诱导自噬是早期应对易瑞沙(吉非替尼)和乳腺癌的潜在治疗靶点概要易瑞沙(吉非替尼)（ZD1839）是表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶的小
分子抑制剂。我们报告了对易瑞沙(吉非替尼)的早期细胞反应，其涉及在对易瑞沙(吉非替尼)敏感的表型多样性乳腺癌细胞（BT474和SK
BR3）或不敏感（MCF7-GFPLC3和JIMT-1）中诱导功能性自噬通量。我们的数据显示，易瑞沙(吉非替尼)治疗的乳腺癌细胞中
的自噬增高与治疗过程中早期AKT和ERK1/2信号的下调相关。通过BECLIN-1或ATG7siRNA与易瑞沙(吉非替尼)组
合抑制自体吞噬能减少自噬细胞器的丰度和致敏的SKBR3而不是MCF7-GFPLC3细胞对细胞死亡的影响。然而，在易瑞沙(吉非替尼)
敏感性SKBR3和BT474细胞以及易瑞沙(吉非替尼)不敏感的JIMT-1和MCF7-GFPLC3细胞中，抑制易瑞沙(吉非替尼)诱
导的自噬与羟氯喹（HCQ）或巴非洛霉素A1的自噬明显升高（p<0.05）相对于用相应的单一试剂观察到的效果。与媒介物治疗对照相比
，易瑞沙(吉非替尼)和HCQ联合治疗在延缓肿瘤生长方面比单一疗法（p>0.05）更有效（p<0.05）。我们的研究结果还表明，
易瑞沙(吉非替尼)短期治疗后自噬体含量升高是药物去除后停止的可逆反应。介绍有证据表明，过表达和EGFR，HER2和HER3的共表达
中，EGFR受体家族的成员，与抗癌治疗和乳腺癌[不利临床预后抗性相关1?-?3?]。因此，小分子抑制剂选择性的EGFR受体家族的酪
氨酸激酶是临床感兴趣的[?1，2，4，5?]。例如，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）易瑞沙(吉非替尼)[?6?]已被广泛地研究和
研究表明，这种药物可以是抗乳腺癌表达EGFR有效，尤其是在过表达HER2的背景[?7?-?9?]。易瑞沙(吉非替尼)主要通过细胞抑
制机制（如G0?/G?1细胞周期停滞和细胞周期蛋白D1下调）抑制癌细胞的生长[?8?]，降低磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/
AKT和丝裂原活化蛋白的活化激酶（MAPK）途径[?7，8，10?]。易瑞沙(吉非替尼)的作用也包括次要靶点，如蛋白激酶RICK，
GAK和BRK[?11?]。在这里，我们报告了易瑞沙(吉非替尼)的另一个影响，其涉及改变乳腺癌细胞中自噬的细胞过程。如G0?/
G?1细胞周期停滞和细胞周期蛋白的下调D1[?8?]，并且降低了磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT和丝裂原活化蛋白激酶（
MAPK）途径[活化7，8，10?]。易瑞沙(吉非替尼)的作用也包括次要靶点，如蛋白激酶RICK，GAK和BRK[?11?]。在
这里，我们报告了易瑞沙(吉非替尼)的另一个影响，其涉及改变乳腺癌细胞中自噬的细胞过程。如G0?/G?1细胞周期停滞和细胞周期蛋
白的下调D1[?8?]，并且降低了磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径[活化7，8，10
?]。易瑞沙(吉非替尼)的作用也包括次要靶点，如蛋白激酶RICK，GAK和BRK[?11?]。在这里，我们报告了易瑞沙(吉非替尼
)的另一个影响，其涉及改变乳腺癌细胞中自噬的细胞过程。10?]。易瑞沙(吉非替尼)的作用也包括次要靶点，如蛋白激酶RICK，GAK
和BRK[?11?]。在这里，我们报告了易瑞沙(吉非替尼)的另一个影响，其涉及改变乳腺癌细胞中自噬的细胞过程。10?]。易瑞沙(
吉非替尼)的作用也包括次要靶点，如蛋白激酶RICK，GAK和BRK[?11?]。在这里，我们报告了易瑞沙(吉非替尼)的另一个影响
，其涉及改变乳腺癌细胞中自噬的细胞过程。Macroautophagy（这里称为自噬）是由自噬相关（ATG）基因执行的进化保守的溶酶
体降解途径[?12?]。它是起始自噬体捕获的细胞器或细胞质中的部分的形成，并导致与溶酶体融合，其中所述自噬体货物通过水解酶为大分子
的回收进行分解代谢[一个动态过程12，13?]。这个过程被称为自噬流量或通量，可以通过饥饿，缺氧，辐射，生长因子信号传导抑制剂，经
典的化疗和靶向药物[应激细胞大幅升高14?-?22?]。然而，自噬对抗癌治疗作用的作用是，还不太了解?最近的研究表明，自噬在癌症细
胞中促存活（细胞保护）的角色发生各种抗癌治疗[15，17，18，22?-?26?]。这，反过来，可以被链接到差治疗结果和耐药性的
发展[?17，19，27，28?]。因此，对自噬作为抗癌治疗的推定目标越来越感兴趣，这并不奇怪[?27?-?32?]。最近的研究表
明，自噬在癌症细胞中促存活（细胞保护）的角色发生各种抗癌治疗[15，17，18，22?-?26?]。这，反过来，可以被链接到差治
疗结果和耐药性的发展[?17，19，27，28?]。因此，对自噬作为抗癌治疗的推定目标越来越感兴趣，这并不奇怪[?27?-?32?
]。最近的研究表明，自噬在癌症细胞中促存活（细胞保护）的角色发生各种抗癌治疗[15，17，18，22?-?26?]。这，反过来，
可以被链接到差治疗结果和耐药性的发展[?17，19，27，28?]。因此，对自噬作为抗癌治疗的推定目标越来越感兴趣，这并不奇怪[?
