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WS
中华人民共和国卫生行业标准
XX/TXXXXX—XXXX
下呼吸道感染细菌培养操作规范
StandardforBacterialCultureProceduresofLowerRespiratoryTractInfections
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（报批稿）
（本稿完成日期：）
XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施
中华人民共和国国家卫生计生委员会
发布
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目次
前言.................................................................................4
引言.................................................................................5
1范围..............................................................................7
2术语及定义........................................................................7
2.1支气管肺泡灌洗液..............................................................7
2.2保护毛刷标本..................................................................7
2.3库什曼螺旋纤维................................................................7
2.4夏科雷登结晶..................................................................7
2.5弹性纤维......................................................................7
2.6纤毛柱状上皮细胞..............................................................8
2.7肺泡巨噬细胞..................................................................8
3分析前............................................................................8
3.1标本采集......................................................................8
3.1.1咳痰......................................................................8
3.1.2气管吸出物................................................................8
3.1.3血培养....................................................................8
3.1.4诱导痰（通常不用于细菌培养）..............................................8
3.1.5气管镜标本................................................................8
3.2标本运送......................................................................9
3.3筛选并拒收下呼吸道细菌培养标本................................................9
4分析中............................................................................9
4.1痰及气管吸出物标本处理........................................................9
4.1.1标本处理要求..............................................................9
4.1.2接种标本..................................................................9
4.1.3培养......................................................................9
4.1.4标本涂片及革兰染色.......................................................10
4.1.5显微镜观察革兰染色结果...................................................10
4.2气管镜标本处理...............................................................10
4.2.1支气管肺泡灌洗液定量培养.................................................10
4.2.2保护毛刷定量培养.........................................................11
4.2.3接种其他培养基及培养.....................................................11
4.2.4革兰染色标本处理.........................................................11
4.2.5剩余BAL标本检测其他病原.................................................11
4.3连续培养并观察慢生长菌.......................................................11
4.4分离并鉴定下呼吸道重要致病菌（参见附录C）....................................11
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2
4.4.1链球菌属.................................................................11
4.4.2苛养革兰阴性杆菌（在麦康凯平板上难生长）.................................12
4.4.3革兰阴性双球菌...........................................................12
4.4.4革兰阴性杆菌（在麦康凯平板上生长良好）...................................12
4.4.5葡萄球菌属...............................................................13
4.4.6肠球菌属.................................................................13
