1.限制性内切核酸酶是一种DA.DNA内切酶B.RNA内切酶C.存在于细菌中的酶D.识别切割
特异DNA序列的酶E.产生特异大小片段的酶?2.作为克隆载体的最基本条件是CA.DNA分子
量较小B.环状双链DNA分子C.有自我复制功能D.有多克隆位点E.有一定遗传标志?3.相对载体而言
，插入的DNA片段称为CA.目的基因B.感兴趣基因C.外源DNAD.cDNA
E.基因组DNA4.质粒DNA导入细菌的过程称AA.转化B.转染C.感染D.
感受E.以上都是5.目前多用作基因载体的有ABCA.质粒DNAB.噬菌体DN
AC.病毒DNAD.cDNAE.人基因组DNA6.目的DNA可来源于ABC
DA.化学合成B.基因组DNAC.cDNAD.PCRE.以上都不是2003.12日本
神户大学医学系教授松尾雅文3日说，他所领导的研究小组用人工合成的ＤＮＡ（脱氧核糖核酸）治疗杜氏肌营养不良症患者，收到了疗效。这是这
种疾病的基因疗法首次在临床试验中获得成功。据时事社报道，接受上述基因疗法的患者是一名10岁的男孩。由于其基因异常，无法合成
抗肌营养不良蛋白，他的病情已发展到无法站立的地步。从10月29日开始，松尾等人用基因疗法对他进行治疗。专家们通过静脉输液，每周4次
为患者输入人工合成的ＤＮＡ，目的是改变其部分基因信息，以生成ＤＮＡ控制合成抗肌营养不良蛋白所需的中间媒介和模板——信使ＲＮＡ（核糖
核酸），促进抗肌营养不良蛋白的合成。经过治疗，研究人员在患者血液的淋巴细胞中发现了新合成的ＲＮＡ，患者的肌萎缩症状已有所改善。这名
10岁男孩已于3日出院，今后专家还将定期把人工合成的ＤＮＡ输入到这名患者体内。杜氏肌营养不良症又称假性肥大型肌营养不良症，
是一种遗传病，目前尚无有效疗法。据统计，全球平均每3500名幼儿中就有一人罹患此病，患儿主要是男孩。这种患者会在3至4岁时因肌肉无
力或萎缩而行走不便，一般到20岁左右就会因心肌功能和呼吸能力丧失而死亡。松尾教授认为，其正在研究的基因疗法为杜氏肌营养不良症患者带
来了福音。Leber遗传性视神经病(Leber''shereditaryopticneuropathy,LHON)1858
年由VonGrade等首先报告,Leber于1871年确定该病的遗传性.1988年,Wallace等首次发现LHON存在线粒体D
NA(mitochon-drialDNA,mtDNA)的病理性突变,他们发现在许多LHON家族成员均有mtDNA11778位点的
点突变[1].此后,许多研究证实LHON为母系遗传性疾病,其主要病因是线粒体基因组某些位点发生突变,是一种最为常见的线粒体遗传病
.Leber遗传性视神经病(Leber''s?hereditary?optic?neuropathy，LHON)是一种严重危害视功
能的线粒体DNA（mtDNA）眼病，多在青春期发病，呈双眼先后急剧的视力下降而终至视神经萎缩。过去临床上一直是通过典型的家族史和临
床特点来判断的，因此,散发的LHON曾经较难确诊。自Wallace等首次发现LHON与mtDNA?11?778?G→A突变密切相关
〔1〕，以及np?3?460等碱基点突变〔2〕的发现以来，很快被国外学者用于LHON的临床诊断之中。我国学者于1992年报道了Le
ber氏病的DNA突变研究交界型大疱性表皮松解症是先天性大疱性表皮松解症3型之一,临床表现复杂,分为多个亚型,表现为轻微外
伤后出现水疱、糜烂、愈后遗留萎缩性瘢痕,电镜下示裂隙位于基底膜透明板.现就交界型大疱性表皮松解症临床分型、电镜下超微结构、致病基因
、基因诊断和基因治疗等方面的近年文献予以综述.第十五章重组DNA技术RecombinantDNATechnolo
gy第一节概述General理论上的三大发现遗传物质基础是DNADNA双螺旋结构遗传信息的传递方式及
操纵子学说一、重组DNA技术的基础第一节概述General一、重组DNA技术的基础技术上三大发明限制
性核酸内切酶、DNA连接酶的发现载体的研究逆转录酶的发现二、重组DNA技术相关概念重组DNA技术（分子克隆）
目的基因载体重组DNA技术亦称分子克隆，在此专指DNA克隆应用酶学方法，在体外将各种不同来源的DNA与载体连接
成具自我复制能力的DNA分子，通过转化/转染/感染宿主细胞，筛选出含目的基因的转化子，再进行扩增、提取，获得大量同一的DNA分子，
其所采用的方法、相关工作及理论统称为重组DNA技术学。DNAcloning目的基因cDNA体外反转录合成的、与m
