PCR仪简介一、PCR仪的分类与简介普通的PCR仪：把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，叫传统的PCR仪，也叫普通PCR
仪。梯度PCR仪：把一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度），通常12种温度梯度，这样的仪器就叫梯度PCR仪
。原位PCR仪：用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪，如病源基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。实时荧
光定量PCR仪：在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量PCR仪。一、PCR仪的分类与
简介PCR的要素基本的PCR须具备要被复制的DNA模板Template界定复制范围两端的引物(Primers.)DNA聚
合酶(Taq.Polymearse)合成的原料（四种脱氧核苷酸）及水。二、PCR仪的反应原理类似于DNA的天然复制过程，其特
异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DN
A经加热至94℃左右一定时聚合酶链式反应间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，
为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链
的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模
板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半
保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PC
R的反应包括三个主要步骤分别是：1.Denaturation2.Annealingofprimers3.Extension
ofprimers所谓Denaturing乃是将DNA加热（至90~95℃）变性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的
模板.而Annealing则是令Primers于一定的温度下（冷却至55~60℃）附着于模板DNA两端。最后在DNA聚合酶e.g.
Taq-polymerase的作用下（加热至70~75℃）进行引物的延长Extensionofprimers及另一股的合成。微
量移液器微量移液器微量移液器是生物、化学实验室常用的小容量移体的单道微量移液器，与众不同的是微量移液器具有能够由使用者自己校
准不用工具辅助，易拆卸和维护等特点。同时充分符合人体工程学原理。微量移液器替代了过去的玻璃吸管，作为一种方便有效的计量仪器已经被广
泛用于各种实验室。移液器的四种规格分别是：0.5～10μl(读数窗显示0.5～10.0,每转1档为0.1μl);5～50μl(读数
窗显示5.0～50.0,每转1档为0.5μl);20～200μl(读数窗显示20～200,每转1档1μl);100～1000μl(
读数窗显示100～1000,每转1档为5μl).原理微量移液器是根据“虎克定量”设计的，即在一定限度内弹簧伸展的
长度与弹力成正比。也就是微量加样器的吸液体积与加样器内的弹簧伸展的长度成正比。种类及部件微量移液器的种类包括单道移液器、多
道移液器、电子移液器、瓶口移液器等。特别在痕量分析和分子生物学实验中越来越显示其无比的优越性。其主要部件包括按钮、套筒、弹射器、吸
头、连接螺帽等。枪头种类有芯:适合初学者使用，不易污染移液器，但是不易清洗，只能用紫外线杀菌，如果
用高温灭菌会导致变形无芯：适合使用熟练者，易清洗，可用紫外线杀菌和高温灭菌基本使用方法1.首先根据移液量选取合适的移液器。
移液量应在加样器的容量范围之内。2.设定取液值：转动移液器的调节旋钮，反时针方向转动旋钮，可提高设定取液量。顺时针方向转动旋钮，
可降低取液量。在调整旋钮时，不要用力过猛，并应注意使移液器显示的数值不应超过其可调范围。3．吸液：[1]选择吸头放在移
液器套筒上，稍加压力使之与套筒之间无空气间隙。[2]把按钮压至第一停点（图A），垂直握持加样器，使吸头浸入液面下3-5毫米处，
然后缓慢平稳地松开按钮，吸入液体（图B）。4．放液：[1]将吸头口贴到容器内壁底部并保持倾斜，平稳地把按钮压到第一停点（图
