神经修复GDNF－RET与Rap1GAP互生功能实验研究
本文作者龙军徐庆怀武玉华
（作者单位系中国科学院院生物基因医学研究所、解放军医学科学院、中华脑科康复医学研究会）
【内容提要】：胶质细胞外源性神经营养因子GDNF受体RET是在近年来发现的一种对正常神经细胞有营养作用,对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子,它可维持交感神经和感觉神经的生存,促进神经细胞的分化,决定轴突的伸展方向，对促进大脑的发育,神经系统的生长,损伤神经的再生和功能恢复具有决定性作用。GDNF受体RET被配体激活后,募集一系列信号分子,从而进行下游信号转导。RET受体和其它RTK类受体一样,经过经典的内化途径将受体复合物转运到细胞内传递营养信息,发挥生物学效应。RET与分子Rap1GAP入胞化的囊泡进入神经细胞核内，通过直接修复受损神经元部位，对异常受损神经元、神经组织进行修复激活，促使其达到正常传导功能，从而提高患者神经发育值，可以有效改善脑性瘫痪患者的运动障碍、语言障碍、感知障碍等。本研究发现Rap1GAP一方面可以抑制GDNF下游的Rap1/ERK途径活化,另一方面,Rap1GAP和RET受体结合后反馈作用于上游受体RET,抑制RET内化转运过程。Rap1GAP是GDNF/RET下游重要负性调节因子,Rap1GAP抑制RET受体内化的方式在其负性调控GDNF诱导的细胞生长、存活、分化效应过程中发挥重要作用。
【研究目的】：胶质外源性神经细胞GDNF是神经系统发育过程中特殊的细胞群,能够在适当的微环境中分化产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的一类多能干细胞。本实验室建立稳定的、标准化的神经干细胞的体外培养方法，探讨C6胶质细胞诱导神经干细胞分化的影响,并对其调控机制进行初步探索，将为神经干细胞的分化及其调控机制奠定实验基础。
【研究结果】：GDNF受体RET与分子Rap1GAP结合迅速促进神经细胞分化效应，可直接激活神经生长及正常的传导功能。
【关键词】：脑损伤神经修复GDNF－RET与Rap1GAP结合作用
【研究方法】：
一、建立大鼠胶质神经细胞的培养
确定一个新的RET受体结合蛋白Rap1GAP，采用神经球培养来制备神经干细胞，培养的细胞是异质性群体，包含神经干细胞以及分化的神经细胞。胶质细胞外源性神经营养因子GDNF培养是研究中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)发育及衰老相关的分子和细胞学机制的重要手段，也是细胞替代疗法治疗CNS疾病的来源之一。原代培养神经干细胞一般取胚胎为14d左右大、小鼠脑皮质、海马和室下区或成年小鼠的海马齿状回。由于细胞扩增率不高，短期内难以获得大量的神经干细胞，GDNF－RET与Rap1GAP等合成了融合编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(epidermalgrowthfactor-histidine，EGF-His)以及聚苯乙烯黏合肽(EGF-polystyrene，EGF-PSt)的表皮生长因子。这种生长因子能够分别表面锚定到镍螯合的玻璃板和聚苯乙烯培养介质中高选择性、快速、大量地扩增神经干细胞。
二、测试神经细胞相互作用的因素
选取孕龄17-18天Wistar大鼠,体式显微镜下,无菌取胎鼠脑纹状体组织,采用机械吹打和胰酶消化方法将组织块制备成单细胞悬液,神经干细胞专用培养基(Neuralbasalmedium,NB)(含EGF40ng/ml、2%B27等成分),37℃、5%CO2孵育培养。观察光镜下细胞生长及自然分化特征。并采用免疫荧光检测巢蛋白(Nestin)、β-tubulinⅢ、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及少突胶质细胞标志物(O_4)的表达。研究发现随着年龄增长，小鼠前脑SVZ区祖细胞的增殖和嗅球内神经生成降低，同时多能前脑祖细胞数和自我更新潜能也下降。这些改变与p16Ink4a达增加有关，与细胞衰老有关的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependentkinaseinhibitor，CDKI)。衰老的p16Ink4a缺陷小鼠，其SVZ的祖细胞增殖、嗅球内神经生成以及多能前祖细胞数和自我更新潜力均有明显的轻度下降。但GDNF－RET与Rap1GAP并没影响齿状回或肠神经系统的祖细胞功能，部分是由p16Ink4a表达增加导致的，可增强神经干细胞的自我更新能力。