RNA互补的DNA基因组DNA代表一个细胞/生物体整套遗传信息的所有DNA序列载体表达载体expressionve
ctor蛋白质表达为目的克隆载体cloningvector分离基因为目的，可携带目的基因进入宿主细胞实现扩增载
体理想载体符合的条件具自主复制能力具较多拷贝数分子质量较小具多个单一限制性内切酶位点一个或多个筛选标记较高的遗传稳定
性主要工具酶EssentialEnzymes限制性核酸内切酶DNA连接酶其他工具酶限制性核酸内切酶命名
属、种、株加罗马数字分类Ⅰ类酶、Ⅱ类酶、Ⅲ类酶识别序列多数为回文序列，切割后可产生粘性末端平末端配伍末端同识异切
酶识别、切割双链DNA分子内特异核苷酸序列，存在于细菌内维持其遗传稳定性。EnzymesinvolvedinD
NAcloningRestrictionendonucleases(II)EcolRⅠPstⅠSmalⅠDN
A连接酶T4DNA连接酶E.coliDNA连接酶使一段DNA的3’-羟基末端与另一段DNA的5’-磷酸末端生成3’，5’-
磷酸二酯键，使单链DNA缺口封合或使两个DNA片断连接成一个片断。常用载体CommonCloningVectors
质粒plasmid噬菌体phage柯斯质粒cosmid人工染色体artificialchromosome质粒
细菌染色体外、自主复制、闭合环状DNA分子量1kb到200kb以上带有特殊的遗传信息“抗药性”等改造后成为极其常用的载体
穿梭载体pUC19map第二节重组DNA基本步骤目的基因的获得(分)载体的选择与修饰（切）DNA分
子的体外重组（接）重组DNA分子的导入、鉴定（转，筛）目的基因的表达（表）目的基因的来源SourcesofTarg
etDNA化学合成目的基因片断基因组DNA基因组文库cDNAcDNA文库聚合酶链式反应体外大量扩增目的基因的方法
载体的选择与修饰SelectionandConstructionofVectors克隆载体用于目的基因的克隆、扩
增、序列分析和体外定点突变表达载体在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物根据具体实验需要选择载体DNA分子的
体外重组JoiningDNAFragments粘性末端连接平端连接同聚物加尾连接人工接头连接重组DNA分子的
无性繁殖RecombimantDNACloning转化：宿主为大肠杆菌和酵母细胞大肠杆菌“感受态”转
染：宿主为真核细胞“稳定/瞬时转染”感染：以噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体，
感染适当细胞重组体的导入MethodsappliedintransfectionCOS-1cellstr
ansfectedwithTransIT?-COSTransfectionKitandpEYFP-Nuc(Clont
ech)incompletemediafor24hours.DoubletransfectionofHeLa
cellswithLivingColors?enhancedfluorescentproteinvectorsEC
FPandEYFP.Imageswerecapturedon35-mmslidefilmbydoublee
xposureusingOmega?OpticalfiltersetsXF114(blue,mitochondri
a)andXF104(yellow,nucleus).ImagecourtesyofDr.BrigitteAn
gres,CLONTECHLaboratories,Inc.重组DNA分子的无性繁殖RecombimantDNA
Cloning遗传标志筛选法抗药性营养缺陷型的互补筛选α-互补法核酸杂交筛选法PCR/DNA序列鉴定外源基因表达产物
鉴定转化子的筛选和重组子的鉴定TheyeastcoloniesgrowingonthisPetriplat
econtainplasmidmoleculeswithaselectablemarkerandacloned
DNAinsertBlue-whitescreeningonmediumwithampicillin,X-ga
landIPTG.whitecoloniescontainrecombinantplasmidandcanbe
