疟原虫镜检技术2014.6疟疾简介疟疾是由疟原虫寄生于人体引起的一种具有传染性的寄生虫疾病,即疟原虫是疟疾的病原体。疟原虫为单细胞
真核生物，属原生动物亚界顶端复合物门孢子纲真球虫目疟原虫科疟原虫属。寄生人体的四种疟原虫寄生人体疟原虫有4种间日疟原虫
[Plasmodiumvivax，P.v]三日疟原虫[P．Malariae,P.m]恶性疟原虫[P．Falciparum
,P.f]卵形疟原虫[P．Ovale,P.o]疟疾实验室诊断目前用于疟疾诊断的实验室检测包括病原学检查、免疫学检测和
分子生物学检测三类。检出疟疾的病原体—疟原虫，是明确诊断疟疾的最直接证据。厚、薄血膜镜检疟原虫由于具有操作简便、敏感、价廉和可鉴
别虫种等优点，广泛用于疟疾的病原学诊断已愈近一个世纪。时止今日，由于技术的、经济的等原因，镜检疟原虫仍是我国疟疾病例确诊的金标，被
确认为诊断疟疾国家标准方法（WS259-2006）。血膜的制作（取血时间）取血时机现症病人一般可随时取血，疟疾普
查时可不考虑取血时机。在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见
环状体期；发作后数小时，环状体发育到滋养体期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断的有利时机；36~48小时，可检出裂殖体；发作一、二
次后，配子体出现较多。恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。血膜的制作（取血操作）
取血方法采血部位一般人为耳垂，指头，通常在耳垂取血（现场取血建议用大头针采血，一人一针，避免血传疾病）。先用75%酒
精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒针迅速刺入耳垂下端1
~2毫米，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向挤压出血。取血部位血膜的制作（取血量及涂片法）薄血膜取洁净的
载玻片2张，1张以左手拇指，食指夹持载玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另一张边缘平滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片，用推片一
端边缘的中点从取血部分取约1~2微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25~30度夹角，待血液向两
侧扩展约2厘米长度时，均匀而迅速地轻轻向左推出（约2.5厘米长）。制成的血膜要求血细胞分布均匀，无裂缝，整个血膜成舌形。正确的
推片姿势涂制厚、薄血膜的位置标准的疟疾厚、薄血膜片位置制作血膜的注意事项1.玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制
作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱
落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。制作血膜的注意事项2.刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血
膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂
等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定，不能
溶血或染色效果不佳。制作血膜的注意事项3.血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽
可能24~48小时内固定染色；冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲
醇固定（1~3分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。血片的染色染色液的制备目
前常用的血膜染剂有吉氏和瑞氏两种。吉氏染剂不仅适用于厚血膜和批量血膜的染色，而且效果稳定，染色和染液浓度对染色结果影响较小，染色
后的血膜保存时间较长，同时吉氏染剂能长期保存而不变质，染色技术也易掌握，被推荐使用。瑞氏染色法因操作简便，常用于个别血片的染色
。血片的染色血片的染色2.瑞氏染液的配制瑞氏染剂粉1g，甘油15ml，甲醇500ml。
将瑞氏染剂粉1g置于研钵内，加入15ml甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用500ml甲醇洗出研钵中的甘油溶液，倒
入瓶中，摇匀后，置室温下，每天摇动5分钟，3天后即可使用。此方法染色的时间短，但染色效果不如吉氏染液效果稳定，又不能大
量血片染色，可用于门诊应急血片用。吉氏染液的染色方法血膜的固定和溶血血膜在固定和溶
血前必须充分自然晾干。先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。在固定薄血膜后用蒸馏水对厚血膜溶脱血红蛋白，可用滴管滴蒸馏水于
厚血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倾去，晾干后进行染色。成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀
释液（2毫升原液加中性蒸馏水98毫升稀释均匀即成，(须现用现配。），浸没厚、薄血膜，染色30分钟后，染色缸中注入蒸馏水至溢出，除掉
染液表面浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新的蒸馏水反复冲洗2-3次后，取出血片（血膜面朝下）插于晾干板上，待干镜检。
单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，用中性蒸馏水2毫升，加吉氏母液1～2滴，混合均匀后滴入血片厚、薄血膜标本上，染色20～30分
钟后，用蒸馏水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。瑞氏染液的染色方法：先用蜡笔在厚、薄血膜间划一界限，滴几滴蒸馏水
在厚血膜上溶血,溶血后倾去水滴。在薄血膜上加瑞氏染液5～8滴，染色1～2分钟。然后再加5～8滴蒸馏水于薄血膜上，用吸管将染液与蒸馏
水混合均匀后，把染液引到厚血膜上，使厚血膜再染色10分钟。用蒸馏水轻轻冲去染液，晾干。外观吉氏染色血片质量好的染色:
核呈红色,胞浆呈蓝色如果血片偏红,说明染液偏酸性如果血片偏蓝,说明染
液偏硷性影响染色效果的因素血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等有关外，还受到以下几个因素的影响：（1）染
料溶剂的质量染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇和中性甘油，而且在配制时所
用的器具必须干净而无水份。影响染色效果的因素（2）染液的新旧新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。染
液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制1~2周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密，以防吸潮而影响染液质量。影响染色效果的
因素（3）染液稀释后使用时间吉氏和瑞氏染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中
伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液后当时使用，一般在半小时内染色力最强，在半小时内使用，时间太长也要影响染色效果。
影响染色效果的因素（4）染液的稀释浓度染液的浓度高其着色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染
液浓度过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不明显或消失。影响染色效果的因素（5）染色时间染色时间长染色效果好，反之较差。室
温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。因此染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。影响染色效果的
因素（6）染色用水染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择Ph7.0~7.2清洁水，通常使用的新鲜的中性蒸馏水或过滤的冷开水，以
及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓冲蒸馏水调整。染色后发现血膜颜色偏蓝（偏碱）或偏红（偏酸）时，可用与之相
反的酸、碱度水冲洗血片予以纠正。影响染色效果的因素（7）染色后不要直接将染液倒掉，应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢
出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。血涂片检查在染色后的血膜(晾干)上，加一滴香柏油，用光学显微镜油镜检查。以检查厚
片为主，薄血膜主要用于虫种鉴别。以查完整个厚血膜，未查见疟原虫者判为阴性，报告未查见疟原虫。显微镜下查见疟原虫，根据疟原虫形态
特征确定恶性疟、间日疟、三日疟、卵形疟或混合感染。报告查见某型某期疟原虫。谢谢！厚血膜
用推片的左下角，从取血部位刮取约4-5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4
圈，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。通常是
将厚、薄血膜涂在一张载片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格
中部。血膜的制作×××××√1.吉氏染液母液配制吉氏粉5克，甘油
250毫升，甲醇250毫升。取吉氏粉5克置于研钵中，加少量甘油充分研磨，边加边磨，至250毫升加完为止，倒入500毫升带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量无水甲醇，洗去甘油浓液混入瓶内，至250毫升甲醇洗净研钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，室温内放置3~5天，每天用力摇动5分钟，即成原液。吉氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经久不变。注意：血片完全干燥后才可固定，染色；厚血膜不能固定.偏酸标准偏碱 |
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