C），再把按钮压到第二停点以排出剩余液体（图D）。[2]压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过（图D）。松开按钮（图E）
，按吸头弹射器除去吸头。使用中常出现的错误操作①吸液时，移液器本身倾斜，导致移液不准确②装配吸头时，用力过猛，导致吸
头难以脱卸③平放带有残余液体吸头的移液器④用大量程的移液器移取小体积样品⑤直接按到第二档吸液⑥使用丙酮或强腐蚀性的液体清洗
移液器使用注意事项1）勿将微量移液器本体浸入溶液中。2）吸取黏度高的试液，先将微量移液器头尖端以刀片或剪刀将出口切大
，并先行预润后再吸取。3）吸取酸液或具腐蚀性溶液后，请将微量移液器拆解开，各部位零件以蒸馏水冲洗干净，擦干后再正确组合回复原状
。4）微量移液器的任何部份切勿用火烧烤，亦不可吸取温度高于70℃的溶液，避免蒸气侵入腐蚀活塞。5）套有微量移液器头的微量移
液器，无论微量移液器头中是否有溶液，均不可平放，需直立架好。6）P5000必须使用过滤头，过滤头潮湿即需更换。7）若不小
心使溶液进入吸管柱内时，应予以拆解，将活塞组件、吸管柱、铁氟龙垫等各部位以清水冲洗干净后，再以酒精擦拭，擦干后再正确组合回复原状。
凝胶成像仪一、凝胶成像定义凝胶成像主要用于蛋白、核酸凝胶成像及分析，系统提供白光和紫外光两种光源进行拍摄凝胶，由系统自带的图
像捕捉软件捕捉拍摄图像，然后由系统自带的图像分析软件对拍摄的图像进行分析。图像分析程序，适用于ID胶、斑点/狭缝印迹、平板、菌落、
放射自显影、多排胶、蛋白胶、GFP、PCR、考马斯亮蓝及银染的胶及ZYMA胶；可进行凝胶图像分析、克隆计数分析、手动条带定量和斑点
分析。二、凝胶分析软件简介应用范围：凝胶分析软件主要应用于生物医学、医药领域，为科研人员提供了分析凝胶图像及其它生物学条带的
途径。主要功能：凝胶图像剪辑处理，标记；自动寻找凝胶条带；与公用的标准条带或自选的标准条带比较；条带（泳道）迁移路径的校
正；核酸、蛋白的处理，计算相应的分子量等数值；详细的分析结果可输出成EXCEL格式，根据需要编辑。三、凝胶成像应用范围从整
体总的来说凝胶成像（系统）可应用于：蛋白质、核酸、多肽、氨基酸、多聚氨基酸等其他生物分子的分离纯化结果作定性分析分子量定量：对于
一般常用的DNA胶片,利用分子量定量功能,通过对胶上DNAMarker条带的已知分子量注释,自动生成拟合曲线,并以它衡量得到未知
条带的分子量。通过这种方法所得到的结果较肉眼观察估计要准确很多。密度定量：一般常用的测定DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸
)浓度的方法是紫外吸收法,但它只能测定样品中的总核苷酸浓度,而不能区分各个长度片段的浓度。利用凝胶成像系统和软件,先将DNA胶片上
某一已知其DNA含量的标准条带进行密度标定以后,可以方便的单击其他未知条带，根据与已知条带的密度做比较，可以得到未知DNA的含量。
此方法也适用于对PAGE蛋白胶条带的浓度测定。三、凝胶成像应用范围密度扫描：在分子生物学和生物工程研究中，我们最常用到的是
对蛋白表达产物占整个菌体蛋白的百分含量的计算。传统的方法就是利用专用的密度扫描,但利用生物分析软件结合现在实验室常规配备的扫描仪或
者直接用白光照射的凝胶成像就能完成此项工作。PCR定量：PCR定量主要是指，如果PCR实验扩增出来的条带不是一条，那么可以利用软
件计算出各个条带占总体条带的相对百分数。就此功能而言，与密度扫描类似，但实际在原理上并不相同。PCR定量是对选定的几条带进行相对密
度定量并计算其占总和的百分数，密度扫描时并对选择区域生成纵向扫描曲线图并积分。四、凝胶成像种类普通凝胶成像分析系统：可以对蛋白
电泳凝胶，DNA凝胶样品进行图象采集并进行定性和定量分析，样品包括：EB、SYBRGreen、SYBRGold、TexasR
ed、GelStar、Fluoroscecin、RadiantRed等染色的核酸监测；以及CoomassieBlue、SYPR
OOrange、各种染色的蛋白质凝胶如考染等。（或UV,EB和有色及可见样品成像）；化学发光成像分析系统：成像范围涵盖UV,E
B,化学发光、紫外-荧光、有色及可见样品成像；多色荧光成像分析系统：成像范围涵盖UV,EB,化学发光、多色荧光荧光、有色及可见样
品成像；多功能活体成像分析系统：UV,EB,化学发光、多色荧光荧光、有色及可见样品成像和离体组织和小型动物，及大型型动物。实时
荧光定量PCR仪第四代实时荧光定量PCR仪实时荧光定量PCR仪在医疗方面应用⑴病原体检测⑵产前诊断⑶药物疗效考核
⑷肿瘤基因检测(5)在优生优育中的应用PCR基因扩增法的应用1.PCR检测地中海贫血2.苯丙酮尿症3.血友病4.