27?-?32?]。可以被链接到差治疗结果和耐药性的发展[17，19，27，28?]。因此，对自噬作为抗癌治疗的推定目标越来越感
兴趣，这并不奇怪[?27?-?32?]。可以被链接到差治疗结果和耐药性的发展[17，19，27，28?]。因此，对自噬作为抗癌治
疗的推定目标越来越感兴趣，这并不奇怪[?27?-?32?]。使用基于图像的高内容分析（HCA），透射电子显微镜（TEM）和分子方法
，我们显示易瑞沙(吉非替尼)在各种易瑞沙(吉非替尼)敏感和敏感性乳腺癌细胞系中诱导自噬。在有抑制晚期自噬的溶酶体药物存在下易瑞沙(
吉非替尼)治疗可增加易瑞沙(吉非替尼)在体外和体内的疗效。我们的数据支持基于靶向EGFR和乳腺癌自噬的联合治疗策略的治疗效用。材
料和方法细胞和试剂SKBR3和BT474细胞来自美国典型培养物保藏中心（ATCC），JIMT-1细胞[?33?]购自德国微生物和细
胞培养物学系（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmb
H（DSMZ））。将SKBR3细胞维持在McCoy的5A和BT474和JIMT-1细胞中的DMEM中。使用增强的绿色荧光蛋白（EG
FP）-微管相关蛋白1轻链3B（MAP1LC3B）构建体稳定转染MCF7细胞以产生MCF7-GFPLC3细胞，如前所述[?34
?]。将MCF7-GFPLC3细胞维持在RPMI中。细胞培养物补充有2mML-谷氨酰胺和10％胎牛血清（FBS）。通过PCR反应
检测所有细胞系为支原体阴性。易瑞沙(吉非替尼)从LC实验室和Acros-Fisher的羟氯喹（HCQ）购买。Bafilomycin
A1和3-甲基腺嘌呤（3-MA）来自Sigma-Aldrich，抗GFP抗体来自Roche。抗MAP1LC3B（LC3）抗体来自
ABcam或CellSignalingTechnologies。本研究中使用的所有其他抗体均来自CellSignaling
Technologies。高内容分析（HCA）将细胞一式三份铺在平底96孔板（Optilux，Falcon，Becton-Dick
inson）中，使其粘附过夜，然后第二天用特定的药物处理细胞。在药物治疗结束时，细胞用活性染料原位染色：DRAQ5（Biostat
us），Hoechst33342（Sigma-Aldrich），Ethidiumhomodimer（ETH）（LifeTec
hnologies），monodansylcadaverine（MDC）（Sigma-Aldrich）或lysotrackerr
ed（LTR）（LifeTechnologies），并用INCell1000Analyzer（GEHealthcare
）成像。每个荧光通道获得每孔10个成像场。使用Investigator图像识别软件和多目标分析（MTA）模块分析图像。Invest
igator软件能够以?95-99％的精度识别细胞。使用Investigator软件中可用的优化算法获得代表细胞细胞器的细胞器数目
，细胞器间距和每细胞测量的总细胞器面积（TOA）。每个细胞的平均TOA表示通过测试用车辆对照或指示的治疗剂处理的细胞的图像上的图像
识别算法而建立和优化的相对测量，并且它不表示绝对数。HCA数据使用MicrosoftExcel导出和处理。每个细胞的平均TOA表
示通过测试用车辆对照或指示的治疗剂处理的细胞的图像上的图像识别算法而建立和优化的相对测量，并且它不表示绝对数。HCA数据使用Mic
rosoftExcel导出和处理。每个细胞的平均TOA表示通过测试用车辆对照或指示的治疗剂处理的细胞的图像上的图像识别算法而建立
和优化的相对测量，并且它不表示绝对数。HCA数据使用MicrosoftExcel导出和处理。流式细胞仪将细胞接种在含有10％FB
S的各自培养基中的T25烧瓶或6cm直径的培养皿中，并使其粘附过夜。第二天，用指定的药剂处理细胞。72小时后，将处理的细胞（收获以
考虑浮游细胞）的上清液转移到14ml管中，并与用0.25％胰蛋白酶EDTA收获的贴壁细胞组合。为了分析细胞周期，包括前G?0?/
G?1分数，用PBS洗涤细胞两次，将2×10?6细胞/样品固定在1.8ml冷（-20℃）70％乙醇中，然后孵育1小时冰和-20℃孵
育24小时。然后通过离心收集细胞，并用含有1μg/mlRNA酶A（Sigma-Aldrich）和0.1％TritonX-10
0（Bio-Rad）的含有50μg/ml碘化丙啶（PI）（LifeTechnologies）的PBS缓冲液在37℃下15分钟，
然后在冰上孵育1小时。对于基于膜联蛋白V的凋亡分析，将细胞用没有酚红的汉克氏培养基洗涤两次，并将沉淀重悬于含有AnnexinV-
AlexaFlour？647（AnnexinV-Alexa647;LifeTechnologies）的AnnexinV缓
冲液中。然后将样品在冰上孵育30分钟，并用PI重新染色，终浓度为1μg/ml。使用FACSCalibur流式细胞仪（Becton
-Dickinson）进行流式细胞术分析，并用Cellquest软件（Becton-Dickinson）分析获得的数据。用于确定不
同细胞群体百分比的门是基于载体处理细胞中的背景染色设定的。PI阳性和AnnexinV阴性细胞被认为是坏死的，膜联蛋白V阳性细胞（
含有PI阳性晚期凋亡和PI阴性早期凋亡细胞）被认为是凋亡的，PI阴性和AnnexinV阴性细胞被认为是可行的。蛋白质印迹将细胞接
种在6cm培养皿中，并用指定的药物处理过夜粘连。处理后，将细胞在含有50mMTrispH7.4,150mMNaCl，1％N
P-40,0.25％脱氧胆酸盐，1mMEDTA，0.1％SDS和迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂（RocheDiagnostics）
的裂解缓冲液中裂解，。离心（13,000rpm30分钟）后，使用PierceMicroBCA?TM?AssayKit?对
上清液中的蛋白质浓度进行定量。在预制的4-12％Bis-Tris凝胶（NuPage，LifeTechnologies）上分离每个
样品30-50μg的总蛋白，并转移到NuPage0.45μm硝酸纤维素膜上。用含有50mMTris和0.1％Tween-20（p
H7.4）（TBS-T）的150mMNaCl的5％脱脂奶粉将膜封闭，并与TBS-T中的5％BSA中的一抗进行孵育过夜。第二天，
用TBS-T洗涤膜3次，并在含有5％脱脂乳的TBS-T中与过氧化物酶缀合的第二抗体（Promega）孵育1小时。然后将膜用TBS-
T洗涤3次，并通过CL-XPosureTM膜（ThermoScientific）上增强化学发光（SuperSignal？Wes
tPicoChemiluminescentSubstrate，ThermoScientific）检测信号，?或通过Chem
iDoc?TM?MP成像系统（Bio-Rad）。小干扰RNA（siRNA）用化学修饰的StealthTMsiRNA（BECN
1：5''-GGAUGAUGAGCUGAAGAGUGUUGAA-3''，ATG7：5''-CCAAGGAUGGUGAACCUCAGUGA
AU-3''，EGFR：5''-CCUAUGCCUUAGCAGUCUUAUCUAA将内源性BECLIN-1（BECN1），ATG7和
EGFR信号的表达沉默-3''?;LifeTechnologies/Invitrogen）。使用具有中等GC含量的加密的St
ealthTMsiRNA作为阴性对照（LifeTechnologies/Invitrogen目录12935-200）。为
了解决任何意外的脱靶效应，使用先前描述的方法测试用于扰频和靶向基因的每个siRNA双链体诱导干扰素介导的应激反应[?15?]。通过
使用AMAXA?NucleofectorTM系统（Lonza）通过电穿孔将StealthTMsiRNA双链体递送至靶细胞群体
。使用程序E009将SKBR3细胞用核受试者溶液C电穿孔。使用程序P020将MCF7-GFPLC3细胞用核受试者溶液V电穿孔。在指
定的实验中，进行单个siRNA转染或间隔72h的两个连续siRNA转染（称为“双重敲低”），以实现基因表达的敲低。在转染后的指定时
间，将细胞接种在96孔板中，用IN细胞1000或6cm培养皿进行成像实验用于蛋白质印迹分析。进行单个siRNA转染或间隔72h的两
个连续siRNA转染（称为“双重敲低”），以实现基因表达的敲低。在转染后的指定时间，将细胞接种在96孔板中，用IN细胞1000或6
cm培养皿进行成像实验用于蛋白质印迹分析。进行单个siRNA转染或间隔72h的两个连续siRNA转染（称为“双重敲低”），以实现基
因表达的敲低。在转染后的指定时间，将细胞接种在96孔板中，用IN细胞1000或6cm培养皿进行成像实验用于蛋白质印迹分析。定量实时
PCR（qRT-PCR）最后用siRNA转染后48-96小时，通过qRT-PCR评价BECN1和ATG7的mRNA表达。使用RNe
asy?Mini试剂盒（Qiagen）分离总RNA，并使用QuantiTectReverseTranscription试剂盒（
Qiagen）根据制造商的说明将其逆转录成cDNA。使用TaqMan？基因表达测定（AppliedBiosystems）扩增一式
三份单层反应中的BECN1（测定IDHs00186838）和ATG7（测定IDHs00197348）cDNA。使用GAPDH（
测定IDHs02758991）作为标准化的内源参照基因，并使用标准曲线法计算相对基因表达。透射电子显微镜（TEM）用胰蛋白酶ED
TA收获细胞，并在0.1M二甲胂酸钠缓冲液（pH7.4）中的4％甲醛和2.5％戊二醛（GA）中固定，固定在缓冲的1％四氧化锇中，
在2.5％GA中嵌入并固定2次，切成1毫米立方体，然后在微波浸入1：1Spurr/Epon树脂之前通过分级乙醇系列和环氧丙烷
脱水。将聚合的块在ReichertUltracutE上切片，将70nm切片安装在100目格栅或1x2槽格上，并在乙酸双氧铀和雷
诺酸铅中分别染色（分别为12或6秒）。用日立H7600TEM（日本东京）收购图像。克隆测定将500台不含细胞的台盼蓝接种在6孔板
的3ml生长培养基中一式四份（来自两个独立稀释液），并培养17天。从孔中取出培养基后，用0.2％孔雀绿染色菌落并计数。电镀效率定义
为除了形成>50个细胞集落的细胞之外的台盼蓝的百分比。肿瘤异种移植物和治疗对于体内研究，JIMT-1细胞以指数生长期收获。将7.
