植物组织培养实验基本步骤一、母液的配置1、MS大量元素母液的配制一般将大量元素配制成10倍的母液，使用时再稀释10倍。按照配方表中用量依次分别称取扩大10倍的：NH4NO3、KNO3,KH2PO4、MgSO4.7H2O、CaCl2.2H2O的量，所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，最后定容至1000ml，转入1000ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。2、MS微量元素母液的配制一般将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别依次称取：MnSO4?4H2O、ZnSO4?7H2O、H2BO3、NaMoO4?2H2O、CuSO4?5H2O、CoCl2?6H2O扩大100倍的量，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至1000ml，转入1000ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。3、MS铁盐母液配制一般将铁盐配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：FeSO4?7H2O和Na2?EDTA?2H2O的量，把FeSO4?7H2O和Na2?EDTA?2H2O分别置于200ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解（磁力搅拌器，边加热，边搅拌）。保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2?EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后加蒸馏水到最终容积1000ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4冰箱中保存备用。4、MS有机化合物母液的配制一般将有机化合物配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：肌醇、维生素B1、烟酸、甘氨酸、维生素B6的量，用蒸馏水依次溶解并定容至500ml后，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。二、植物激素的配置常见激素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、KT）、6－苄氨基嘌呤（6－BA）、赤霉素（GA3）、1、生长素类：（1）生长素类在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织（2）常见生长素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）。NAA、IAA、IBA被广泛用于生根，2，4－D有利于愈伤组织的诱导和生长。IAA容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时间不要太久。（3）溶解方法：用少量1mol/LNaOH或95％酒精预溶解，再加蒸馏水定容，以前者为好。（4）保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存2、细胞分裂素组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。（1）常用的细胞分裂素有：6－苄氨基嘌呤（6－BA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、KT）、玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（thidiazuron、TDZ）（2）溶解方法：用少量（1ml）1mol/LHCL预溶解，再加蒸馏水定容。（3）保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存3、赤霉素（GA3）（1）溶解方法：用少量95％酒精预溶解，再加蒸馏水定容。