4.4.7革兰阳性杆菌.............................................................13
4.4.8鉴定丝状真菌.............................................................13
4.4.9涂片时可见但培养不生长的细菌.............................................13
4.5质量控制.....................................................................13
4.5.1革兰染色.................................................................13
4.5.2抗酸染色.................................................................13
4.5.3培养基...................................................................14
4.5.4试剂.....................................................................14
5分析后报告结果...................................................................14
5.1革兰染色报告.................................................................14
5.1.1痰标本报告原则（见表1）..................................................14
5.1.2BAL细胞离心涂片报告......................................................15
5.2报告有临床意义的微生物.......................................................16
5.2.1报告的病原菌.............................................................16
5.2.2培养和涂片相符合时报告的病原菌...........................................16
5.2.3有临床意义的数量.........................................................16
5.2.4报告有临床意义数量的非优势菌.............................................16
5.2.5报告有临床意义数量的优势菌...............................................16
5.3对非致病菌的报告.............................................................17
5.3.1报告“肠杆菌科革兰阴性菌”................................................17
5.3.2报告“非发酵革兰阴性杆菌”...............................................17
5.3.3只生长肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌.........................................17
5.3.4报告“分离到口咽部正常菌群”..............................................17
5.4平板上无细菌生长.............................................................17
5.5结果解释.....................................................................17
附录A（规范性附录）下呼吸道感染主要类型及常见病原体...............................18
附录B（规范性附录）支气管镜采集的标本适合诊断的病原体和检验项目...................19
附录C（规范性附录）常见可疑菌落形态及经典快速鉴定方法.............................20
参考文献............................................................................22
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前言
本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。
本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。
本标准起草单位：卫生部临床检验中心、陕西省人民医院、安徽省立医院、卫生部北京医院、北京
大学人民医院、中国医学科学院北京协和医院、首都医科大学附属北京友谊医院、
解放军总医院、浙江省温州医科大学附属第二医院
本标准主要起草人：胡继红、任健康、马筱玲、胡云建、王辉、徐英春、苏建荣、罗燕萍、李向阳
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引言
1.口咽部定植菌群变化对肺部感染的重要影响
在人类口咽部位定植着大量需氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌等微生物，口腔菌群总数可达1010
CFU/mL～1012CFU/mL。健康人咽部定植细菌最少，咽部需氧的正常菌群主要由革兰阳性菌组成。人体基
础条件的变化会改变咽部定植菌群的种类和数量。长期接触某些携带侵袭性定植菌人群，如日托儿童的
父母的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌定植数量会增加；在免疫抑制、慢性肺病、广谱抗菌药物治疗或住院
患者等人群中，革兰阴性杆菌的优势明显增加。因此，口咽部菌群变化对肺部感染有着重要影响。
2.肺部感染的常见机制
肺部感染的最常见机制是肺泡内吸入了口咽部定植菌，吸入性肺炎患者咽部菌群种类趋向于侵袭性
细菌或耐药细菌，如肺炎链球菌或革兰阴性杆菌。健康宿主吸入口腔定植菌后常无临床症状，细菌通常
被粘液柱状纤维清除。因此，吸入能否引起肺部感染取决于吸入菌的致病性及数量，患者免疫系统和呼
吸道功能等诸方面的因素。
吸入气溶胶引起的肺部感染占第二位，主要原因是使用了不清洁的呼吸机。
血液播散性肺炎占第三位，感染通常造成双肺下叶肺炎。由呼吸道感染引发的菌血症占12%，因此
对肺部感染的高热患者送检血培养，有利于发现肺部感染的病原菌。
3.痰涂片对下呼吸道感染病原菌诊断的重要作用
下呼吸道感染类型及常见病原见附录A。除引起社区非典型肺炎的病原不能常规培养外，其他常见
肺部感染的病原菌均可常规培养方法分离。但培养方法敏感性低，无法判断分离菌的来源。
涂片革兰染色方法对于评价痰标本是否合格、提高病原菌诊断的特异性起到了重要作用。涂片还可
发现培养不能生长的细菌。因此，涂片方法提高了培养方法的特异性及敏感性。
4.支气管纤维镜标本定量培养的临床意义
支气管肺泡灌洗液和保护毛刷标本适合用做定量细菌培养，对菌落数大于阈值的细菌报告下呼吸道
感染的致病菌，特异性达82%～91%，诊断价值远高于痰标本，但因其有创的采集方式而不易获取。支气
管纤维镜采集的标本类型及适合检验项目见附录B。
5.下呼吸道感染细菌培养的局限性
培养结果假阴性的原因大致包括：培养方法不支持所有致病菌生长、采集标本前患者使用了抗菌药