5×10?6个?JIMT-1细胞皮下（sc）注射到雌性Rag2M免疫受损小鼠的背部。每周两次监测肿瘤生长;?使用公式0.5[长度
（mm）]×[宽（mm）2?]?计算肿瘤大小。当肿瘤达到约100mm?3的体积时，将动物随机分配到不同的治疗组（每组6只动物）。治
疗在第25天开始，周一至周五（QDx5）进行25天或26天。所有的药剂都是口服管饲。将易瑞沙(吉非替尼)溶解于无菌milli-Q水
中的0.5％Tween-80中，将HCQ溶解于milli-Q水中。每周制备易瑞沙(吉非替尼)和HCQ制剂，保持在4℃。联合治疗的小
鼠首先用易瑞沙(吉非替尼)，然后四小时后加入HCQ。还监测动物由于治疗相关的副作用或肿瘤负担而导致体重减轻和其他疾病迹象。动物方案
由不列颠哥伦比亚省动物保育委员会批准，这些研究是按照加拿大动物保护委员会制定的指导方针进行的。统计分析用不配对的t检验（Graph
PadPrism版本5.00）评估治疗组之间的差异。如果适用，使用Benjamini-Hochberg程序（R版本2.11.1）
调整获得的p值进行多重比较。使用Kruskal-Wallis检验进行不同治疗组肿瘤体积差异的统计学分析，并用Dunn进行多重比较校
正（GraphPadPrism版本6.01）。差异在p0.05被认为是显着的。结果易瑞沙(吉非替尼)治疗在乳腺癌细胞中诱导M
DC标记的囊泡的出现，而不管其对易瑞沙(吉非替尼)的敏感性在实施基于成像的高含量分析（HCA）屏幕时，寻找与易瑞沙(吉非替尼)组合
时协同相互作用的化合物，我们注意到易瑞沙(吉非替尼)治疗诱导乳腺癌细胞细胞浆中囊泡细胞器的出现。当用单硬脂酰胺（MDC）染色染色时
，这些细胞器积累了染色，提供了可能发生自噬改变的指征[?35?]。图（图1A）显示了具有重叠软件衍生成像掩模的易瑞沙(吉非替尼)治
疗的SKBR3细胞的图像。这些图像显示基于DRAQ5和ETH与MDC标记的细胞质细胞器（绿色斑点）的活细胞和死细胞的差异标记的细胞
群体的异质性，并显示细胞形态的细节（左侧和中部面板）。图1A中的右图示出了当单个细胞器位于细胞内非常接近时，分析软件更难以识别个体
结构，因此，细胞内所有标记的细胞器占据的总面积（总细胞器面积（TOA））作为量化这些结构的实用方法。随着时间的推移，一系列易瑞沙
(吉非替尼)浓度的治疗后，在表型多样的乳腺癌细胞系中定量了不同的细胞群。SKBR3细胞表达编码PI3K的p110-α催化亚基的野生
型PIK3CA基因，BT474，JIMT-1和MCF7细胞表达突变的PIK3CA基因。这些细胞在雌激素受体（ER），EGFR，HE
R2和HER3表达方面也有差异：SKBR3细胞是ER阴性（ER-），表达高水平的HER2和EGFR，中等水平的HER3，BT47
4细胞是ER阳性（ER?+），表达高水平的HER2和HER3，但低水平的EGFR，JIMT-1个细胞是ER?-和表达高水平HER
2和EGFR和HER3的低水平的，和MCF7细胞是ER?+和表达HER2和EGFR和高水平HER3[的水平低7，33，36?-?
38?]。我们研究中使用的MCF7细胞用异位EGFP-LC3B构建体稳定转染以产生MCF7-GFPLC3细胞[?34?]。用载体或
易瑞沙(吉非替尼)处理的不同细胞的代表性图像，并用DRAQ5?原位染色，ETH和MDC在图1B中提供。这些图像显示在易瑞沙(吉非替
尼)处理的细胞中MDC标记的细胞器的积累。用Investigator软件量化成像数据，并获得不同细胞系的HCA数据，如图1C所示。
这些数据显示易瑞沙(吉非替尼)治疗以浓度依赖的方式产生具有MDC标记的细胞器的细胞群。在BT474细胞，48用易瑞沙(吉非替尼)小
时处理导致细胞毒性在治疗相关的药物浓度存在的（活细胞减少和死细胞相关的上升）（?1μM;[?6，39?]），其在一段72小时进一
步增加（图1C，BT474顶部和中间图）。在SKBR3细胞中，细胞毒性仅在144小时后和易瑞沙(吉非替尼)以浓度≥1μM使用时才显
现（图1C，SKBR3顶部和中间图）。在JIMT-1和MCF7GFPLC3细胞中，即使144小时后，易瑞沙(吉非替尼)介导的细胞
毒性也可忽略，生长抑制是细胞抑制作用的结果（图1C，JIMT-1和MCF7-GFPLC3顶部和中间图）。基于细胞毒性数据，我们认为
BT474非常敏感，SKBR3中度敏感，JIMT-1和MCF7GFPLC3细胞对易瑞沙(吉非替尼)不敏感。用易瑞沙(吉非替尼)治疗
的所有细胞系中活细胞数量的下降与包含与细胞毒性和/或细胞抑制作用相关的MDC标记的细胞器的细胞群体的增加相一致（图1C，顶部和中间
图）。下图中图1C所示的数据显示了用易瑞沙(吉非替尼)治疗的细胞中的平均MDCTOA/细胞。这些数据与图1C所示的具有MDC标
记的细胞器的细胞的比例良好地相关，顶部和中间片段表明两种测量均适用于细胞细胞器含量的定量评估。这些结果一起显示MDC标记的细胞器在
对该药物具有不同敏感性的乳腺癌细胞中积累易瑞沙(吉非替尼)治疗后。这些数据与图1C所示的具有MDC标记的细胞器的细胞的比例良好地相
关，顶部和中间片段表明两种测量均适用于细胞细胞器含量的定量评估。这些结果一起显示MDC标记的细胞器在对该药物具有不同敏感性的乳腺
癌细胞中积累易瑞沙(吉非替尼)治疗后。这些数据与图1C所示的具有MDC标记的细胞器的细胞的比例良好地相关，顶部和中间片段表明两种
测量均适用于细胞细胞器含量的定量评估。这些结果一起显示MDC标记的细胞器在对该药物具有不同敏感性的乳腺癌细胞中积累易瑞沙(吉非替尼
)治疗后。图1易瑞沙(吉非替尼)抑制细胞生长并诱导MDC标记的细胞器在乳腺癌细胞中的出现。TEM证实在易瑞沙(吉非替尼)治疗的细胞
中存在自噬相关的细胞器由于MDC染料已知会污染酸性细胞器如溶酶体，自体溶质体和晚期自噬体[?35?]，易瑞沙(吉非替尼)治疗细胞中
MDC标记的囊泡的增加表明该药物调节自噬。为了确定是否是这种情况，我们使用TEM，一种常见的自噬细胞器鉴定方法[?35?]。这些结
