(正常对照组),抽提
每人外周血中白细胞基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)扩增ACE基因第16内含子的一个287bpAlu的
插入/缺失(I/D)基因片段,进行115%的琼脂糖凝胶电泳,并在紫外线灯下观察荧光带并确认每例的基因型。
各组间的基因型频数分布应用Hardy2Weinberg遗传平衡定律检验和χ2检验。等位基因频数分布应用χ2检验。
结果:ACE基因的3种基因型II、ID和DD的频数分布符合Hardy2Weinberg平衡定律;各组间ACE基因的基
因型频数分布比较差异无显著性(χ2=1110,P>0105);3组的等位基因I和D的频数分布比较差异无显著性
(χ2=0184,P>0105)。结论:ACE基因多态性与2型糖尿病肾病的发病无关联性。
[关键词]ACE基因;基因多态性;糖尿病肾病;糖尿病,2型
[中图分类号]R58711[文献标识码]A
AssociationbetweenACEgenepolymorphism
andtype2diabeticnephropathy
KANYing1,ZHAOYan2,KANXun3,LICai4
(1.DepartmentofEndocrinology,People’sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China;21Department
ofEmergency,People’sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China;31DepartmentofGenetics,
ShenyangHealthCareCenterforWomenandChildrenofLiaoningProvince,Shenyang110032,China;41Department
ofExperimentalPharmacologyandToxicology,SchoolofPharmacy,JilinUniversity,Changchun130021,China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheassociationbetweenangiotensinⅠconvertingenzyme(ACE)gene
polymorphismandtype2diabeticnephropathy.MethodsIn80patientswithdiabeticnephropathy(DN),
60patientswithtype2diabetesmellitus(DM)and60healthpersons(control),thewhitecelltemplateDNAof
peripheralbloodwereextracted,theACEgene(the16thintronof287bpI/D)polymorphismwasdeterminedby
polymerasechainreaction(PCR),then115%agarosegelelectrophoresiswasperformed,theresultswereobserved
underultravioletlight,thegenotypesofeachcasewereconfirmed,thegenotypicfrequencyandallelicfrequencyof
ACEgenewerecomparedbetweenthreegroupswithHardy2WeinberginheritquilibriumlawsandChi2square
criterion.ResultsThedistributionofgenotypicfrequenciesofACEwasnotdeviatedfromtheHardy2Weinberg
equilibrium;therewerenoremarkabledifferencesofthefrequencydistributionsofII,IDandDDofACEbetween
threegroups(χ2=1110,P>0105),andthefrequencydistributionsofIandDhadnomarkedlydifferences
betweenthreegroups(χ2=0184,P>0105).ConclusionThereisnosignificantcorrelationbetweenACEgene
polymorphismandtype2diabeticnephropathy.
Keywords:ACEgene;genepolymorphism;diabeticnephropathy;diabetesmellitus,type2
253
第35卷第2期
2009年3月
吉林大学学报(医学版)
JournalofJilinUniversity(MedicineEdition)
Vol.35No.2
Mar.2009
?1994-2013ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net
糖尿病肾病是糖尿病患者常见而严重的并发
症。目前,国内外尚无有效地防止糖尿病肾病发
生、发展的方法。因此,寻找和建立有效的糖尿病
肾病风险预测和发病前诊断技术,在临床上具有重
要实用价值。自从Marre等[1]报道血管紧张素Ⅰ
转换酶(angiotensinIconvertingenzyme,ACE)
基因可能与糖尿病肾病的发病有关之后,引起各国
学者的关注,有关ACE基因与糖尿病肾病发生、
发展关系的研究很多,但研究结果迄今尚不一致。
本研究对选取对象进行ACE基因多态性的测定,