物、延误了送检时间、口腔正常菌群污染了标本等；定量培养的菌落数接近阈值时结果不易解释；而假
阳性报告可因过度解读结果，把非致病菌当作致病菌报告，从而误导医生治疗，也会造成严重后果。
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下呼吸道感染细菌培养操作规范
1范围
本规范旨在为医疗机构微生物实验室推荐常规细菌培养方法检测下呼吸道感染病原菌的检验流程，
既痰（细菌）培养项目。明确了肺部感染患者下呼吸道标本适合诊断的病原和检验项目；要求细菌培养
同时做革兰染色涂片；规范了下呼吸道标本的采集、运送、痰涂片标本合格判断，痰/气管吸出物定性
和气管镜采集标本定量细菌培养程序，病原菌筛查和判断，结果报告的临床意义和格式内容等操作流程。
2术语及定义
2.1
支气管肺泡灌洗液bronchoalceolarlavage；BAL
利用纤维支气管镜向支气管肺泡内注入无菌生理盐水灌洗，抽吸并收集肺泡灌洗液，通过检查其细
胞成份、可溶性物质和感染性病原菌，诊断肺部相关疾病、评价疗效和预后。
2.2
保护毛刷标本protectedspecimenbrushings;PSB
通过纤维支气管镜在亚段支气管处找到脓性分泌物部位，推出双层套管中毛刷远端填塞的聚乙二
醇，伸出毛刷，刷取脓性分泌物，将毛刷退回双层套管取出后，剪下毛刷送检。因操作过程有双层套管
保护，毛刷采集的标本避免了上呼吸道及口腔定植细菌的污染。
2.3
库什曼螺旋纤维Curschmann’sspiralfibers
呈毛虫状蜷曲，革兰染色可见中轴蓝染，边缘淡红色。因慢性炎症时细支气管分泌的粘液浓缩而成。
2.4
夏科雷登结晶Charcot-LeydenCrystal
可见于支气管，为菱形或针状六边形无色透明结晶，其两端尖长，大小不等，折光性强，由嗜酸粒
细胞破裂后嗜酸性颗粒相互融合而成,可用碘染色。可在稍放置的痰中找到嗜酸性粒细胞堆。在对烟曲
菌有变态反应的哮喘患者或肺部感染寄生虫患者的痰液中常见。
2.5
弹性纤维elasticfibers
肺组织有破坏性病变如肺脓肿、肺癌等时，痰中可出现弹性纤维，证明痰液标本来自下呼吸道。
2.6
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纤毛柱状上皮细胞ciliatedcolumnarepitheliumcell
纤毛柱状上皮细胞主要分布在下呼吸道内表面，在柱状细胞的游离面附有能摆动的纤毛，是能分泌
粘液的杯状细胞，分泌的粘液能粘着并清除灰尘和细菌等异物，借助纤毛有节律性的摆动，将含有灰尘、
细菌的粘液排除至喉部。
2.7
肺泡巨噬细胞alveolarmacrophages
来自血中单核细胞，脱落的Ⅱ型肺泡上皮或肺泡间隔细胞。细胞体积大，胞质丰富，核圆形、卵圆
形或肾形，略偏位，染色质细致均匀，偶见核仁，涂片中有巨噬细胞证明痰液标本来自下呼吸道。
3分析前
3.1标本采集
3.1.1咳痰
a)咳痰前，患者用无菌生理盐水漱口；
b)指导患者咳出深部痰，勿留取唾液和鼻咽腔分泌物。
3.1.2气管吸出物
当气管插管的患者出现肺炎症状时，从气管中吸痰留取气管吸出物标本。
注：仅当出现肺炎的临床表现（如发热或浸润）时采集气管吸出物标本，否则勿培养气管吸出物，因气管在插管24h
后即有定植菌，培养结果可能与疾病不符。
3.1.3血培养
当下呼吸道感染患者伴有高热症状时，送检血培养（具体参考血培养标本采集和送检要求）。
3.1.4诱导痰（通常不用于细菌培养）
a)当咳痰困难时，先用湿牙刷清洁口腔粘膜、舌头和牙龈，勿用牙膏；
b)再用无菌水或生理盐水漱口；
c)用超声雾化器，患者吸入约20mL～30mL的3%NaCl后，留取标本。
3.1.5气管镜标本
3.1.5.1采集气管镜标本注意事项
a)气管镜可采集到感染部位高质量的标本，包括支气管肺泡灌洗液标本（BAL）、支气管灌洗液
标本（bronchialwashings,BS)、保护毛刷标本（PSB）及支气管穿刺活检标本，均由呼吸科
医生或经培训医生采集；
b)为防止污染，应采用吸入麻醉剂，勿从工作腔中吸取灌洗液标本；
c)标本采集顺序为：支气管灌洗液（BS）、支气管肺泡灌洗液（BAL），保护毛刷和活检标本，
避免带血。
3.1.5.2支气管肺泡灌洗液标本(BAL)
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用不少于140mL无菌生理盐水灌洗小支气管和肺泡，40mL～80mL回收的灌洗液中包含约1mL支气
管末梢和肺泡中的分泌物；弃去前段可能污染部分，收集其余部分后立即送检。
3.1.5.3保护毛刷(PSB)
保护毛刷因有双层套管保护，不易污染上呼吸道和口腔定植菌。用无菌剪刀剪断毛刷，置于含1mL
生理盐水的无菌容器中（仅供需氧培养），快速送检。
3.2标本运送
用无菌防漏容器收集标本，贴好标本信息（条码）后，在1h～2h内（室温）送至微生物实验室。
注1：若送检标本超过2h，将导致有临床意义的致病菌数量减少，非苛养的口咽部定植菌过度生长。为防止口咽部
正常菌群的过度生长，可将标本放置2℃～8℃环境，但培养分离到肺炎链球菌等苛养菌的机会和数量会减少。
注2：若标本延迟送检超过2h后未冷藏（超过2h～24h，2℃～8℃），应在报告中说明因延误送检标本，可能对培
养结果造成的影响。
3.3筛选并拒收下呼吸道细菌培养标本
a)拒收24h内重复采集的痰细菌培养标本
b)唾液
c)鼻冲洗液和分泌物、鼻孔拭子
d)咽部标本
e)未经保护套管收集的支气管刷培养标本
f)痰的厌氧菌培养标本
注：除支气管穿刺吸出物、PSB、活检标本、胸水或其他未经污染以外的标本做厌氧菌培养均不合格。
g)诱导痰
注：诱导痰标本只适用于检测卡氏肺孢子菌和结核分枝杆菌，对其他病原菌检出效果差。
4分析中
4.1痰及气管吸出物标本处理
4.1.1标本处理要求
a)接种标本及涂片操作必须在Ⅱ级生物安全柜中进行；
b)应在接收后1h内尽快处理所有标本，特别是来自急诊、新入院患者和有创方法采集的标本（如：
BAL和肺活检标本），以保证致病菌的活性，避免造成重复采集标本；
c)使用全自动接种前处理系统的实验室按厂家说明书处理标本，洗痰、液化后自动接种和涂片革
兰染色。
4.1.2接种标本
用无菌拭子挑取脓性或无血部位痰或气管吸出物,分别接种血平板、巧克力平板和麦康凯/中国兰平
板，分区划线后立即培养。
4.1.3培养
将接种的血平板、巧克力平板放二氧化碳培养箱（5%～10%CO2）、麦康凯/中国蓝平板放普通培养
箱，35℃～37℃条件下培养24h～48h，血平板、巧克力平板最好培养至72h。
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4.1.4标本涂片及革兰染色
接种平板后，用刚接种平板的拭子重新挑取脓性或无血部位痰或气管吸出物涂抹玻片，涂片应薄且
均匀（透过涂片部位可看清楚下面印刷品的字迹）。自然干燥或恒温干燥器上干燥后，经甲醇固定（化
学纯，在棕色玻璃瓶或塑料容器中贮存）或火焰快速固定3次，革兰染色，晾干后读片。
注1：革兰染色脱色时间因选用不同的脱色剂而异。1）95%乙醇脱色时间为30s；2）丙酮-乙醇（体积比为3:7,棕
色瓶室温保存，有效期1年）脱色时间1s～5s，脱色效果一致性好；3）丙酮（试剂纯）脱色时间最短，当标
本中含大量宿主细胞时脱色效果好。
注3：使用革兰染色仪染色的实验室按照厂家操作说明书进行，注意条件优化，使涂片染色结果达到满意效果。
4.1.5显微镜观察革兰染色结果
痰涂片在低倍物镜下检测20个～40个视野，气管吸出物涂片分别在低倍镜视野（LPF）和油镜视野
（OIF）下观察。计算有细胞视野的细胞平均数量，记录鳞状上皮细胞（SECs）和多形核白细胞（WBCs)
的数量。
注1：低倍镜下细胞计数：1+（偶见）：少于1个/LPF；2+（少量）：1个～9个/LPF；3+（中量）：10个～25个
/LPF；4+（大量）：大于25个/LPF.
注2：油镜下细菌计数：1+（偶见）：少于1个/OIF；2+（少量）：1个～5个/OIF；3+（中量）：6个～30个/OIF；
4+（大量）：大于30个/OIF.