（2）保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存（3）赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解（4）灭菌：高温易分解，要过滤灭菌4、脱落酸（1）溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。（2）保存：具有热稳定性，但容易发生光解。配成一定浓度后，冰箱冷藏保存三、培养基的制备与灭菌（一）培养基的制备1、将所需的各种母液和植物激素按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。2、取烧杯一个内盛200ml蒸馏水，按照培养基配方所需量依次取母液和植物激素加入烧杯，搅拌，按相应培养基称量蔗糖和琼脂，并添加到烧杯中，在电炉上加热待琼脂完全融化后加蒸馏水定容至所需体积。3、充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为培养基要求pH值。4、趁热把培养基分装到广口瓶中。封好瓶口。待灭菌。（二）培养基的灭菌灭菌温度及灭菌时间：121（1.06kg/cm2）下灭菌20分钟。（如是实验所用菌材灭菌，如无菌水及器械，则是121（1.06kg/cm2）下灭菌30分钟）1、检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。2、盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。3、灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。4、刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷却。在室温下放置1-2天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。四、无菌操作技术和接种1、接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种房间紫外灯，照射约30min，然后关闭紫外灯。打开房间换气扇及微开超净工作台的玻璃挡板，通风20min后，即可进行无菌操作。（此步由专人统一负责）2、接种室灭菌过程中同时对外植体进行表面灭菌。先将接种材料在流动的自来水下涮洗干净，吸干水份后切成大约70mm长的片段放进500ml烧杯中，用蒸馏水冲洗2次，倒掉蒸馏水后倒入0.1%的升汞水消毒，将材料淹没浸泡约10分钟（期间用镊子搅拌几次）。3、把在消毒液中的接种材料转移到超净工作台上。用无菌镊子将已完成灭菌的接种材料转移到烧杯中，用无菌水清洗3次，每次不少于1分钟，洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒液。最后一次清洗后转移到无菌托碟上，将接种材料切成一定大小（花托0.5cm2、茎段0.5-1cm）。4、取下培养瓶的盖子用火烧灼瓶口。用镊子将外植体轻轻插入到琼脂上，立即盖上盖子。5、操作完后将镊子等器械浸入75%酒精中。操作器械需要在每次使用前消毒一次。方法是将浸于酒精中的器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。6、将培养瓶放到培养箱里，在要求温度下培养，观察记录。一生产环境1工作人员进入组培室必须穿工作服，包括更换拖鞋、穿白大褂，接种人员还要带帽、带口罩。2所有人员在组培室内不准高声喧哗、打闹。3工作期间，各生产房间要关闭房门，尤其是接种间；工作人员出入要随手关门。4各种生产用品要安固定的位置排放整齐，不可乱拿乱放。5工作过程中所产生的垃圾要及时清理，尤其是接种间，其内垃圾停留时间不得超过4小时。二接种程序1.准备工作：接种人员在正式接种之前要做好准备工作，包括准备酒精灯、新洁尔灭、灭菌用脱脂棉以及准备接种工具、分取培养基、接种用苗和工作台灭菌等。·酒精灯用工业酒精作燃料，而非75%酒精。·工作台上用的新洁尔灭浓度是0.1%，而非0.01%。·工作台灭菌包括两步：一是上台前用紫外灯照射30分钟，二是正式接种前再用新洁尔灭仔细擦一遍。·培养皿的取放：从布包里取培养皿时，一定要注意，手不能接触培养皿的边沿，同时要尽可能减少与培养皿的接触面，一般规定只能用双手的拇指和食指取放。·接种工具灭菌也分两步，一是用灭菌布包裹好，在高压锅里灭一次，这一步由灭菌人员负责完成；二是在工作台上，从布包里取出后，先用酒精擦拭一下，再放在酒精灯火焰上灼烤一遍，其要求是工具的每一点在火焰上灼烤时间不得少于5秒钟。在工具灭菌之前，工作人员的手部，包括手腕，都要用酒精仔细擦拭一遍。