第十二章固相膜免疫测定第一节概述一、免疫测定分类二、免疫测定原理三、固相免疫测定四、固相膜的特点五、常
用的固相膜六、固相膜的技术要求第二节免疫金标记技术一、胶体金的制备第三节膜载体免疫测定的种类与原理一、
膜固相免疫测定的特点二、固相微孔膜测定种类三、免疫渗滤试验和免疫层析试验四、酶联免疫斑点试验五、免疫印迹
六、放射免疫沉淀试验随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验
。小分子物质检测、易操作性、灵敏性。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。第
一节概述标记免疫测定放射免疫测定1960’酶免疫测定
1970’荧光免疫测定1980’－1990’化学发光免疫测定1990’－膜固相免疫测定1
990’－一、免疫测定分类二、免疫测定原理三、固相免疫测定B与F分离四、固相膜的特点多孔性
毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原高度敏感性易于漂洗操作简便
五、常用的固相膜玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylideneflu
oride，PVDF)膜硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜六、固相膜的技术要求孔径：0.2~0.6μm；
穿流法0.4μm,横流法5-10μm流速：以ml/cm2/min表示，孔径大流速快蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表
示均一性固相NC膜第二节免疫金标记技术免疫金标记技术(Immunogoldlabellingtechiqu
e)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼
可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunog
oldsilverstaining，IGSS）。一、胶体金制备胶体金（colloidalgold）的制备一般采用还原
法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗
粒悬液，也称金溶胶（goldsolution）。胶体金的制备及特性胶体金（ColloidalGold）15~60
nm胶体金结合物（Conjugate）第三节膜载体免疫测定的种类与原理固相微孔膜测定种类斑点金免疫渗滤试验(doti
mmunogoldfiltrationassay,DIGFA)免疫层析试验（immunochromatographyas
say,ICA）斑点ELISA(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELI
SA)酶联免疫斑点试验(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)免疫印迹法(immunobl
ottingtest,IBT)放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)
一、免疫渗滤测定(IFA，immunofiltrationassay,穿流/flowthrough)IFA——双抗体
夹心法测抗原IFA——结果判断二、免疫层析测定（ICA）横流/lateralflowICA试剂条ICA——双抗
体夹心法测抗原ICA——间接法测抗体ICA结果观察IFA与ICA的比较IFA穿流（FLOWTHROUGH）
ICA横流（LATERALFLOW）GIFA技术的发展（间接法测抗体）GIFA技术的发展ICA技术的发展19
90年ABBOTT公司胶体硒标记ICAUnipath公司CLEARVIEW立明衣原体
彩色胶乳标记ICAROCHECardiacRead
erTnT定量0.1~3ng/ml
合成TnT质控点半定量测定三、斑点酶免疫吸附试验——Dot-ELISA四、酶联免疫斑点试验——ELISPOT2
0世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点
试验(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。ELISPOT检测原理细胞受到刺激
后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的
亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过CTL公司生产的E
LISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。ELISPOT分析仪解决以下问题哪些斑点是抗原特异性T细胞产生的（
此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有T细胞研究价值）斑点大小的意义在对不同细胞因子计数和分析时
，如何定义斑点最大和最小尺寸如何从单个细胞基础上分析实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分
析结果？几次重复实验才能使结果更有意义？ELISAPOTELISPOT结果判断方法学评价五、免疫印迹法——Wester