4.2气管镜标本处理
4.2.1支气管肺泡灌洗液定量培养
4.2.1.1混匀标本
用力涡旋震荡BAL标本30s～60s。
4.2.1.2平板计数（102CFU/mL）
用经校准的加样器（或经验证的10μL接种环）取10μlBAL标本，分别点种血平板和巧克力平板(已
回复至室温），再用灭菌L型玻棒涂布平板。培养后菌落计数：菌落数=相同形态菌落数×100CFU/mL。
4.2.1.3平板计数（103CFU/mL）
方法1：用1μL定量接种环（经验证）取1环BAL标本，分别接种血平板和巧克力平板，用无菌L
型玻棒涂布平板；培养后菌落计数：菌落数=相同形态菌落数×103CFU/mL。
方法2：取1只标记“1:100”含5ml磷酸缓冲液（PBS）试管，加入50μlBAL原液标本，涡旋震
荡；再从中取100μl分别接种血平板和巧克力平板，用灭菌L型玻棒涂布平板。
注1：磷酸缓冲液配制：0.067mol/LNa2HPO370ml与0.067mol/LKH2PO330ml混合（pH7.2),高压灭菌后使用。
注4：若用接种环密涂平板，生长的菌落数量会低于实际数量。但用L棒涂布平板计数，定量培养结果更准确。
4.2.1.4平板计数（105CFU/mL）
取1只标记“1:104”含5mlPBS试管，加入50μL经1:100稀释的标本（见4.2.1.3方法2），
涡旋震荡；从中取100μL分别接种血平板和巧克力平板，用灭菌L型玻棒涂布平板；培养后菌落计
数：菌落数=相同形态菌落数×103CFU/mL。
4.2.2保护毛刷定量培养
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4.2.2.1混匀标本
将1mL带毛刷的标本管用力涡旋震荡30s～60s。
4.2.2.2平板计数（10CFU/mL）
用加样器取100μL标本分别接种血平板和巧克力平板，用无菌L型玻棒涂布平板，培养后菌落计数：
菌落数=相同形态菌落数×10CFU/mL。
4.2.2.3平板计数（102CFU/mL）
用加样器取10μL标本（或用10μL接种环）分别接种血平板和巧克力平板，用无菌L棒涂布平板，
培养后菌落计数：菌落数=相同形态菌落数×102CFU/mL。
4.2.2.4平板计数（103CFU/mL）
方法1：用1μL接种环取1环PSB标本，分别接种血平板和巧克力平板，用无菌L棒涂布平板；
方法2：取1只标记“1:100”的装有5mL磷酸缓冲液试管，加入50μLPSB原液标本，涡旋震荡，
从中取100μL分别接种血平板和巧克力平板，用无菌L型玻棒涂布平板；
培养后菌落计数：菌落数=相同形态菌落数×103CFU/mL。
4.2.3接种其他培养基并培养
完成血平板和巧克力平板稀释涂碟后，可取100μLBAL标本或PSB标本接种麦康凯或中国蓝培养基。
培养步骤同4.1.3；对有创方式采集的肺组织标本应延长培养至4天。
4.2.4革兰染色标本处理
在完成标本定量培养后，取适量BAL标本进行细胞离心；保护毛刷标本可直接涂片。经自然干燥、
甲醇固定或火焰快速固定3次，革兰染色。
4.2.5剩余BAL标本可用于其他病原检测
对剩余BAL标本离心后，可根据需要进行病毒、分枝杆菌、军团菌和真菌培养；或做病毒、卡氏肺
孢子菌、抗酸染色和真菌涂片染色（见参考文献4的第六篇相关章节）。
4.3连续培养并观察慢生长菌
观察定性培养18h～24h后的平板,为检出可能生长的丝状真菌、慢生长菌、苛养的革兰阴性杆菌如
博德特菌属(Bordetellaspp.)，平板在检查后继续培养至48h后，再观察培养48h的平板，可能发现培
养24h未发现的细菌形态。
4.4分离并鉴定下呼吸道重要致病菌（参见附录C）
4.4.1链球菌属
4.4.1.1β-溶血链球菌
a)检查β-溶血菌落并鉴定触酶阴性且呈链状或成对排列的球菌；
b)用吡咯烷酮芳胺酶（PYR）试验鉴定化脓链球菌；或密涂后粘贴杆菌肽纸片（0.04U/片），35℃
过夜培养，若有抑菌环，则报告化脓链球菌，任何数量均应报告；
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c)患儿标本检查是否有窄溶血环，并鉴别B群链球菌（无乳链球菌），若CAMP试验（金黄色葡
萄球菌）阳性，则任何数量均应报告；
d)鉴定其他有临床意义数量的优势生长β-溶血链球菌；
注：不必报告小菌落的β-溶血链球菌或F群链球菌，这类菌均为上呼吸道正常菌群。
4.4.1.2肺炎链球菌
鉴别草绿色链球菌和肺炎链球菌，检查形态与肺炎链球菌相似的α-溶血菌落，做以下试验：
a)胆汁溶菌试验：在菌落上滴10%去氧胆酸钠溶液1滴，置35℃15min～30min后，若菌落溶解，
报告“肺炎链球菌”；若菌落不溶解，则用奥普托辛（optochin,OP）敏感试验再确认。
b)OP敏感试验：将菌落密涂于血平板，粘贴OP纸片（5μg/片），经35℃、5%CO2环境过夜培养，
若出现抑菌圈（直径大于14mm判为敏感），报告“肺炎链球菌”；
c)药敏试验：快速挑起相似菌落，做药敏试验；同时粘贴OP纸片确认纯度，以检查药敏结果是
否混有其他草绿色链球菌（污染菌）。
注：存在对胆汁耐受或对奥普托辛耐药的肺炎链球菌株，将这两个试验联合检测可减少错误报告。
4.4.2苛养革兰阴性杆菌（在麦康凯平板上难生长）
4.4.2.1流感嗜血杆菌
流感嗜血杆菌是只生长在巧克力平板上的球杆菌，在血平板上不生长，但在葡萄球菌周围可呈卫星
状生长。血平板卫星阳性（菌落不溶血）、MH平板卫星试验阴性可判断是流感嗜血杆菌，也可做ALA
（aminolevulinicacid）试验确认，并做β-内酰胺酶试验。
4.4.2.2博德特菌属