果总结在图2中，其显示了48小时载体或易瑞沙(吉非替尼)处理的SKBR3（图2A?;吉非替敏敏感细胞系的实例）和MCF7-GFPL
C3细胞的代表性TEM图像（图2B，左上和中部和底部左图;易瑞沙(吉非替尼)不敏感细胞系的实例）。作为积极的控制，用他莫昔芬（图2
B，右上图像）处理ER?+?MCF7-GFPLC3细胞，这是一种已知会引起自噬的药物[?15?]。与易瑞沙(吉非替尼)处理的细胞
相比，SKBR3和MCF7-GFPLC3载体处理的细胞的细胞质是均匀的，其含有许多自噬体和具有封闭的退化细胞材料的自体溶质。易瑞沙
(吉非替尼)治疗的MCF7-GFPLC3细胞的囊泡结构一般在外观上与用他莫昔芬治疗的细胞中观察到的相似。在易瑞沙(吉非替尼)治疗后
，SKBR3和MCF7-GFPLC3细胞中这些结构的存在与分别与MDC或lysotracker红（LTR）标记的细胞器和GFPLC
3-，LTR-或MDC标?记的细胞器的存在有很好的相关性，图2用易瑞沙(吉非替尼)或他莫昔芬治疗的乳腺癌细胞的TEM图像。自噬体的
增加是对与EGFR信号传导的细胞类型特异性变化相关的易瑞沙(吉非替尼)治疗的早期反应在MCF7-GFPLC3和SKBR3细胞中研究
了自噬体形成作为易瑞沙(吉非替尼)治疗反应的动力学。所述GFPLC3融合蛋白，通常用作自噬体标记物[?35?]，通常是在整个细胞质
中正常条件下生长的细胞弥漫性标记观察。然而，触发自噬的条件导致这种蛋白质重新定位到新形成的自噬体的膜上，然后会出现绿色荧光点代表G
FPLC3标记的细胞器。在易瑞沙(吉非替尼)治疗开始后45分钟，MCF7-GFPLC3细胞中的GFPLC3标记的细胞器开始可见（图
S2，GFPLC3顶部图）。GFPLC3标记的细胞器的数量在3小时内稳定增加，作为扩散性胞质GFPLC3重新定位到点状结构（图S
2，GFPLC3下图）。这些数据强烈表明自噬体积累在易瑞沙(吉非替尼)治疗的细胞中。用易瑞沙(吉非替尼)3小时处理后用LTR或MD
C染色的MCF7-GFPLC3细胞（图S2，MDC和LTR图）显示出与GFPLC3标记的自噬体相关的LTR和MDC标记的细胞器的出
现相似的结果。HCA数据表明，每个细胞的这些细胞器的平均总面积以浓度依赖性方式增加（图3A，上图）。这里使用的图像分析方法也可以估
计识别的细胞器（puncta）之间的距离;?这些数据表明，随着总细胞器面积增加，易瑞沙(吉非替尼)治疗的细胞中各细胞器之间的距离减
小（图3A，下图）。可以认为这是细胞器聚类的反映，这也是一个似乎是集中依赖的特征。使用载体处理3小时的MCF7-GFPLC3细胞
的TEM图像显示许多保存良好的线粒体和一些未成熟的小溶酶体（图3B，左上图）。用10μM易瑞沙(吉非替尼)治疗3小时后，MCF7-
GFPLC3细胞似乎含有许多含有自噬体样结构的自体溶酶体（图3B，右上和右上图）。该观察结果与图3A（顶部图）中显示易瑞沙(吉非替
尼)治疗3小时后自噬变化的数据一致。在SKBR3细胞中，对易瑞沙(吉非替尼)的反应与MCF7-GFPLC3细胞中的相似，结果显示易
瑞沙(吉非替尼)治疗平均MDCTOA/细胞达3小时浓度依赖性升高（图3C）。图3乳腺癌细胞对易瑞沙(吉非替尼)的早期反应。为了
证实显示自噬体区域上升的成像数据，我们对易瑞沙(吉非替尼)治疗3?4小时的细胞进行了可溶性LC3-I和脂质化LC3-II水平的We
stern印迹分析。LC3-II是LC3蛋白的切割和脂质结合形式，是自噬体膜的组成部分，可作为自噬体的标记[?35?]。在易瑞沙(
吉非替尼)敏感的SKBR3和BT474细胞中，加入易瑞沙(吉非替尼)后3小时，分别观察到LC3-II的浓度依赖性增加，分别为1.3
μM和0.6μM（图3D，顶部凝胶）。在用易瑞沙(吉非替尼)治疗4小时的易瑞沙(吉非替尼)不敏感的MCF7-GFPLC3细胞中，在
大于0.6μM的浓度下，LC3-II水平的增加是明显的（图3D，顶部凝胶）。为了确定LC3-II的积累是否与易瑞沙(吉非替尼)介导
的EGFR抑制相关，完成了MAPK和PI3K/AKT途径中EGFR和下游信号蛋白的Western印迹分析。EGFR，AKT，E
RK1/2的磷酸化（P）和雷帕霉素（mTOR）底物p70核糖体S6激酶（p70S6K）及其下游靶标S6核糖体蛋白（S6）以及真
核翻译起始可以在SKBR3和BT474细胞中观察到因子4E结合蛋白-1（4E-BP1）（图3D，分别为左侧和中部）。这些蛋白质的磷
酸化在治疗相关浓度的易瑞沙(吉非替尼)（高达1.3μM）下被抑制。在易瑞沙(吉非替尼)不敏感的MCF7-GFPLC3细胞中，吉非他
宁介导的P-EGFR变化几乎不可检测，仅导致P-AKT和P-ERK水平的适度降低（图3D，右图）。此外，P-p70S6K，P-S
6和P-4E-BP1水平保持不变（图3D，右图），表明mTOR复合物1（mTORC1）信号传导未被抑制。总体而言，图3所示的结果显
示，易瑞沙(吉非替尼)诱导的EGFR信号转导是细胞型特异性，与LC3-II蛋白水平升高相关。易瑞沙(吉非替尼)增强自噬通量迄今为止
提供的结果提供了令人信服的证据，易瑞沙(吉非替尼)改变乳腺癌细胞中的自噬。细胞中自噬体数量的增加可能是自噬的强烈刺激导致自噬体快速
形成的结果。或者，这可以反映由自噬体-溶酶体融合和/或溶酶体功能受损引起的自噬体室内营养差减少。为了区分这些过程，我们研究了易
瑞沙(吉非替尼)治疗细胞中自噬通量的状况。首先，测量p62的水平。在SKBR3细胞中，Western印迹分析显示，易瑞沙(吉非替尼
)治疗后，浓度依赖性方式，p62（SQSTM1），自噬通量[?35?]的水平降低（图4A）。易瑞沙(吉非替尼)提高SKBR3细胞自
噬通量的进一步证据是从易瑞沙(吉非替尼)与巴非洛霉素A1（溶酶体酸化所需的液泡ATP酶（V-ATPase）抑制剂）联合治疗的实验中
获得的。V-ATP酶的抑制导致溶酶体pH上升，反过来，使溶酶体在处理他们的货物，同时还损害其与自噬体融合[能力不太有效35，40?