nblot法六、放射免疫沉淀试验思考题1.叙述固相膜免疫测定概念。2．膜的种类与特性是什么？3．膜载体免疫测定的种
类有哪些？4．斑点金免疫渗滤试验(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)的原理是什么？
5．免疫层析试验（immunochromatographyassay,ICA）的原理是什么？6．斑点ELISA(dote
nzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)原理是什么？7．酶联免疫斑点试验(en
zymelinkedimmunospot,ELISPOT)原理是什么？8．免疫印迹法(immunoblottingt
est,IBT)原理是什么？9．免疫印迹法(immunoblottingtest,IBT)注意事项是什么？10．放射
免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)原理是什么？小结
固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，
液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，利用这种性能建立了多种类型的快速检验方法。固相膜免疫测定包括了斑点金免疫渗滤试验、免疫层析
试验、斑点ELISA、酶联免疫斑点试验、免疫印迹法、放射免疫沉淀试验。2点（测试+控制）金标试剂：单人份、液体样品：血清
、血浆、全血、尿液INSTANTCHEKHIV1+2第八代单一试剂研制中第九~十二代改进抗
原HIV1+2，提高敏感度和特异性，缩短反应时间，减少步骤，样品多样化。单点，5~10分钟，血清，金标试剂瓶装冻干品
HIVCHEK（DuPont）第一代1988ICA甲胎蛋白（AFP）参考值：30μg/L肝癌
诊断值：>400μg/L结果判定：（-）<30（+）30~200
（++）200~400（+++）>400μg/LIFA微量白蛋白
单孔法T：测定孔C1：定量质控30mg/LC2：定量质控200mg/L结果判定：（-）
<30（+）30~100、（++）100～200（+++）>200mg/LIFA肌红蛋
白双孔法S：测定孔C：定量质控100μg/LSCTC2C1测定
线对照线目前一般公认，ELISPOT技术允许科研人员在单细胞水平上识别抗原特定T细胞，主要针对经由CD4或者CD8细胞的
免疫反应。在适当的实验设计下，ELISPOTCytokine斑点的数量分析显示斑点是由一个单细胞所生成，同时斑点形态学与Tim
eResponse分析则显示斑点直径大小直接反映该细胞族群的产能。1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的
频率。(某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率)由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELIS
A和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始
分泌细胞因子，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。此技术是当世唯一准许百万分之一1
:1000,000的准确分析。将指定数目的能产生IFN-的T细胞与一百万个抗原呈现细胞（APC）混合后，使用ELISPOT
法（上图）、胞质内染法（中图）和ELISA法（下图）分别测量产生IFN-的细胞的数目。最低至1：100万细胞精度的活
体外频率测量。原理Westernblot——抗原表位可能被破坏而漏检原理放射免疫沉淀试验——抗原表位不会破坏第十二
思考题小结免疫浊度测定Ag+AbAgAb+Ab标记免疫测定Ag+Ab
AgAb+Ab（B）（F）利用抗原抗体反应检测标本中微量物质
抗原+抗体抗原抗体复合物Ag+AbAgAbAb
AbAg+Ag+AbAbAb535
紫色0.7071.5525红色1.0041522橙红色1.5024.5518橙色2.0016
λmax(nm)呈色（ml)（nm)胶体金特性1%柠檬酸钠加入量胶体金粒径还原100ml0.01%
HAuCl4(氯金酸)所需量优质劣质膜固相免疫测定的特点滥用药物心肌标志肿瘤标志妊娠、排卵的诊断感染性疾病的诊
断不易制备定量、半定量试剂可测定物范围广（主要为定性试验）稳定性较差（普通试剂）保存期长（优质试剂）精密度较差，质控困难
单份测定敏感度略低，价格略高（与ELISA比）简便，快速不足之处优点AB样品垫结合物垫NC膜吸
水垫阳性阴性无效颜色逐渐加深操作结束颜色不变阳性反应颜色浓度3~20min3min观察时间13~5操作步骤室温一年4~8℃6个月试剂保存试剂条渗滤装置及附加试剂试剂形式ICAIFA阳性阴性固相膜固相抗原待测抗体金标记抗人IgG抗体人IgG固相抗人IgG抗体快速检测（渗滤法）原理图GIFA的组成及操作（图示）快速检测技术简介 阳性InstantChek?HIV1+2的结果判断(图像)阴性测定无效LATERALFLOWTESTSTRIPOFVEDALAB30 |
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