三、鉴定外源性神经细胞的相互作用及功能
为研究碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、脑源性神经营养因子以及睫状神经营养因子GDNF－RET与Rap1GAP对神经干细胞增殖和分化的影响，这些融合蛋白生长因子以单一因子或两种因子组合，微阵列于镍离子功能化芯片上。在此芯片上培养神经干细胞，显示这5种生长因子单一作用均对神经干细胞行为有明显影响。而加入2种不同生长因子，其对神经干细胞行为的影响并非它们各自单一作用的简单叠加，随着其中2种生长因子组合的不同，其作用可表现为竞争、协同或破坏，甚至可能完全不同于单一因子原有的作用。表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等丝裂原信号在神经干细胞的增殖和分化中起重要作用，均可以维持神经干细胞的自我更新能力。其他神经因子如血小板生长因子、脑源性神经营养因子、白细胞介素和淋巴细胞抑制因子等在神经干细胞的分化过程中主要起协同作用。
【结果分析】：实验发现，GDNF－RET与Rap1GAP神经细胞在不同微环境下可发育为不同的神经干细胞，甚至发生横向分化，而且干细胞所处的微环境也随着时间、空间问时刻在变化。神经干细胞移植至骨髓环境中可去分化成有造血潜能的前体细胞，并在合适的条件下向肌细胞分化。GDNF－RET与Rap1GAP等将神经干细胞移植到成年偏侧帕金森病模型鼠的双侧纹状体，结果神经干细胞在病损侧比健侧更易分化为多巴胺能神经元，即多巴胺DA耗竭的纹状体区提供了更有利于神经干细胞分化为多巴胺神经元的微环境。GDNF－RET与Rap1GAP及神经干细胞的分离、鉴定、纯化以及体外长时程培养的技术已趋于成熟，尽管离体环境和在体环境差别很大，但体外培养的神经干细胞移植仍然具有很高的临床应用价值。其治疗作用不仅体现在分化生成新的神经元和神经胶质细胞，神经干细胞还可分泌有利于受损神经元修复的神经营养性因子，促进神经元生长，并且在离体培养时，与神经干细胞共培养的静息神经细胞能够重新获得干细胞样能力，即分裂增殖出新的神经球和分化为神经元与神经胶质细胞。新生神经细胞活力及代谢能力强，能够及时清除代谢废物，保持神经干细胞活性，从内部使神经干细胞数量和功能相对提高，同时促进了脑肿瘤干细胞的增殖。
【研究结语】本研究成功建立大鼠神经干细胞的体外培养体系,可以维持神经干细胞保持高度增殖及不发生自我分化的特性。由此推测,C6胶质瘤细胞可分泌某种因子通过bHLH家族转录因子调控机制诱导神经干细胞向神经元分化，外源性信号调控GDNF－RET与Rap1GAP细胞因子、微环境等多方面。总之，GDNF－RET与Rap1GAP的增殖、分化和迁移受基因的调控，并与各种生长因子、细胞因子和外部环境有密切关系。GDNF－RET与Rap1GAP相互作用，并具有自我更新和多分化潜能特性，对于神经损伤、神经退行性疾病和脑肿瘤等神经系统疾病的治疗提供新的途径和应用前景。
参考文献：
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3、崔敏、潘新、王丽梅《胶质细胞源性神经营养因子(△N39)-R9神经营养活性和透过血脑屏障的研究》发表于《生物化学与生物物理进展》2006年08期
4、杨磊、周长满、买鸿宴、于恩华《GDNF、GFAP和NGFRp75在成年大鼠和金黄地鼠嗅球成鞘细胞的免疫组织化学研究》发表于《解剖学报》2002年04期
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