性别发育异常5.脆—X综合征基因修复对于有基因缺陷的患者，在子弹上均匀的涂上正常DNA，通过基因枪的发射进入靶细胞以修复基因
，使其正常表达实时荧光定量pcr仪，由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。多色实时荧光定量PCR仪实时荧光定量
PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。样品到达域值水平所经历的循环
数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相
应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。所谓real-timeQ-PCR技术，是指在PCR
反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-tim
e技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解
特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。
这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的运用。PCR反应过程中产
生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。PeqS
TAR快速梯度PCR仪实时荧光定量PCR仪普通PCR原位PCR因为被扩增的不同DNA片段，其最适退火温度不同，通过设置一系
列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度
的扩增，这样节约成本的同时也节约了时间。主要用于科研，教学机构。梯度PCR仪，在不设置梯度的情况下也可以做普通PCR扩增。其PC
R扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性
结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。把这PCR仪叫做实时荧光定
量PCR仪。荧光定量PCR仪有单通道，双通道，和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道，有多荧光标记的时候用多通道。单通
道也可以检测多荧光的标记的目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。该仪
器主要用于医学临床检测，生物医药研发，食品行业，科研院校等机构。如果要做不同的退火温度需要多次运行。主要是做简单的，对目的基因退
火温度的扩增。该仪器主要应用于科研研究，教学，医学临床，检验检疫等机构。是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细
胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增，不但可以检测到靶DNA，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的
发病机理和临床过程及病理的转变有重大的实用价值。耐高温的DNA聚合酶，从Thermusaquaticus细菌中提取得到。枪头
有芯无芯基因枪简介生化武器克星Genegun:（基因枪）Themostextraordinarysystemo
ftransferringDNAintoplantcellsinvolvesminutemetalbeadsb
eingshotintoplantcells.用火药爆炸或者高压气体加速将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒直接
送入完整的植物组织或者细胞中，这一加速设备称为基因枪。出世的原因（1）小的时候，我们都打过预防麻疹、小儿麻痹等病毒的疫苗，这
其实是一种预防接种疗法。但是，注射的疫苗属于活生生的病原体微生物，其生产成本高昂，注射方式复杂，尤其不适用于危险系数极大的致命病毒
。（2）科学家们又开创了通过摘除特定DNA片段抑制或根治疾病的基因疗法。从理论上说，切除某个DNA片段，等于从生物学上抹煞了相应
致病因素发作的可能。但临床试验证实，人体免疫系统对于基因疗法呈现出排斥反应。应运而生从而也有了基因枪法基因枪法，又称生物弹法
或微粒枪法、微粒轰击发，是依赖高速度的金属颗粒将外源基因引入活体细胞的一种转化技术。它是农杆菌介导转化法之后又一应用广泛的遗传转化
技术。这种方法操作简单，效率高，适应性强。一次可以向数以千计的细胞导入基因，此外其目标命中率高，因此格外受重视。基因枪根据其加速装
置可分为火药式、电动式和气动式。原理经适当处理后，使DNA液均匀地吸附在或包裹于微小的钨粉或金粉颗粒表面，利用基因枪的火药爆炸
、高压放电或高压气体做驱动力，发射出微弹与DNA的复合体，击中并高速穿透真空室中受体细胞的细胞壁及细胞膜，进入细胞内，从而达到将吸
附于微弹上的外源DNA导入细胞或原生质体，获得整合与表达的目的。微弹复合体对受体细胞造成的损伤可以修复。（一）基因枪在肿瘤基因治
疗研究中的应用基因枪在肿瘤基因治疗的研究主要在间接体外和体内两个领域。间接体外领域主要是瘤苗的研究，即在间接体外对肿瘤细胞转基因，经过照射使之失去增值能力后，再回植到体内，以达到提高机体抗肿瘤免疫的能力。由于患者肿瘤手术切除标本非常难于在体外培养，而且即使获得长期培养物，肿瘤细胞表面的一些抗原性物质可能已经发生了改变。所以，基因枪这种不需要长期体外培养的转基因手段在这些研究中具有很大的优势。（二）基因枪在植物基因转化中的应用目前，农作物基因工程正进入一个飞速发展的时期，越来越多的转基因植物和产品进入市场。不但可以利用基因枪技术种植具有特定农艺性状（如抗病、抗寒、抗旱。抗涝、抗虫、耐盐、耐药等）以及高质量食品（高蛋白、高油酸、含维生素等）的作物，而且也可以利用该技术来开发和利用具有特定用途（如生物制药）的植物。总之，有了这种高效的转化技术，作物复杂的生理生化性状等可望得到进一步的改良。 |
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