有重要临床意义的博德特菌在血平板上生长，触酶和脲酶均为阳性，培养48h出现肉眼可见菌落。
4.4.2.3其他苛养革兰阴性杆菌
除非呈优势生长或数量很多，通常无需鉴定其他苛养的革兰阴性杆菌，如艾肯菌属，因这些均为上
呼吸道正常菌群，很少引起呼吸系统疾病。
4.4.3革兰阴性双球菌
a)检测有意义数量的、用接种环可推移的菌落，按表1确认是卡他莫拉菌，90%以上卡他莫拉菌
株的β-内酰胺酶试验为阳性。
b)检查巧克力平板上氧化酶阳性的任何菌落，并在血平板上不生长或生长不良，按表1确认鉴定
脑膜炎奈瑟菌，无需常规做药敏试验。
4.4.4革兰阴性杆菌（在麦康凯平板上生长良好）
a)若只生长了一种细菌并达到了有临床意义的数量，而无其他致病菌，通过初步试验筛查，此菌
若为肠杆菌科细菌特别是肺炎克雷伯菌，需做鉴定和药敏试验；
b)对于住院患者，不管是否有其他病原菌，检查有意义数量的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、洋
葱伯克霍德菌和嗜麦芽窄食单胞菌，因这些菌是典型的多重耐药菌，可造成医院内流行。
c)若生长一种以上其他等量的革兰阴性杆菌，做初步试验，并报告（如：吲哚、氧化酶、在麦康
凯平板上的气味和形态、菌落色素和克氏双糖试验的结果）。
4.4.5葡萄球菌属
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a)若革兰染色显示占优势的成堆球菌与白细胞相关，而无其他有意义数量的致病菌，只对有临床
意义数量的金黄色葡萄球菌进行鉴定。
b)若是住院患者，依照感染控制原则，即使少量菌也应用头孢西丁检测苯唑西林是否耐药。
c)仅当凝固酶阴性葡萄球菌在平板上呈90%以上生长纯度时，才需鉴定到种水平和/或做药敏试
验，其他葡萄球菌均为呼吸道正常菌群。
4.4.6肠球菌属
a)生长肠球菌则无需报告，除非生长数量达90%以上纯培养，用初步生化试验鉴定确认。
d)很多革兰阳性球菌是呼吸道正常菌群，PYR阳性甚至胆汁七叶苷和亮氨酸肽酶（leucine
aminopeptidase，LAP）阳性。
4.4.7革兰阳性杆菌
a)排除任何数量来自免疫抑制患者的奴卡菌属和马红球菌（粘液样菌落、脲酶阳性）；
b)如有大芽孢革兰阳性菌，排除炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；
c)有限地鉴定棒状杆菌，当出现下列任何情况的大量优势菌生长时，再使用鉴定革兰阳性杆菌的
商品试剂盒：
1)当菌株快速脲酶试验阳性时（假白喉棒状杆菌、假结核棒状杆菌脲酶阳性）
2)标本来自ICU的插管患者
d)通常，其他革兰阳性杆菌不引起肺炎，故不必鉴定。
4.4.8鉴定丝状真菌
a)对分离到的丝状真菌做鉴定（除外实验室或环境污染的霉菌，如青霉菌）（见参考文献4之第
六篇第五节）；
注：从培养超过48h的平皿上分离双相真菌（如荚膜胞浆菌和球孢子菌），或酵母样菌落形态；
b)检查陈旧培养物以排除新生隐球菌，无需进一步鉴定其他酵母样真菌；
注：念珠菌通常不会引起肺炎，除非是肿瘤患者（如：白血病）、肺移植患者或新生儿。酵母菌属于口腔正常定植
菌群，即使从下呼吸道标本中分离到念珠菌，不管是什么种，都与疾病无关，除非有组织病理学证据。
4.4.9涂片时可见但培养不生长的细菌
如果涂片时可见细菌，但培养后未见细菌生长，可能因使用了抗菌药物引起的；但也不能排除可能
存在军团菌、百日咳博德特菌和分枝杆菌。实验室应及时与临床联系，扩大标本送检的培养范围。
4.5质量控制
4.5.1革兰染色
a)应对新购置或新批号的商品化革兰染色试剂做室内质控，常规质控频率为每周1次；
b)革兰染色阳性质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923，深紫色球菌为合格；
c)革兰染色阴性质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922，红色杆菌为合格。
4.5.2抗酸染色
a)应对新购置或新批号商品化抗酸染色试剂做室内质控，常规质控频率为每周1次；
b)抗酸染色阳性质控菌株：结核分枝杆菌ATCC25177（弱毒株），红色分枝状杆菌为合格；
注：或用快生长分枝杆菌作为阳性质控菌株。
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c)抗酸染色阴性质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922，蓝色杆菌为合格。
4.5.3培养基
4.5.3.1血平板
购买或自制的5%羊血平板每批次做室内质控的菌株：
a)化脓链球菌ATCC19615，β-溶血，生长良好为合格；
b)肺炎链球菌ATCC49619，α-溶血（草绿色溶血），菌落中间凹陷的典型菌落特征为合格。
4.5.3.2巧克力平板
购买或自制的巧克力平板，每批次做室内质控的菌株：流感嗜血杆菌ATCC49247，生长饱满、典型
的湿润、半透明菌落为合格。
4.5.4试剂
4.5.4.1每批号、每周需做质控的试剂
a)奥普托欣（OP）纸片（5mg/片）：质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619，抑菌圈>14mm为合格。
b)杆菌肽纸片（0.04U/片）：质控菌株为化脓链球菌ATCC19615，形成抑菌圈为合格。
c)PYR试验：质控菌株为化脓链球菌ATCC19615，桃红色为合格。
4.5.4.2每批号、每次试验需做质控的试剂
a)3%过氧化氢（触酶试验）：阳性对照菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923，产剧烈气泡；阴性对