]。图4B中提供的Western印迹分析的结果显示，当单独使用时，易瑞沙(吉非替尼)或巴非洛霉素A1增加了LC3（LC3-II）的
脂质化形式。当组合时，LC3-II的水平较高，表明自噬体在具有受阻的溶酶体功能的细胞中的积累。反过来，表明易瑞沙(吉非替尼)可增加
自噬通量。确认易瑞沙(吉非替尼)增强SKBR3细胞自噬通量的进一步数据如图4C和D所示。在3-MA的存在下，用易瑞沙(吉非替尼)治
疗细胞，在最后3小时的孵育中加入III类PI3K（形成早期自噬体[?35?]?所需的必需酶）抑制剂。HCA数据显示，在各种浓度的易
瑞沙(吉非替尼)存在下，3-MA显着（p<0.05）降低了平均MDCTOA/细胞（图4C）。Western印迹分析证实3-M
A在易瑞沙(吉非替尼)治疗的SKBR3细胞中降低LC3-II水平（图4D），表明抑制自噬。在MCF7-GFPLC3细胞中，在易瑞沙
(吉非替尼)治疗18小时后注意到p62的降低，这与LC3-II水平的浓度依赖性增加有关（图4E）。在这些细胞中也证实了自噬通量，
其功能测定监测GFPLC3的蛋白水解[?35?]。自噬体与溶酶体融合后，酸性水解酶降解自噬体及其含量，包括LC3。GFPLC3的G
FP部分更耐蛋白水解，并保持完整的延长的时间段，允许通过蛋白质印迹分析检测切割的GFP蛋白[?35?]。如图4E所示，易瑞沙(吉非
替尼)治疗的细胞中GFPLC3的蛋白水解降解的浓度依赖性增加是明显的。与易瑞沙(吉非替尼)治疗单独相比，切割的GFP的水平降低了3
-MA，巴非洛霉素A1和胃酶抑素A和E-64d（溶酶体抑制剂）（图4F）。HCA数据证实，在易瑞沙(吉非替尼)存在下，3-MA将
MCF7-GFPLC3细胞中细胞质GFPLC3的再分布减少到斑点（图4G，左图），并且巴非洛霉素A1以及溶酶体抑制剂增加平均GFP
LC3TOA/细胞（图4G，中，右图分别）。总的来说，这些结果表明易瑞沙(吉非替尼)影响控制自噬细胞器形成的过程，导致自噬通量
增加。巴非洛霉素A1和胃蛋白酶抑制剂A和E-64d（溶酶体抑制剂）与易瑞沙(吉非替尼)治疗单独相比（图4F）。HCA数据证实，在
易瑞沙(吉非替尼)存在下，3-MA将MCF7-GFPLC3细胞中细胞质GFPLC3的再分布减少到斑点（图4G，左图），并且巴非洛霉
素A1以及溶酶体抑制剂增加平均GFPLC3TOA/细胞（图4G，中，右图分别）。总的来说，这些结果表明易瑞沙(吉非替尼)影响控
制自噬细胞器形成的过程，导致自噬通量增加。巴非洛霉素A1和胃蛋白酶抑制剂A和E-64d（溶酶体抑制剂）与易瑞沙(吉非替尼)治疗单独
相比（图4F）。HCA数据证实，在易瑞沙(吉非替尼)存在下，3-MA将MCF7-GFPLC3细胞中细胞质GFPLC3的再分布减少
到斑点（图4G，左图），并且巴非洛霉素A1以及溶酶体抑制剂增加平均GFPLC3TOA/细胞（图4G，中，右图分别）。总的来说，
这些结果表明易瑞沙(吉非替尼)影响控制自噬细胞器形成的过程，导致自噬通量增加。3-MA降低细胞质GFPLC3在MCF7-GFPLC
3细胞中的再分布（图4G，左图），巴非洛霉素A1以及溶酶体抑制剂增加平均GFPLC3TOA/细胞（图4G，分别为中图和右图）
。总的来说，这些结果表明易瑞沙(吉非替尼)影响控制自噬细胞器形成的过程，导致自噬通量增加。3-MA降低细胞质GFPLC3在MCF7
-GFPLC3细胞中的再分布（图4G，左图），巴非洛霉素A1以及溶酶体抑制剂增加平均GFPLC3TOA/细胞（图4G，分别为
中图和右图）。总的来说，这些结果表明易瑞沙(吉非替尼)影响控制自噬细胞器形成的过程，导致自噬通量增加。图4易瑞沙(吉非替尼)诱导自
噬通量。EGFR沉默刺激自噬如果易瑞沙(吉非替尼)通过靶向EGFR活性诱导自噬，那么预期EGFR下调也会导致自噬诱导。为了测试这一
点，我们在SKBR3和MCF7-GFPLC3细胞中进行siRNA介导的EGFR沉默。EGFR的敲除导致SKBR3和MCF7-GFP
LC3细胞中EGFRmRNA水平降低（分别为0.16，0.02和0.19±0.04，相对于非沉默扰码siRNA表达为1;?图S3
A）。来自用扰频和EGFR特异性siRNA转染的SKBR3细胞的裂解物的Western印迹分析显示EGFR蛋白水平的有效下调（图5
）。尽管使用双重敲低程序沉默MCF7-GFPLC3细胞中的EGFR，但是仅获得了EGFR蛋白的部分降低（图5）。通过SKBR3和M
CF7-GFPLC3细胞（泳道1和3）中活化的AKT和ERK1/2水平的降低来证实EGFR敲低的功能。如在活化的S6水平所示，
mTOR途径的活性仅在SKBR3细胞中而不是在MCF7-GFPLC3细胞中降低，结果与mTORC1对这些细胞中易瑞沙(吉非替尼)的
不敏感性以及图3D中的数据一致。然而，EGFR敲除并不排除易瑞沙(吉非替尼)介导的下游靶向下调（泳道3和4）。EGFR敲除后自噬的
变化与增加的LC3-I/II相关，相对于加扰siRNA降低的p62水平和更高水平的切割GFP（MCF7-GFPLC3），表明E
GFR减少背景中自噬通量增加（泳道1和3）。仍然，如通过增加的LC3-II和切割的GFP（MCF7-GFPLC3）所显示的，与载体
处理的细胞（泳道3和4）相比，EGFR敲低并不阻止SKBR3或MCF7-GFPLC3细胞中的易瑞沙(吉非替尼)介导的自噬）。这些数
据表明，在我们的实验中实现的EGFR敲除增加了自噬通量，但是吉非他宁诱导的自噬程度差。图5siRNA介导的EGFR沉默对下游信号传
导和自噬的影响。BECN1和ATG7沉默对自噬和细胞活力的影响自噬是由ATG基因严格调控的过程。BECN1（ATG6）是参与早期自
噬体的形成[突出调节器12，35，41?]，和ATG7编码一种非经典的，同型二聚体E1酶参与在LC3-I脂化造成LC3-II-磷
脂酰乙醇胺的多步骤方法（PE）结合自噬体膜的[基本12，42?]。我们研究了BECN1和ATG7siRNA对用易瑞沙(吉非替尼)
治疗的吉非他滨敏感性SKBR3和易瑞沙(吉非替尼)不敏感的MCF7-GFPLC3细胞的影响，结果总结在图6中。回想一下，随着所示s
iRNA的敲低，qRT-PCR结果显示，相对于以1表示的非沉默对照siRNA的72小时mRNA表达相对于BECN1为0.07±0.
02，在SKBR3细胞中为0.24±0.02，ATG7为0.006±在MCF7-GFPLC3细胞中，BECN1和ATG7分别为0.