2接（转）苗：包括取苗、切苗和接苗三步。·取苗：先解开培养瓶的瓶盖（封口膜），如果不能一次取出其内的全部材料，要先把封口膜（瓶盖）口对者风源放在酒精灯的左前方，然后把瓶口在酒精灯上烤7～10秒；正式取苗时，瓶口不要斜向外；一次取苗不可太多，以免风干。·切苗：培养皿放在离风窗10～20厘米处，不可太往外；镊子和手术刀都不可太热，最好是凉的，且在操作过程中，刀和镊都要培养皿斜上方操作，不可在其正上方操作；在切苗过程中产生的垃圾可堆放在培养皿内的一侧位置上，若非迫不得已，不可弄到培养皿外。·接苗：培养瓶盖（或封口膜）的放置方法和及瓶口灼烤方法与取苗时的相同，烤完瓶口后，要先倒掉瓶内多余的水分，然后在接苗；接苗时，镊子最好不要与瓶口接触，一瓶内一般接5～6棵苗，不要放得太多；组培苗在瓶内要排放均匀、整齐、美观。·封口、记录：封口膜要及时捆绑，其松紧度以用手转不动为准；下台前要把品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日期标示到瓶上。离开之前还要把工作台收拾干净，把接种过程中产生的垃圾清理掉，台上的物品也要摆放整齐。三组培苗的管理1.瓶苗要整齐的摆放在自己的组培架上，不可乱放。2.接种人员每天都要统计自己的接种数量，包括转前瓶数和转后瓶数。3.值日人员要定时开灯、关灯，保证组培苗有足够的光照时间，但也不可过长，以每天14小时左右为宜。四接种用具的清洗1.洗刷培养瓶、培养皿：第一步：把培养瓶培养皿放入洗洁净溶液里，先用毛刷清洗内部，再用钢丝球把外面的字清洗掉。第二步：把他们再用清水冲洗3-5遍。第三步：把瓶内的积水倒掉，倒放在准备台，准备台上要先放一层纱布。这一步的清洁标准是：凉干的瓶壁（器皿）内外无明显的斑点、污迹。2.洗涮镊子：用洗洁精浸泡五分钟，用钢丝球打磨一下然后放入清水冲洗三遍。五灭菌1.对污染苗灭菌：一经发现就随即灭菌处理，大量的进行高压灭菌，少量的加入工业酒精在室外进行处理。2.室内空气灭菌：每四周用高锰酸钾和甲醛对室内空气灭一次菌。3.室内地面：每2－3天用新洁尔灭拖一遍地。4.卧式和手提式高压灭菌锅使用程序：严格按使用说明书操作。植物的组织培养技术”知识归纳及试题例析
广东省揭东县登岗中学曾鹏光
1、菊花茎的组织培养与月季的花粉培养的比较
比较项目 菊花茎的组织培养 月季的花药培养 理论依据 细胞的全能性 基本过程 脱分化、再分化 影响因素 选材、营养、激素、pH、温度、光照等 选材、营养、激素、pH、温度等 比较 材料 选取生长旺盛的嫩枝 单核靠边期的花粉 pH 5.8 5.8 温度 18～22℃ 25℃ 光照 每日光照12h 开始时不需要光照，幼小植株形成后才光照 操作流程 制备培养基→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培 选材→材料消毒→接种和培养→筛选和诱导→移栽→栽培选育 2、植物激素（生长素和细胞分裂素）对实验结果的影响
影响因素 实验结果 植物激素的浓度 根据生长素作用的两重性：低浓度促进生长，高浓度抑制生长，甚至杀死植物 植物激素用量 生长素＞细胞分裂素 有利于根的分化、抑制芽的形成 生长素＜细胞分裂素 有利于芽的分化、抑制根的形成 生长素≈细胞分裂素 促进愈伤组织的形成 使用顺序 先生长素，后细胞分裂素 有利于细胞分裂，但细胞不分化 先细胞分裂素，后生长素 细胞既分裂也分化 同时使用 分化频率提高 3、植物组织培养技术与微生物培养技术的比较
比较项目 植物组织培养 微生物培养 含义 在无菌条件下，将离体的植物体器官或组织接种在适当的培养基上进行培养，最终发育成完整植物体 在无菌条件下，在适宜的营养和环境条件下对微生物的培养 培养基成分 水、矿质元素、蔗糖、维生素、有机添加物和植物激素等 水、无机盐、碳源、氮源等 特殊操作要求 严格控制无菌操作，在培养过程中要更换培养基，调节细胞分裂素和生长素的比例 严格控制无菌操作，整个培养过程无需更换培养基 注：在这两种技术中均需要一定的营养物质，但营养物质的划分标准不同。
二、相关试题
1．利用菊花的茎段进行组织培养过程中，下列哪项操作或条件是可以省略的（）
A．消毒灭菌B．适宜的温度
C．适宜的养料D．添加生长素和细胞分裂素
2．（2010·浙江理综，6）将无根的非洲菊幼苗转入无植物激素的培养基中，在适宜的温度和光照等条件下培养一段时间后，应出现的现象是（）
3．下列关于植物组织培养的叙述中，正确的是（）
A．为了提供营养和调节渗透压，培养基中应添加葡萄糖