照菌株为粪肠球菌ATCC29212，不产气泡或缓慢产生少量气泡。
b)兔血浆或乳胶凝集试剂（凝集因子试验、玻片法凝固酶试验）：阳性对照菌株为金黄色葡萄球
菌ATCC25923，呈不规则块状凝集，阴性对照菌株为表皮葡萄球菌ATCC12228，不凝集。
c)兔血浆或乳胶凝集试剂（凝固酶试验、试管法凝固酶试验）：质控菌株同b),经4h孵育，阳
性对照菌呈凝胶胨状；阴性对照菌呈液状。
注：常规做凝固酶试验时应使用EDTA抗凝兔血浆，当玻片法试验为阴性结果时，应再做试管法确认，因有10%～15%
的金黄色葡萄球菌株的玻片法凝固酶试验呈阴性。
d)1%盐酸四甲基对苯二胺（氧化酶试验）：阳性对照菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853，10秒钟内
产蓝紫色；阴性对照菌株为大肠埃希菌ATCC25922，不变色。
e)头孢硝噻吩（nitrocefin)（β-内酰胺酶试验）：阳性对照菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213，
产粉红色；阴性对照菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923，不变颜色。
5分析后报告结果
5.1革兰染色报告
5.1.1痰标本报告原则（见表1）
a)白细胞和优势菌（不粘附在鳞状上皮细胞上）有助于预测肺部致病菌，应该报告；
b)每个油镜视野可见大于10个或小于10个单一形态细菌并与白细胞相关（在白细胞周围，特别
是位于白细胞内的细菌），有助于预测肺部致病菌，应该报告；涂片中少于1个菌/20个油镜
视野的少量细菌不必报告；
c)虽然由两种致病菌同时引起的感染不常见，但当两种形态的细菌均与白细胞相关时也应报告；
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d)即使涂片未见细菌时仍有助于评价患者状况，可能隐藏着某些特殊菌，如军团菌、内源性真菌、
结核分枝杆菌或其他可引起非典型肺炎的致病菌；
e)质量合格的标本中，涂片有正常菌群及多种细菌（通常白细胞内有空泡或液泡），提示有吸入
性肺炎，应该报告。
表1痰/气管吸出物标本涂片革兰染色结果解释
指征解释
痰
大于10个SECs/LPF
标本包含唾液和上呼吸道分泌物，报告“大于10个鳞状上
皮细胞/低倍视野，提示标本被唾液污染，不继续培养”
支气管吸出物
成人患者：大于10个SECs/LPF或未见细菌；
患儿：未见细菌
不继续培养，报告“标本污染或未见细菌，需重送标本”
未见细菌，但WBCs数量达到4+，并可见纤维细胞时，建
议重新涂片做吖啶橙染色，用荧光显微镜观察确认弹性纤
维上是否有细菌；假单胞菌属和嗜血杆菌属细菌因与弹性
纤维不易区分，涂片时可能漏检；还可见军团菌，此类感
染中多形核白细胞不常见。
少于10个SECs/LPF，大量多形核白细胞(大于25个
WBCs/LPF)，存在肺泡巨噬细胞和柱状上皮细胞
提示合格的深部痰标本，可培养
大于25个WBCs/LPF，小于25个SECs/LPF;
或WBCs:SECs大于10:1,单一形态的细菌量达到3+～4+
可接受标本并培养
大量多形核白细胞
提示感染；对于免疫抑制患者或粒细胞缺乏患者即使未见
白细胞，但无鳞状上皮细胞，仍提示可疑感染，可培养。
胞内细菌提示感染
弹性蛋白或胶原纤维、库什曼螺旋纤维、坏死的白细胞提示感染
淀粉样小体（corporaamylacea）见于长期迁延的呼吸道疾病，如慢性阻塞性肺病（COPD）
粉色絮状物提示呼吸道疾病治疗产生的雾化高渗盐水
夏科雷登结晶提示过敏性肺曲霉菌病
大量多形核白细胞，白细胞内或外主要见：
革兰阳性球菌成对或成短链排列可疑肺炎链球菌性肺炎
革兰阳性球菌成堆排列可疑金黄色葡萄球菌性肺炎
革兰阴性双球菌可疑卡他莫拉菌局限性肺炎
革兰阴性小球杆菌可疑流感嗜血杆菌性肺炎
革兰阴性椭圆杆菌可疑克雷伯菌或其他肠杆菌科细菌引起的肺炎
大量多形核白细胞，大量革兰阴性小杆菌、球杆菌，革兰
阳性链球菌及其他不同形态的细菌
需在报告中特别提示：吸入性肺炎，因培养结果会显示只
生长正常菌群
出芽的酵母样孢子和假菌丝通常提示鹅口疮或上呼吸道酵母菌感染，并非肺炎，仅当
其为主要所见菌时报告
其他异常结构，如真菌、分枝的革兰阳性丝状杆菌或异形
状细菌（可能是抗菌药物治疗的结果）
请高年资实验人员确认，可能需补充实验如：抗酸染色等
5.1.2BAL细胞离心涂片报告
若是细胞离心机制作的BAL标本涂片革兰染色，检测敏感度为105个细胞/mL或104个细胞/mL,若每个
油镜视野可见1个或多个细菌，报告革兰染色形态及白细胞结果，提示此细菌与活动性肺炎相关。
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5.2报告有临床意义的微生物
5.2.1应报告的病原菌
a)化脓链球菌
b)B群β-溶血链球菌（儿童）
c)博德特菌属，特别是支气管博德特菌
d)奴卡菌属
e)新生隐球菌
f)弗朗西斯土拉菌（高致病菌）
g)鼠疫耶尔森菌（高致病菌）
h)炭疽芽孢杆菌（高致病菌）
i)丝状真菌（排除腐生菌污染）
5.2.2培养和涂片相符合时报告的病原菌
处理培养物应参考涂片的结果，应根据革兰染色所见炎症细胞和细菌的形态与培养物进行对照，当
培养与涂片结果不相符时应重新读片。
当培养生长的细菌在涂片中亦和炎症细胞相关时，报告以下两种病原菌：
a)肺炎链球菌，并报告药敏结果
b)流感嗜血杆菌，常规报告β-内酰胺酶
5.2.3有临床意义的数量
a)定性培养生长的病原菌数量达到以下情况时，判断为有临床意义：