001和0.25±0.03（图S3B）。Western印迹分析证实了在SKBR3和MCF7-GFPLC3细胞中siRNA处理后蛋
白质水平下BECN1和ATG7的有效下调（图6A和D）。在没有和存在易瑞沙(吉非替尼)的情况下，分别在SKBR3和MCF7-GFP
LC3细胞中分别降低了LC3-II或切割的GFP相对于加扰的siRNA的BECN1和ATG7的自噬的抑制（图6A和D）。在支持下
，HCA数据显示，使用易瑞沙(吉非替尼)72小时治疗导致用BECN1或ATG7siRNA预处理的细胞中MDC阳性（SKBR3）或
GFPLC3阳性（MCF7-GFPLC3）细胞器的显着（p<0.05）（图6B和E）。另外在MCF7-GFPLC3细胞中，B
ECN1或ATG7敲低引起GFPLC3阳性细胞器基础水平的显着降低（p<0.05）（图?6E?）。HCA数据还显示，用BECN1
和ATG7siRNA预处理的SKBR3细胞中的自噬细胞器官细胞含量的减少与细胞活力丧失相关，可以通过与易瑞沙(吉非替尼)（72小
时）共同治疗进一步降低（图6C?;p<0.05）。相比之下，在MCF7-GFPLC3细胞中，BECN1或ATG7siRNA自
身没有降低生存力，并且在用易瑞沙(吉非替尼)治疗72小时后仅产生可忽略的作用（图6F）。与非沉默siRNA预处理的细胞相比，在9
6小时内通过双重敲低程序实现的对BECN1和ATG7siRNA的更长的暴露最小化相应蛋白质的表达也不影响载体或易瑞沙(吉非替尼)
处理的MCF7-GFPLC3细胞的活力（数据未示出）。这些结果表明，siRNA介导的早期自噬的抑制在SKBR3细胞中是细胞保护的，
但在MCF7-GFPLC3细胞中不是细胞保护的。与非沉默siRNA预处理的细胞相比，在96小时内通过双重敲低程序实现的对BECN1
和ATG7siRNA的更长的暴露最小化相应蛋白质的表达也不影响载体或易瑞沙(吉非替尼)处理的MCF7-GFPLC3细胞的活力（数
据未示出）。这些结果表明，siRNA介导的早期自噬的抑制在SKBR3细胞中是细胞保护的，但在MCF7-GFPLC3细胞中不是细胞保
护的。与非沉默siRNA预处理的细胞相比，在96小时内通过双重敲低程序实现的对BECN1和ATG7siRNA的更长的暴露最小化相
应蛋白质的表达也不影响载体或易瑞沙(吉非替尼)处理的MCF7-GFPLC3细胞的活力（数据未示出）。这些结果表明，siRNA介导的
早期自噬的抑制在SKBR3细胞中是细胞保护的，但在MCF7-GFPLC3细胞中不是细胞保护的。图6BECN1或ATG7敲低对SKB
R3和MCF7-GFPLC3细胞自噬和活力的影响。易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬通量在易瑞沙(吉非替尼)敏感和敏感细胞中的药理学抑制
作用接下来，我们调查了自噬的药理学抑制剂是否可以改善易瑞沙(吉非替尼)在敏感和不敏感的乳腺癌细胞中的功效。通过3-MA显着抑制载体
处理细胞中自噬基础水平的早期步骤（p<0.05），72小时后SKBR3（图7A和B）和MCF7-GFPLC3（图7C和D）细胞凋
亡增加。然而，在易瑞沙(吉非替尼)3-MA仅存在于SKBR3细胞但不在MCF7-GFPLC3细胞中的情况下，甚至当使用易瑞沙(吉非
替尼)和3-MA共同处理144小时（数据未显示）时，即使MCF7-GFPLC3细胞共同处理。感兴趣的是，在MCF7-GFPLC3细
胞中，3-MA单独或与易瑞沙(吉非替尼)组合引起S和G?2?/M区（图7C）。图7在易瑞沙(吉非替尼)存在下，3-MA使SKBR
3而不是MCF7-GFPLC3细胞致敏细胞死亡。相比之下，HCQ和巴非洛霉素A1在晚期抑制自噬有效地使SKBR3和MCF7-GFP
LC3细胞对易瑞沙(吉非替尼)敏感。HCQ是一种弱碱性，其积累在溶酶体中，并增加体内溶液pH值[?43?]。这，反过来，抑制溶酶体
货物的降解和禁用自噬过程[完成35，43?]。图8A显示在不存在或存在HCQ的情况下分别用易瑞沙(吉非替尼)治疗24小时，72小时
或168小时的易瑞沙(吉非替尼)敏感型（BT474）和易瑞沙(吉非替尼)不敏感细胞（JIMT-1和MCF7-GFPLC3）的活力数
据。选择每种细胞类型的不同时间点以反映这些细胞系的易瑞沙(吉非替尼)敏感性的差异。数据显示HCQ与易瑞沙(吉非替尼)组合（2。与单
独使用易瑞沙(吉非替尼)治疗的细胞相比，BT474细胞的生存力显着降低（p<0.05）（图8A，左图）。在用HCQ处理的JIM
T-1细胞中，当易瑞沙(吉非替尼)存在于5?10μM时，存活率的差异具有统计学显着性（p<0.05）（图8A，中图）。在MCF7
-GFPLC3细胞（图8A，右图）中，与易瑞沙(吉非替尼)治疗单独相比，5μM易瑞沙(吉非替尼)与HCQ的组合降低了活力，但是这仅
在168小时后才显现。我们的数据还显示，使用易瑞沙(吉非替尼)和HCQ组合治疗导致相对于单独治疗的BT474和JIMT-1细胞和M
CF7-GFPLC3（caspase-3缺陷型）细胞中caspase-7的活性增加（图8B）。这表明凋亡参与易瑞沙(吉非替尼)和H
CQ联合治疗的细胞。使用bafilomycinA1也证实了晚期自噬抑制的作用。图8C（左图）中的数据显示，使用易瑞沙(吉非替尼)
和巴非洛霉素A1（使用10和50nM）的组合进行72小时的治疗降低了SKBR3培养物中存活细胞的绝对数量，而不是单独使用任一种药物
（p<0.05））。这是伴随着在细胞凋亡中巴弗洛霉素A1的剂量依赖性增加，其中统计学显著（P<0.05）在增加分G?0?/
G?1个时，药物在相对组合使用到该级分和膜联蛋白V阳性细胞注意到易瑞沙(吉非替尼)或巴非洛霉素A1单独作用（图8C，中图和右图）。
在MCF7-GFPLC3细胞中，易瑞沙(吉非替尼)和巴非洛霉素A1组合的细胞毒作用明显较晚，因此在120h处理后获得了图8D所示的
数据。这些数据显示当bafilomycinA1与易瑞沙(吉非替尼)联合使用时，与活性细胞的绝对数量（图8D，左图）和细胞凋亡平行
增加相比，有显着差异（p<0.05）易瑞沙(吉非替尼)或bafilomycinA1单独（图8D，中图和右图）。通过蛋白质印迹分
析证实用易瑞沙(吉非替尼)和巴非洛霉素A1组合处理的SKBR3和MCF7-GFPLC3细胞中凋亡水平的增加，证明相对于单一药物组合
处理的细胞中胱天蛋白酶的活性更高（图8E）。总的来说，这些数据表明，HCQ或bafilomycinA1的溶酶体受损提高了易瑞沙
(吉非替尼)的疗效，这可能至少部分归因于胱天蛋白酶依赖性凋亡细胞死亡。图8HCQ和巴非洛霉素A1使易瑞沙(吉非替尼)治疗的细胞对细
胞死亡敏感。结合易瑞沙(吉非替尼)的HCQ可增强JIMT-1肿瘤的治疗反应在体外在呈现的数据图8表明由lysosomotrophi
c剂HCQ和巴弗洛霉素A1易瑞沙(吉非替尼)诱导的自体吞噬的抑制敏感的乳腺癌细胞系细胞死亡，不论易瑞沙(吉非替尼)的敏感性状态。为
了测试这种组合在体内的功效，用易瑞沙(吉非替尼)，HCQ或两种药物的组合治疗带有建立的易瑞沙(吉非替尼)不敏感JIMT-1肿瘤的动
物，每个作为口服管饲法进行治疗。图9A中总结的结果显示，在治疗的最后一天测量，以50至200mg/kg的剂量给药25天的HCQ
相对于载体而言不显着（p>0.05）降低JIMT-1肿瘤体积。所有剂量的HCQ耐受性良好，选择最高测试剂量的HCQ（200mg
/kg）进行组合研究。根据先前发表的结果，选择了100mg/kg易瑞沙(吉非替尼)的剂量[36?]。如图图9B，治疗JI
MT-1异种移植物的26天与易瑞沙(吉非替尼)或HCQ单独降低的平均肿瘤体积的仅22％和19％，相比于载体处理的动物（P>0.0
5）的肿瘤。值得注意的是，当易瑞沙(吉非替尼)与HCQ联合使用时，与载体治疗的对照相比，肿瘤体积减少58％（P<0.05）（图9
B）。尽管组合治疗的动物的肿瘤体积分别比易瑞沙(吉非替尼)和HCQ单一治疗平均降低47％和49％，但未达到统计学显着性（p>0.