isolateddirectlyfromthisplate目的基因的表达ExpressingaTarget
Gene外源基因在原核细胞的表达优点：简单、迅速、经济适合大规模生产缺点：缺乏转录后、翻译后加工机制目的基因在真核细胞的表
达表达产物更接近真核天然蛋白质结构表达载体既含原核克隆载体的主要元件，又含各种真核表达元件第三节重组DNA技术在医学
中的应用DNA诊断基因治疗DNA诊断DNADiagnosisDNA诊断常用方法PCR、限制性片断长度多态性、
单链构象多态性、限制性酶切图谱及基因测序等DNA诊断的应用杜氏肌营养不良(DMD)、Leber遗传性神经病、苯酮酸尿症基
因治疗GeneTherapy基因治疗的概念从基因水平调控细胞中缺陷基因、修补矫正或替代缺陷基因，分为基因增补、替换、修复三
种类型。基因治疗的基本策略载体构建病毒/非病毒载体基因转移间接/直接体内疗法基因治疗和肿瘤Anewgenei
sinjectedintoanadenovirusvector,whichisusedtointroduce
themodifiedDNAintoahumancell.Ifthetreatmentissuccessfu
l,thenewgenewillmakeafunctionalprotein.PrenatalApproach
estoGeneTherapyofHerlitzJunctionalEpidermolysisBullosa
2003.12日本神户大学医学系教授松尾雅文3日说，他所领导的研究小组用人工合成的ＤＮＡ（脱氧核糖核酸）治疗杜氏肌营养不良症患
者，收到了疗效。这是这种疾病的基因疗法首次在临床试验中获得成功。据时事社报道，接受上述基因疗法的患者是一名10岁的男孩。由
于其基因异常，无法合成抗肌营养不良蛋白，他的病情已发展到无法站立的地步。从10月29日开始，松尾等人用基因疗法对他进行治疗。专家们
通过静脉输液，每周4次为患者输入人工合成的ＤＮＡ，目的是改变其部分基因信息，以生成ＤＮＡ控制合成抗肌营养不良蛋白所需的中间媒介和模
板——信使ＲＮＡ（核糖核酸），促进抗肌营养不良蛋白的合成。经过治疗，研究人员在患者血液的淋巴细胞中发现了新合成的ＲＮＡ，患者的肌萎
缩症状已有所改善。这名10岁男孩已于3日出院，今后专家还将定期把人工合成的ＤＮＡ输入到这名患者体内。杜氏肌营养不良症又称假
性肥大型肌营养不良症，是一种遗传病，目前尚无有效疗法。据统计，全球平均每3500名幼儿中就有一人罹患此病，患儿主要是男孩。这种患者
会在3至4岁时因肌肉无力或萎缩而行走不便，一般到20岁左右就会因心肌功能和呼吸能力丧失而死亡。松尾教授认为，其正在研究的基因疗法为
杜氏肌营养不良症患者带来了福音。Leber遗传性视神经病(Leber''shereditaryopticneuropath
y,LHON)1858年由VonGrade等首先报告,Leber于1871年确定该病的遗传性.1988年,Wallace等首次发
现LHON存在线粒体DNA(mitochon-drialDNA,mtDNA)的病理性突变,他们发现在许多LHON家族成员均有mt
DNA11778位点的点突变[1].此后,许多研究证实LHON为母系遗传性疾病,其主要病因是线粒体基因组某些位点发生突变,是一种最
为常见的线粒体遗传病.Leber遗传性视神经病(Leber''s?hereditary?optic?neuropathy，LHON)是一种严重危害视功能的线粒体DNA（mtDNA）眼病，多在青春期发病，呈双眼先后急剧的视力下降而终至视神经萎缩。过去临床上一直是通过典型的家族史和临床特点来判断的，因此,散发的LHON曾经较难确诊。自Wallace等首次发现LHON与mtDNA?11?778?G→A突变密切相关〔1〕，以及np?3?460等碱基点突变〔2〕的发现以来，很快被国外学者用于LHON的临床诊断之中。我国学者于1992年报道了Leber氏病的DNA突变研究交界型大疱性表皮松解症是先天性大疱性表皮松解症3型之一,临床表现复杂,分为多个亚型,表现为轻微外伤后出现水疱、糜烂、愈后遗留萎缩性瘢痕,电镜下示裂隙位于基底膜透明板.现就交界型大疱性表皮松解症临床分型、电镜下超微结构、致病基因、基因诊断和基因治疗等方面的近年文献予以综述. |
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