1)在平板第2区划线仍大量生长，或培养物生长量超过1/4平板；
2)培养中少量生长且革兰染色涂片可见此形态细菌与炎症细胞相关联的病原菌；
3)在平板划线第1区生长且纯度超过90%以上时，同时革兰染色涂片可见此形态细菌与炎症
细胞相关的病原菌。
b)定量培养有临床意义的数量：
1)BAL：菌落计数大于或等于104CFU/mL
2)PSB：菌落计数大于或等于103CFU/mL
注：取最高稀释度平板，分别对不同菌落形态的细菌计数，乘上稀释倍数即为菌落数。
5.2.4报告有临床意义数量的非优势菌
当培养达到5.2.3所示有临床意义的数量时，即使非优势菌也应报告的病原菌：
a)卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌，常规报告β-内酰胺酶；
b)只对住院患者报告的病原菌有：
1)铜绿假单胞菌，并报告药敏结果
2)嗜麦芽窄食单胞菌，并报告药敏结果
3)不动杆菌属，特别是鲍曼不动杆菌，并报告药敏结果
4)洋葱伯克霍德菌，并报告药敏结果
5.2.5报告有临床意义数量的优势菌
生长菌达有临床意义数量的优势菌，特别当涂片提示分离菌与多形核白细胞相关时报告的病原菌：
a)金黄色葡萄球菌，并报告药敏结果
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b)B群β-溶血链球菌（成人）、C群或G群β-溶血链球菌
c)单一形态革兰阴性杆菌（特别是肺炎克雷伯菌），并报告药敏结果
d)苛养的革兰阴性杆菌，通常报告β-内酰胺酶
e)脲酶阳性的棒状杆菌或来自ICU的患者
f)分离自免疫抑制患者的马红球菌
5.3对非致病菌的报告
5.3.1报告“肠杆菌科细菌”
在麦康凯平板上生长1种以上的革兰阴性杆菌，经氧化酶阴性、乳糖产酸等试验初步鉴定为肠杆菌
科细菌，报告：经鉴定生长“肠杆菌科细菌”。
5.3.2报告“非发酵细菌”
在麦康凯平板上生长1种以上的革兰阴性杆菌，经氧化酶阳性、克氏双糖铁上不发酵葡萄糖等试验
初步鉴定，报告：经鉴定生长“非发酵细菌”。
5.3.3只生长肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌
若只生长肠球菌属和/或凝固酶阴性葡萄球菌（有或无酵母样真菌），报告“革兰阳性球菌混合生
长”;若培养物纯度达90%以上，则做初步鉴定到属水平并分别列出。
5.3.4报告“分离到口咽部正常菌群”
若未分离到致病菌，对分离的：草绿色链球菌和/或非致病奈瑟菌、类白喉菌、凝固酶阴性葡萄球
菌、罗斯菌属（Rothiaspp.)、F群链球菌、厌氧菌、嗜血杆菌属（非流感嗜血杆菌）、艾肯菌属、放
线杆菌属、嗜二氧化碳菌、莫拉菌属、肠球菌属、酵母样真菌，和未达到有意义数量的金黄色葡萄球菌
（如果医院感染控制要求可做药敏试验）、革兰阴性杆菌及脑膜炎奈瑟菌，均报告：“分离到口咽部正
常菌群”（可列出相应菌属）。
5.4平板上无细菌生长
如任何平板上无细菌生长，报告“无细菌生长”。出现此种情况可能是使用抗菌药物抑制了正常菌
群等原因。
5.5结果解释
a)尽管培养到的肺炎链球菌或流感嗜血杆菌可能是定植菌，因而导致报告了假阳性结果，但通常
仍在临床报告中提示分离菌是可疑致病菌。
b)培养生长的革兰阴性杆菌或金黄色葡萄球菌是优势菌，且涂片也提示这些形态的细菌与感染相
关时才报告。
c)培养阴性时也不能排除患者的下呼吸道感染，因培养的阳性率低，经常分离不到致病菌。
d)多数医生认为对通气相关肺炎和院内感染肺炎患者做气管吸出物或痰培养对临床诊断有帮助。
e)通常治疗社区获得性肺炎使用青霉素类抗菌药物，如阿莫西林或阿莫西林/棒酸、一种氟喹诺
酮类、一种大环内酯类抗菌药物，或联合抗菌药物治疗。
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AA
附录A
（规范性附录）
下呼吸道感染的主要类型及常见病原体
类型/免疫状态最常见病原体少见病原体
社区获得性典型肺炎1肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，肺炎克雷伯菌金黄色葡萄球菌，卡他莫拉菌，脑膜炎
奈瑟菌
社区获得性非典型肺炎2肺炎支原体，呼吸道病毒，流感病毒，肺炎衣原体，
军团菌属
沙眼衣原体，结核分枝杆菌，真菌等
吸入性肺炎厌氧菌，金黄色葡萄球菌，需氧革兰阴性杆菌
医院获得性肺炎革兰阴性杆菌(肠杆菌属/克雷伯菌属/不动杆菌属
/假单胞菌属)，金黄色葡萄球菌，厌氧菌，社区获
得性肺炎的典型菌
军团菌，肺炎链球菌
血液播散性肺炎金黄色葡萄球菌，链球菌需氧革兰阴性杆菌
免疫抑制宿主条件致病菌
感染性肺炎
社区获得性肺炎典型菌，奴卡菌属，念珠菌属，条
件致病真菌，曲霉菌
环境暴露3引起的肺炎结核分枝杆菌、军团菌属、双相真菌、曲霉属、肺
炎支原体、肺炎衣原体
鼻疽假单胞菌，假鼻疽假单胞菌，鼠疫
耶尔森菌，贝纳柯克斯体、图拉热弗朗
西斯菌
急性气管炎病毒，百日咳博德特菌，肺炎支原体和肺炎衣原体
注1：肺炎链球菌和流感嗜血杆菌是引起儿童和老年人肺炎的最常见致病菌；卡他莫拉菌、脑膜炎球菌多发于基础
病患者或病毒感染后的继发感染；金黄色葡萄球菌肺炎可引发肺脓肿；肺炎克雷伯菌大叶性肺炎常合并脓肿
或肺粘连，死亡率较高。
注2：通常可用分子生物学方法快速诊断，也可在感染后期用血清学方法检测肺炎支原体、肺炎衣原体和军团菌属
抗体确诊。由生物恐怖病原菌，如鼠疫耶尔森菌引起的感染，血清学检测可作为辅助诊断方法。结核分枝杆
菌可用罗氏培养基或快速结核杆菌液体培养仪培养，或分子诊断方法检测。
注3：暴露在特殊气溶胶环境：与飞沫有关的结核分枝杆菌、与尘暴和鸟排泄物有关的双相真菌等。