旨在探讨ACE基因多态性是否参与糖尿病肾病的
发病,为临床早期预测该病提供科学依据。
1资料与方法
111病例选择本研究中所有的2型糖尿病的入
组患者均选自2005年1月—2008年1月吉林省人
民医院内分泌科的住院和门诊患者,所有患者都根
据1997年美国糖尿病协会(ADA)糖尿病诊断标
准进行了严格的诊断。空腹血浆葡萄
糖≥710mmol·L-1或随机血浆葡萄
糖≥1111mmol·L-1或OGTT试验2h血
糖≥1111mmol·L-1,符合上述标准之一者,在
次日复诊仍符合三条标准之一者确诊为2型糖尿病
患者,并排除2型糖尿病其他的血管并发症。24h
尿蛋白排泄率(UAER)连续2次以上≥30mg的
2型糖尿病患者被诊断为糖尿病肾病,并且通过相
关临床检查排除其他疾病引起的蛋白尿。其中糖尿
病肾病组(DN)患者80例,其中男性40例,女
性40例,平均年龄(63±9)岁;糖尿病非肾病组
(DM)患者60例,其中男性44例,女性16例,
平均年龄(54±12)岁;正常对照组人员均来自吉
林大学第一医院药理基地,为体检的健康人。正常
对照组60例,其中男性28例,女性32例,平均
年龄(39±13)岁。糖尿病肾病组与糖尿病非肾病
组患者的一般情况及临床资料组间比较差异无显著
性,见表1。
表1DN和DM患者一般情况及临床资料比较
Tab11ComparisonsofgeneralinformationsandclinicaldatabetweenDNandDMpatients(x±s)
GroupAge(year)Courseofdisease(year)SBP(P/kPa)DBP(P/kPa)FBG(cB/mmol·L-1)
DN63±9719±3.622.1±4.313.8±3.710.1±3.4
DM54±127.6±2.419.2±5.611.3±3.29.9±4.1
GroupHbAlC(η/%)TC(cB/mmol·L-1)TG(cB/mmol·L-1)LDL(cB/mmol·L-1)DHL(cB/mmol·L-1)
DN7.6±4.55.82±1.22.48±1.162.83±1.441.09±0.32
DM8.4±2.65.53±1.42.37±1.292.79±1.231.16±0.23
112基因组DNA的提取采用DNA抽提试剂盒
(Promega,普洛麦格北京生物技术有限公司)快
速抽提每人外周血中白细胞基因组DNA,操作方
法按说明书进行。
113PCR实验①PCR总反应体系25μL:模板
DNA2μL,10×PCR缓冲液215μL(Mg2+终浓
度为215mmol·L-1,宝生物工程(大连)有限公
司),上游引物015μL(上海生工生物工程技术服
务有限公司),下游引物015μL(上海生工生物工
程技术服务有限公司),dNTPs1μL,TaqDNA
聚合酶012μL(宝生物工程(大连)有限公司),
去离子水1813μL。②PCR反应过程:采用Rigat
设计的PCR反应引物,PCR引物:ACE2F,
5′2CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT23′及
ACE2R,5′2GATGTGGCCATCACATTCGT2
CAGAT23′。用PCR扩增仪,预变性为94℃,持
续5min;继之30个周期,每个周期中变性94℃
持续1min;退火58℃持续2min,延伸72℃,持
续2min;循环结束后终末延伸72℃,持续
10min。
114PCR产物鉴定检测ACE基因的第16内含
子中287bp片段插入/缺失(I/D)多态性标志,
将PCR扩增的ACE基因第16内含子的一个
287bpAlu的插入/缺失(I/D)基因片段进行
115%琼脂糖凝胶电泳(在80V电压下泳动
30min),溴化乙锭染色,在透射式紫外线灯下观
察结果,并利用凝胶成像分析系统摄像并分析灰度
值,出现插入型纯合子片段,即仅有490bp区带
者为II型;缺失型纯合子片段,即仅有190bp区
带者为DD型,杂合子片段为既有190bp区带又
有490bp区带者为ID型。
115统计学方法用SPSS1010软件处理数据。
353阚瑛,等1血管紧张素Ⅰ转换酶基因多态性与2型糖尿病肾病的关联性
?1994-2013ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net
观察荧光带并确认每例的等位基因型,计算各组
ACE基因型频数和等位基因频数,经
Hardy2Weinburg遗传平衡定律检验。各组间基因
型频数分布和等位基因频数分布比较采用χ2检验。
2结果
211ACE基因的基因型鉴定ACE基因扩增的
产物与一段287bp的Alu重复顺序,存在I/D
(插入/缺失)多态性,从而导致了3种基因型:插
入型纯合子片段,即仅有490bp区带者为II型;
缺失型纯合子片段,即仅有190bp区带者为
DD型,杂合子片段为既有190bp区带又有490bp
区带者为ID型。因此,在115%琼脂糖凝胶电泳结
果中可见到DD、ID及II3种基因型,见图1。
图1ACE基因PCR扩增产物电泳图
Fig11ElectrophoregramofPCRproductofACEgene
Lane1:DNAmarker;Lane2,6,7:IDtype;Lane3,5:DDtype;
Lane4:IItype
212ACE基因的基因型频数和等位基因频数分布
在糖尿病肾病组中,II型26例,ID型36例,
DD型18例,经Hardy2Weinberg遗传平衡定律检
验得出χ2=0166,P=0142,P>0105。在糖尿病
组中,II型18例,ID型24例,DD型18例,经
Hardy2Weinberg遗传平衡定律检验得出χ2=
2140,P=0112,P>0105。在正常对照组中,
II型20例,ID型26例,DD型14例,经