05）。详细的动物健康监测数据（这里未报道）表明，吉非他滨和HCQ耐受性良好，无论药物是单独使用还是联合使用。报告的动物体重下降不
超过10±4％的最低点（平均值±SD）。这些结果表明，易瑞沙(吉非替尼)与晚期自噬抑制剂HCQ的组合对于延缓易瑞沙(吉非替尼)不敏
感JIMT-1肿瘤的生长是安全有效的。图9在?体内单独和与易瑞沙(吉非替尼)组合的HCQ功效。易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬通量是一
种可逆过程在这里描述的研究中使用的易瑞沙(吉非替尼)浓度包括在临床相关范围（?1μM）中的那些，但在某些情况下超过了患者血浆中可达
到的浓度。应当认识到，然而，在血液舱和肿瘤组织变化作为时间和峰药物水平的函数易瑞沙(吉非替尼)的浓度可以是高的很短的时间帧[?39
，44?]。不同于导致选择治疗抗性细胞亚群的机制，当癌细胞首先经受应激然后在去除应激时反转，可能会产生细胞保护反应，例如应激诱导的
自噬通量增加。这可能代表了在达到峰值血浆浓度的时期，靶细胞群体瞬时暴露于较高水平的药物的临床情况。也许更重要的是，如果细胞保护反应
是可逆的，那么这将对临床上如何使用自噬抑制剂有重要的影响。因此，我们评估了易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬通量的变化是否可逆。图10A
中显示的图像显示GFPLC3标记的细胞器在暴露于易瑞沙(吉非替尼)（上图）的MCF7-GFPLC3细胞中在3小时的时间内积累。然而
，易瑞沙(吉非替尼)除去后，GFPLC3标记的细胞器的水平回复到背景水平（图10A，下图）。用HCA方法进行的平均GFPLC3T
OA/细胞的定量显示在广谱的易瑞沙(吉非替尼)浓度下自噬体形成的可逆性（图10B）。此外，克隆形成数据显示，用易瑞沙(吉非替尼
)治疗3小时后除去药物后的细胞活力不受影响，表明通过短暂暴露于易瑞沙(吉非替尼)对细胞生长没有长期影响（图10C）。这些数据表明，
易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬是一种短暂的可逆反应。表明通过短暂暴露于易瑞沙(吉非替尼)对细胞生长没有长期影响（图10C）。这些数
据表明，易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬是一种短暂的可逆反应。表明通过短暂暴露于易瑞沙(吉非替尼)对细胞生长没有长期影响（图10C）
。这些数据表明，易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬是一种短暂的可逆反应。图10易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬是一个可逆过程。讨论靶向疗法
如曲妥单抗（TZ（赫赛汀））和拉帕替尼被批准用于治疗HER2阳性乳腺癌[?45，46?]，但内在和获得不敏感呈现一个重要的临床问题
[?47?-?50?]。在与众多化疗依次治疗晚期乳腺癌，“适者生存”的细胞能够存活在降低的遗传稳定性和长期改编感应治疗应力结果支持
耐药性[发展的选择51，52?]。因此，在产生抗药性的策略之前，可能比尝试在获得抵抗机制后治疗难治性癌症更有利。使用HCA，TEM
和分子分析，我们在本报告中表明，易瑞沙(吉非替尼)，一种EGFRTKI，刺激表型多样的乳腺癌细胞中自噬相关细胞器的出现。自噬后的
改变早在加入易瑞沙(吉非替尼)后45分钟就可见，这是与其他自噬诱导剂相当的时间框架[?40?]。GFPLC3迁移到自噬体和自噬相关
的MDC和LTR标记的细胞器的积累在易瑞沙(吉非替尼)加入3小时内达到相当的水平，伴随着这些细胞器之间的距离减小。易瑞沙(吉非替尼
)治疗细胞中自噬细胞器的出现与吉非他宁敏感的SKBR3和BT474细胞中EGFR，AKT，ERK1/2和mTORC1信号传导的
下调相关。在易瑞沙(吉非替尼)不敏感的MCF7-GFPLC3细胞中，易瑞沙(吉非替尼)介导的对EGFR，AKT和ERK1/2信
号传导的作用是适度的。这可以通过EGFR的低表达和HER2也可以决定在乳腺癌细胞中[易瑞沙(吉非替尼)的活动至少部分地进行说明7，
8?]。有趣的是，p70S6K，S6和4E-BP1的磷酸化在MCF7-GFPLC3细胞中保持不变，表明易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬
可能在该细胞系中与mTORC1不相关。为了支持这一点，已经显示各种各样的生长因子和细胞因子通过收敛于III型PI3K但不需要mTO
RC1的多种信号传导途径调节自噬[?53?]。这可以通过EGFR的低表达和HER2也可以决定在乳腺癌细胞中[易瑞沙(吉非替尼)的活
动至少部分地进行说明7，8?]。有趣的是，p70S6K，S6和4E-BP1的磷酸化在MCF7-GFPLC3细胞中保持不变，表明易瑞
沙(吉非替尼)诱导的自噬可能在该细胞系中与mTORC1不相关。为了支持这一点，已经显示各种各样的生长因子和细胞因子通过收敛于III
型PI3K但不需要mTORC1的多种信号传导途径调节自噬[?53?]。这可以通过EGFR的低表达和HER2也可以决定在乳腺癌细胞中
[易瑞沙(吉非替尼)的活动至少部分地进行说明7，8?]。有趣的是，p70S6K，S6和4E-BP1的磷酸化在MCF7-GFPLC3
细胞中保持不变，表明易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬可能在该细胞系中与mTORC1不相关。为了支持这一点，已经显示各种各样的生长因子和
细胞因子通过收敛于III型PI3K但不需要mTORC1的多种信号传导途径调节自噬[?53?]。S6和4E-BP1在MCF7-GFP
LC3细胞中保持不变，表明易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬可能在该细胞系中与mTORC1无关。为了支持这一点，已经显示各种各样的生长因
子和细胞因子通过收敛于III型PI3K但不需要mTORC1的多种信号传导途径调节自噬[53?]。S6和4E-BP1在MCF7-G
FPLC3细胞中保持不变，表明易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬可能在该细胞系中与mTORC1无关。为了支持这一点，已经显示各种各样的生
长因子和细胞因子通过收敛于III型PI3K但不需要mTORC1的多种信号传导途径调节自噬[53?]。此外，我们确定，在易瑞沙(吉
非替尼)处理的细胞自噬体更大含量增加自噬通量和不自噬体的积累的结果由于抑制自噬[的35，40?]。数据显示GFPLC3和MDC标记
的细胞器的积累伴随着LC3-II的上升和切割的GFP水平的升高以及易瑞沙(吉非替尼)治疗的细胞中p62的伴随减少。此外，3-MA引
起了减少，而bafilomycinA1和溶酶体抑制剂在易瑞沙(吉非替尼)治疗的细胞中引起自噬细胞器的进一步积累。通过TEM数据也
证实了在不同降解阶段含有细胞材料的自体吞噬体和自体支架的出现。这些数据表明易瑞沙(吉非替尼)在易瑞沙(吉非替尼)敏感和敏感的乳腺癌