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BB
附录B
（规范性附录）
支气管镜采集的标本适合诊断的病原和检验项目
标本类型适合诊断的病原菌推荐试验
支气管灌洗液（BS）1
只用于诊断由严格致病菌引起的肺炎，如
结核分枝杆菌、军团菌属、内源性真菌
1.用选择性培养基分离培养分枝杆菌、真菌
2.并做真菌涂片和抗酸染色
3.直接荧光抗体法（DFA）检测军团菌和肺孢子菌
保护毛刷标本（PSB）只用于诊断细菌性肺炎1.定量细菌培养
2.革兰染色
支气管肺泡灌洗液
（BAL）2
适用于检测条件致病菌引起的肺部感染
的所有试验
1.定量细菌培养
2.分枝杆菌培养和抗酸染色染色
3.真菌培养和染色
4.直接荧光抗体法检测病毒
5.直接荧光抗体法检测肺孢子菌
注1：BAL适用于诊断：机械通气相关肺炎、免疫低下患者肺炎、慢性阻塞性肺病（COPD），ICU病房重症患者、经
抗菌药物治疗未获改善者、艾滋病患者、痰检阴性、疑似肺结核或支气管结核者等。
注2：BS来自主气道，从外观上无法与BAL区别,含有上呼吸道污染菌。
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附录C
（规范性附录）
常见可疑菌落形态及经典快速鉴定方法
细菌可疑鉴定附加试验、最终鉴定特殊要求
化脓链球菌
（A群）
1.G+链球菌，成对
2.触酶阴性
3.溶血
4.菌落直径>0.5mm，边缘明显
PYR阳性用血清学方法确认
无乳链球菌
（B群）
1.G+链球菌，成对
2.触酶阴性
3.透明菌落小溶血环
CAMP阳性
或马尿酸水解阳性
若用侵入性方法采集的标本或菌落不
溶血，需确认马尿酸水解试验、PYR（阴
性）、CAMP或血清学结果
草绿色链球菌群1.G+链球菌
2.触酶阴性
3.α-溶血
4.胆汁溶菌阴性或菌落发白
PYR阴性
肺炎链球菌1.G+矛头状双球菌
2.触酶阴性
3.α-溶血
胆汁溶菌阳性
或荚膜肿胀阳性
若胆盐不溶菌但菌落典型，需确认OP
敏感。
流感嗜血杆菌1.G-球杆菌
2.巧克力平板24h生长良好但血平
板上不生长，但血平板上葡萄球菌
周围呈卫星生长
卟啉ALA阴性非致病性溶血嗜血杆菌在马血、兔血和
羊血上呈β-溶血，ALA阴性，因自身
溶血可在血平板上独立生长。弗朗西斯
吐拉菌（高致病菌）在巧克力板上48h
生长更小的菌落，血平板上不生长。
侵蚀艾肯菌1.G-杆菌
2.氧化酶阳性
3.触酶阴性
4.MAC平板上不生长
5.不溶血
有漂白粉味道
鸟氨酸阳性
卡他莫拉菌1.G-双球菌
2.氧化酶阳性
3.在血平板上推菌落可移动
丁酸盐试验阳性将革兰染色形态“双球菌”与其他莫拉
菌的“球杆菌”区别
脑膜炎奈瑟菌1.G-双球菌
2.氧化酶阳性
3.血平板上生长
糖发酵仅葡萄糖和麦
芽糖阳性或用奈瑟菌
属试剂盒鉴定
应在Ⅱ级生物安全柜中处理可疑脑膜
炎奈瑟菌培养物
铜绿假单胞菌1.氧化酶阳性
2.吲哚阴性
3.生姜气味
若无水果气味，蓝绿
色色素可判断
若无水果气味或蓝绿色色素，有绿色、
荧光色素，42℃生长。
荧光假单胞菌腐
败假单胞菌
1.氧化酶阳性
2.吲哚阴性
有荧光，但无气味或
42℃生长
明胶或卵磷脂试验鉴别
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常见可疑菌落形态及经典快速鉴定方法（续表）
细菌可疑鉴定附加试验、最终鉴定特殊要求
金黄色葡萄球菌1.触酶阳性
2.G+球菌，成堆
3.试管法/玻片法或乳胶凝集试验
阳性
需试管法凝固酶试验
确认
凝固酶阴性葡萄
球菌
1.触酶阳性
2.G+球菌，成堆
3.试管法/玻片法或乳胶凝集试验
阴性
菌落不黏
对于玻片法凝固酶试验阴性菌株，需再
做试管法凝固酶试验确认；达90%以上
生长纯度时才继续鉴定到种水平和/或
做药敏试验
肠球菌属1.G+链球菌，成对
2.触酶阴性
3.不溶血
PYR阳性
溶血菌落可能是A群
链球菌，若溶血肠球
菌是胆汁七叶灵阳性
若菌落溶血、胆汁七叶苷阳性是肠球菌
芽孢杆菌属（及
相关有芽孢菌
属）
1.G+大杆菌
2.触酶阳性
3.有芽孢
动力（无动力则检测
炭疽芽孢杆菌）
蜡样芽孢杆菌群（非炭疽芽孢杆菌）为
β-溶血及青霉素耐药，菌落直径>1μm
棒状杆菌属1.G+杆菌,不大
2.触酶阳性
3.不溶血
4.无色素
5.无动力
无分枝，或部分菌体
抗酸染色阳性
试剂盒APICORYNE棒状杆菌有助于鉴
定到种水平
奴卡菌属1.G+细长，分枝，串珠状，丝状菌；
2.或染色不规则杆菌；
3.培养物涂片多形分枝球状
改良抗酸染色法，部
分菌体抗酸染色阳性
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参考文献
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6Roson,B.,J.Carratala,R.verdaguer,J.Dorca,F.Manresa,andF.Gudiol.2000.Prospectivestudyof
sputumGramstainintheinitialapproachtocommunity-acquiredpneumoniarequiring
hospitalization.Clin.Infec.Dis.31:869-874.
7Gleckman,R.,J.DeVita,D.Hibert,C.Pelletier,andR.Martin.1988.Sputumgramstainassessment
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