B．培养液中的生长素和细胞分裂素会影响愈伤组织的生长和分化
C．器官、组织的细胞在不离体的情况下必须通过脱分化才能形成愈伤组织
D．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织的基因是相同的
4．植物组织培养的特点不包括（）
A．一般需经历脱分化和再分化两个过程
B．培养抗病毒植株
C．不改变原植物的基因型
D．通过平衡的植物激素配比进行调控
5．在菊花的组织培养操作完成了3～4天后，观察同一温室中的外植体，发现有的瓶内外植体正常生长，有的瓶内外植体死亡，你认为外植体死亡的原因不可能是（）
A．接种时培养基灭菌不彻底
B．接种工具灼烧后未待冷却就接种外植体
C．愈伤组织形成初期没有给予充足的光照
D．培养过程中保持温度、pH的适宜，但没有及时调整各种营养物质、激素的比例
6．下列关于植物组织培养的叙述中，正确的是（双选）（）
A．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压
B．培养时先使用生长素后使用细胞分裂素，细胞既能分裂，又能分化
C．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织
D．在进行花药离体培养时确定花粉发育时期可用刚果红染色法
7．植物组织培养技术指的是在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。请回答下列问题：
（1）植物组织培养用到的是固体培养基，原因是培养基中添加了，培养基的主要成分是和有机物、植物激素。
（2）培养基中常要添加，这两种激素的影响植物细胞的发育方向。如果外植体是菊花的茎段，则不必添加植物激素，其原因是。
（3）外植体要经过（填消毒或灭菌）后，才能接种。
8．（2010·安徽理综，31Ⅱ）草莓生产上传统的繁殖方式易将所感染的病毒传播给后代，导致产量降低。品质变差。运用微型繁殖技术可以培育出无病毒幼苗。草莓微型繁殖的基本过程如下：
外植株—→愈伤组织—→芽、根—→植株①②③
请回答：
（1）微型繁殖培育无病毒草莓苗时，一般选取作为外植体，其依据是。
（2）在过程①中，常用的MS培养基主要成分包括大量元素、微量元素和，在配制好的培养基中，常常需要添加，有利于外植体启动细胞分裂形成愈伤组织。接种后2~5d，若发现外植体边缘局部污染，原因可能是
。
（3）在过程②中，愈伤组织在诱导生根的培养基中未形成根，但分化出了芽，其原因可能是
。
9．（2009·广州一模，38）下图是月季花药离体培养产生花粉植株的两种途径，请据图回答有关问题：
（1）选用的材料合适与否是成功诱导出花粉植株的重要因素，一般来说选用期的花粉可提高成功率。选择花粉时，一般要通过来确定花粉是否处于合适的发育期，这时需要对花粉的细胞核进行染色，常用的染色剂是。
（2）上图中花药经脱分化产生胚状体还是愈伤组织主要取决于培养基中。
（3）胚状体与愈伤组织在结构上的主要区别在于愈伤组织的细胞排列疏松无规则，是一种高度
的薄壁细胞，胚状体与发育形成的胚有类似的结构，即具有胚芽、胚轴和胚根。
（4）无菌技术也是成功诱导出花粉植株的重要因素，请说明下列各项需要消毒，还是需要灭菌。
①培养基②培养皿③接种环④花蕾⑤实验操作者的双手⑥三角锥形瓶。
（填编号）需要灭菌，（填编号）需要消毒。
（5）试管苗移栽到土壤前，通常要进行壮苗处理，应如何壮苗？
。
10．（2010·宁夏理综，38）请回答：
（1）植物微型繁殖技术属于植物组织培养的范畴。该技术可以保持品种的，繁殖种苗的速度。离体的叶肉细胞在适宜的条件下培养，最终能够形成完整的植株，说明该叶肉细胞具有该植物的全部。
（2）把试管苗转接到新的培养基上时，需要在超净工作台上进行，其原因是避免的污染。
（3）微型繁殖过程中，适宜浓度的生长素单独使用可诱导试管苗，而与配比适宜时可促进芽的增殖。若要抑制试管苗的生长，促使愈伤组织产生和生长，需尊使用的生长调节剂是（脱落酸、2，4—D）。
（4）将某植物试管苗培养在含不同浓度蔗糖的培养基上一段时间后，单株鲜重和光合作用强度的变化如图。据图分析，随着培养基中蔗糖浓度的增加，光合作用强度的变化趋势是，单株鲜重的变化趋势是。据图判断，培养基中不含蔗糖时，试管苗光合作用产生的有机物的量（能、不能）满足自身最佳生长的需要。
（5）据图推测，若要在诱导试管苗生根的过程中提高其光合作用能力，应（降低，增加）培养基中蔗糖浓度，以便提高试管苗的自养能力。
三、答案及解析
1．答案：D
解析：菊花的茎段组织培养比较容易，一般不必添加植物激素。