Hardy2Weinberg遗传平衡定律检验得出χ2=0193,
P=0133,P>0105。表明各基因型频数已达遗传
平衡,具有群体代表性。ACE基因型频数比较结
果表明,在糖尿病肾病组中,ACE各基因型频数
分别为II型33%、ID型45%、DD型23%。在糖
尿病组中的ACE各基因型频数分别为II型30%、
ID型40%、DD型30%。在正常对照组中的ACE
各基因型频数分别为II型33%、ID型43%、DD
型23%。3组的基因型频数分布比较差异无显著性
(χ2=1110,P>0105)。
在糖尿病肾病组中,ACE等位基因I和D频
数分别为55%及45%。在糖尿病组中,ACE等位
基因I和D频数分别为50%及50%。在正常对照
组中,ACE等位基因I和D频数分别为55%及
45%。3组的等位基因频数分布比较,差异无显著
性(χ2=0184,P>0105),见表2。
本研究结果显示,糖尿病肾病组、糖尿病组和
正常对照组基因型均以ID型为主,等位基因I占
优势,但统计学结果均无显著性差异,表明ACE
基因与糖尿病肾病的发病无明显关系。
表2DN、DM和正常人ACE基因频数和等位基因频数分布比较
Tab12ComparisonsofdistributionofgenotypicfrequencyandallelicfrequencyofACEgenebetweenDN,DMpatientsand
contrls[n(η/%)]
GroupTotalnumberGenotypicfrequencyIIIDDDAllelicfrequencyID
DN8026(33)36(45)18(23)88(55)72(45)
DM6018(30)24(40)18(30)60(50)60(50)
Control6020(33)26(43)14(23)66(55)54(45)
3讨论
以往的研究发现,糖尿病肾病血清ACE活性
高于正常人和无糖尿病肾病的糖尿病患者,而血清
ACE活性受ACE基因I/D多态性的调控,
ACE基因DD型者血清ACE活性最高,其次是
ID型,II型最低。血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂
(ACEI)现已广泛地应用于糖尿病肾病的治疗,
有研究证实,其疗效在DD型最好,II型最差,
表明ACEI治疗糖尿病肾病的疗效受ACE基因多
态性的影响。
1988年Soubrier在克隆出ACE的cDNA以
后,成功地测定出ACE的核苷酸序列,ACE基因
的结构得以阐释。ACE基因位于人类染色体
17q23,全长21000bp,有26个外显子及25个内
含子。1992年Rigat等[2]报道了ACE基因的PCR
扩增方法,采用位于内含子16的1个287bp的
Alu内切酶顺序为I/D多态性标志。如在一对
453吉林大学学报(医学版)第35卷第2期2009年3月
?1994-2013ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net
17号染色体上均插入这一片段,则ACE基因为插
入型(InsertionII);均缺失这一片段为缺失型
(Deletion,DD);如在一条17号染色体上插入而
另一条上缺失这一片段,则ACE基因为杂合型
(ID),因此,ACE基因存在3种基因型,即DD、
ID和II型;2种等位基因D、I。人们将这种
ACE基因存在2种以上基因型的现象叫做ACE基
因I/D多态现象。ACE基因I/D多态性与糖尿病
肾病的关系的研究早在1994年由Marre等报告,
Marre等研究了62例微量白蛋白尿、大量蛋白尿
及62例无白蛋白尿的1型糖尿病患者,显示II基
因型者糖尿病肾病发生的危险度降低。他们认为
1型糖尿病患者DD基因型在糖尿病肾病组高于糖
尿病组,DD基因型与1型糖尿病肾病的发病有
关。Ha、Cohda等[3,4]报道,在韩国和日本2型糖
尿病患者中,ACE基因的DD型基因是引起糖尿
病肾病快速进展的危险因素。Solini等[5]也报道,
有早期肾病的2型糖尿病患者中,DD基因型患者
肾小球间质基膜样物质量和肾小球基底膜的厚度均
高于II基因型患者。Solini等运用肾活检技术,对
肾损害程度进行了较准确地分级,揭示了在2型糖
尿病并发肾病患者中,DD基因型携带者肾小球损
害更为严重,研究认为,ACE基因的I/D多态性
是肾小球基底膜增厚的独立影响因素。但Chang、
Araz等[6,7]报道,ACE基因I/D多态性与2型糖
尿病肾病的发生及进展无关;Schmidt等[8]对德国
2型糖尿病及糖尿病肾病患者作ACE基因多态性
研究,认为ACE基因I/D多态性与糖尿病肾病无
关,其基因型频数和等位基因频数在糖尿病组和糖
尿病肾病组的分布比较差异无显著性。国内,李咏
梅等[9]也曾报道,ACE基因的等位基因D的出现
增加发生糖尿病肾病的危险性。成金罗等[10]则认
为,ACE基因DD基因型可增高2型糖尿病患者
并发肾病的危险性,并与糖尿病的病程有交互作
用。另外,也有人报道,ACE基因I/D多态性与
糖尿病肾病的发病无关[11]。
目前,对于ACE基因的研究非常多,但
ACE基因I/D多态性是否与糖尿病肾病的发生、
发展有关还存在较大争议。其差异可能与种族或观
察的样本数有关[12]。本研究结果显示,DN、DM
患者和正常对照组均以ID基因型为主,等位基因
I占优势,而且各组的II基因型频数均高于DD型
基因。但统计学均无显著性差异,表明DD基因型
与糖尿病肾病的肾功能恶化无关,这与国外一些研
究结果相近似。总之,根据本实验结果推断,吉林
地区汉族人ACE基因多态性与糖尿病肾病的发生
无明显关联性。
[参考文献]
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