2．答案：B
解析：植物组织培养过程中，由外植体脱分化形成愈伤组织需要一定量的生长素和细胞分裂素，愈伤组织再分化形成根、芽的过程也需要一定浓度的生长素和细胞分裂素，且生长素和细胞分裂素的不同配比对形成根、芽的影响不同。本题中的无根幼苗本身就能够产生一定量的生长素和细胞分裂素，能够促使基部细胞脱分化、再分化出根来，所以会出现B项现象。
3．答案：B
解析：为了提供营养和调节渗透压，培养基中应添加的是蔗糖。只有处于离体的器官、组织的细胞才能通过脱分化形成愈伤组织。采用绿色开花植物的生殖器官部位（如花药）进行培养获得的愈伤组织的基因只是体细胞的一半。
4．答案：B
解析：植物组织培养的原来是西北的全能性，属于无性繁殖，不改变原植物的基因型。通过植物组织培养可以培养无病毒植株，而培养抗病毒植株要通过基因工程。
5．答案：C
解析：由于植物组织培养所利用的植物材料体积小，抗性差，所以对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长，而培养基一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。培养的不同阶段，对主要营养物质和激素的需求不同，所以培养过程中要及时调整各种营养物质、激素的比例。愈伤组织形成过程中，细胞还没有开始再分化，没有叶绿素和叶绿体的形成，不可能进行光合作用，因此愈伤组织形成初期不需要充足的光照。
6．答案：AC
解析：培养时先使用生长素后使用细胞分裂素，有利于细胞分裂，但细胞不分化。在进行花药离体培养时确定花粉发育时期可用醋酸洋红法或焙花青—铬矾法；刚果红染色法是通过颜色反应对纤维素分解菌进行筛选。
7．答案：
（1）琼脂（凝固剂）大量元素、微量元素
（2）生长素和细胞分裂素用量比例菊花的茎段组织培养比较容易
（3）消毒
解析：
在液体培养基中加入凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基，用于植物组织培养。用于植物组织培养的培养基是MS培养基，其主要成分包括大量元素、微量元素、有机物。常常需要添加植物激素。植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。当同时使用这两类激素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向。
8．答案：
（1）茎尖、根尖不含病毒
（2）有机物植物激素外植体消毒不彻底
（3）培养基中生长素类物质和细胞分裂素类物质用量的比值偏低
解析：
（1）因茎尖（或根尖）病毒极少，甚至无病毒，所以常用其作为外植体培育无病毒植株。
（2）在植物组织培养的培养基中，除了添加植物必需的矿质元素外，还要添加有机物，添加植物激素有利于启动细胞分裂实现脱分化形成愈伤组织并且可诱导愈伤组织细胞再分化过程。若对外植体消毒不彻底，会造成外植体边缘局部污染。
（3）在培养基中生长素与细胞分裂素的用量比值不同，诱导生根发芽结果不同，当比值低时，有利于发芽，比值高时，有利于生根。
9．答案：
（1）单核镜检（显微镜观察）醋酸洋红
（2）激素的种类及其浓度配比
（3）液泡化正常受精卵（或受精卵）
（4）①②③⑥④⑤
（5）将试管苗移栽到经消毒过的培养基中生活一段时间，等幼苗长壮后再移栽到土壤中
解析：
（1）单核期花粉对离体刺激敏感，选用该期花粉可提高培养的成功率，选择花粉时可用显微镜观察、筛选；对花粉细胞核染色应该选择碱性染料，常用醋酸洋红。
（2）细胞培养成植株的两条途径取决于植物激素的种类及比例，尤其是生长素和细胞分裂素。
（3）愈伤组织细胞的特点是细胞排列疏松、无规则、高度液泡化；胚状体是具有与胚相似的结构，即具有胚芽、胚轴和胚根。
（4）灭菌对象为培养基和实验器材，消毒对象为要保持活性的材料和实验者自身。
（5）壮苗就是使试管苗逐步适应外界环境的做法。
10．答案：
（1）遗传性快遗传信息
（2）微生物
（3）生根细胞分裂素2，4—D
（4）逐渐减小先增加后下降不能
（5）降低
解析：植物组织培养技术是利用植物细胞全能性的原理进行的，是植物细胞工程的基础。在操作过程应注意无菌操作，避免杂菌污染，因为培养过程中使用的培养基营养物质丰富，适宜浓度的生长素可以诱导试管苗生根，而如果要促进愈伤组织形成芽，则需要与细胞分裂素配比，促进愈伤组织产生和生长，应使用2，4—D。
2011-04-21人教网
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