细胞中诱导自噬。据我们所知，对于易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬的彻底调查尚未在乳腺癌中进行。然而，诸如TZ，拉帕替尼西妥昔单抗和其他
靶向药物已经显示出诱导乳腺癌自噬和这个过程有助于电阻的发展[17，19，21?]。易瑞沙(吉非替尼)和厄洛替尼EGFR酪氨酸激酶
的抑制也已显示能诱导自噬在非小细胞肺癌[?18，54?]和人外阴鳞状细胞癌阻断与西妥昔单抗诱导的自体吞噬的EGFR受体功能，结肠直
肠腺癌和头颈癌细胞[21?]。因此，我们的结果增加了越来越多的证据，显示针对EGFR受体家族成员的药物诱导自噬反应。为了研究易瑞
沙(吉非替尼)介导的自噬是否是EGFR特异性激酶抑制的结果，我们通过siRNA靶向EGFR。我们的数据显示，沉默EGFR增加SKB
R3和MCF7-GFPLC3细胞的自噬水平，从而证实其参与自噬。在考虑这些数据时，重要的是要注意EGFR的激酶依赖性（吉非非不敏感
）功能，已被证明通过维持基础细胞内葡萄糖水平在治疗剂和TKI存在下支持细胞存活[?55?]。在没有这种与激酶无关的功能下，发现细胞
经历自噬以补偿能量损失[?55?]。从而，敲除EGFR可能有助于通过降低EGFR酪氨酸激酶活性和总EGFR水平来诱导自噬。然而，在
易瑞沙(吉非替尼)的存在下，EGFR敲低细胞中的自噬进一步升高，如通过增加的LC3-II和切割的GFP和降低的p62水平所判断的。
Han等报道了类似的发现。他们表明EGFR沉默导致易瑞沙(吉非替尼)治疗的肺癌细胞中LC3-II表达增加[18?]。有趣的是，E
GFRsiRNA或易瑞沙(吉非替尼)对MCF7-GFPLC3细胞的自噬诱导与S6磷酸化的变化无关，提供了另外的证据，证明自噬可能
受到该细胞系mTORC1的机制的调节。意外的是，易瑞沙(吉非替尼)仍然能够减少EGFR敲低细胞中AKT和ERK1/2的磷酸化。
这可能是由于EGFR的不完全击倒，例如MCF7-GFPLC3，其中残留的EGFR酪氨酸激酶活性仍然可能对易瑞沙(吉非替尼)调节敏感
。可替代地，易瑞沙(吉非替尼)的EGFR-独立的效果，如抑制HER2的[7，8?]，或易瑞沙(吉非替尼)的次要目标[?11，56
?]可以有助于在下游信号的变化，特别是当易瑞沙(吉非替尼)在浓度使用≥1μM如在我们的EGFR敲除实验。因此，合理的假设EGFR
siRNA与易瑞沙(吉非替尼)介导的EGFR敲除细胞中AKT和ERK1/2信号传导的抑制作用产生的效应可能有助于增加自噬。其中
残留的EGFR酪氨酸激酶活性仍然可能对易瑞沙(吉非替尼)调节敏感。可替代地，易瑞沙(吉非替尼)的EGFR-独立的效果，如抑制HER
2的[7，8?]，或易瑞沙(吉非替尼)的次要目标[?11，56?]可以有助于在下游信号的变化，特别是当易瑞沙(吉非替尼)在浓度使
用≥1μM如在我们的EGFR敲除实验。因此，合理的假设EGFRsiRNA与易瑞沙(吉非替尼)介导的EGFR敲除细胞中AKT和ER
K1/2信号传导的抑制作用产生的效应可能有助于增加自噬。其中残留的EGFR酪氨酸激酶活性仍然可能对易瑞沙(吉非替尼)调节敏感。
可替代地，易瑞沙(吉非替尼)的EGFR-独立的效果，如抑制HER2的[7，8?]，或易瑞沙(吉非替尼)的次要目标[?11，56?
]可以有助于在下游信号的变化，特别是当易瑞沙(吉非替尼)在浓度使用≥1μM如在我们的EGFR敲除实验。因此，合理的假设EGFRs
iRNA与易瑞沙(吉非替尼)介导的EGFR敲除细胞中AKT和ERK1/2信号传导的抑制作用产生的效应可能有助于增加自噬。易瑞沙
(吉非替尼)的EGFR-独立的效果，如抑制HER2的[7，8?]，或易瑞沙(吉非替尼)的次要目标[?11，56?]可以有助于在下
游信号的变化，特别是当易瑞沙(吉非替尼)在浓度使用≥1μM如在我们的EGFR击倒实验。因此，合理的假设EGFRsiRNA与易瑞沙
(吉非替尼)介导的EGFR敲除细胞中AKT和ERK1/2信号传导的抑制作用产生的效应可能有助于增加自噬。易瑞沙(吉非替尼)的E
GFR-独立的效果，如抑制HER2的[7，8?]，或易瑞沙(吉非替尼)的次要目标[?11，56?]可以有助于在下游信号的变化，特
别是当易瑞沙(吉非替尼)在浓度使用≥1μM如在我们的EGFR击倒实验。因此，合理的假设EGFRsiRNA与易瑞沙(吉非替尼)介导
的EGFR敲除细胞中AKT和ERK1/2信号传导的抑制作用产生的效应可能有助于增加自噬。特别是当我们的EGFR敲除实验中使用浓
度≥1μM的易瑞沙(吉非替尼)时。因此，合理的假设EGFRsiRNA与易瑞沙(吉非替尼)介导的EGFR敲除细胞中AKT和ERK1
/2信号传导的抑制作用产生的效应可能有助于增加自噬。特别是当我们的EGFR敲除实验中使用浓度≥1μM的易瑞沙(吉非替尼)时。因
此，合理的假设EGFRsiRNA与易瑞沙(吉非替尼)介导的EGFR敲除细胞中AKT和ERK1/2信号传导的抑制作用产生的效应
可能有助于增加自噬。直接证据支持易瑞沙(吉非替尼)负责诱导自噬的事实来自实验，显示siRNA介导的BECN1和ATG7的沉默导致治
疗细胞中自噬细胞器的显着降低（p<0.05）。然而，仅在SKBR3细胞中，仅在易瑞沙(吉非替尼)存在下抑制BECN1和ATG7
siRNA的早期自噬增强，在MCF7-GFPLC3细胞中具有可忽略的作用，提示早期易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬具有细胞保护作用（p
<0.05）前者。类似地，阻断3-MA的早期自噬增强易瑞沙(吉非替尼)在SKBR3中的细胞毒性，但不增加MCF7-GFPLC3细
胞中的细胞毒性。对抑制早期易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬的这些细胞型特异性差异可能与自噬和凋亡之间的独特的串扰有关。涉及这种串扰的复
杂机制取决于细胞的遗传构成，尚未完全了解[57?]。可以推测，这种串扰通过引入替代的存活机制来拮抗凋亡途径，并降低在易瑞沙(吉非
替尼)治疗的MCF7-GFPLC3细胞中抑制早期自噬后细胞死亡的可能性。其他的研究报告在后期抑制自噬的好处与在替莫唑胺和伊马替尼治
疗恶性神经胶质瘤细胞[早期58，59?]。同样地，我们的研究结果表明，抑制HCQ和bafilomycinA1的晚期自噬是吉非他敏
敏感和敏感性乳腺癌细胞增加细胞死亡，涉及细胞凋亡的有效策略。这些结果表明，在自噬水平升高的情况下，完整的自噬通量对细胞存活至关重要
，并支持自噬在易瑞沙(吉非替尼)治疗细胞中的细胞保护作用。此外，我们推测，这种细胞保护可能部分地有助于维持易瑞沙(吉非替尼)对易瑞
沙(吉非替尼)不敏感细胞的天然抵抗（不敏感）。然而，它需要被承认，溶酶体剂可以发挥比自噬抑制[其他效果60，61?]这也可能有助于
致敏易瑞沙(吉非替尼)。同样重要的是要强调，当易瑞沙(吉非替尼)存在时，HCQ或bafilomycinA1会在浓度高于1μM（人
血浆中该药物的平均可实现水平））下使用时会产生细胞毒性作用，因此易瑞沙(吉非替尼)的离靶效应必须被认为是[7，8，11?]。然而
，高于1μM的剂量可能是治疗相关的，因为易瑞沙(吉非替尼)可能以高于血浆室中测量的浓度在肿瘤组织中累积[?39?]。更具体地说，在
接受250mg/天的日剂量的乳腺癌患者中，易瑞沙(吉非替尼)优先从血浆分布到肿瘤组织中，其可达到在血浆中测量的水平的42倍（平均
水平为16.7μM）[?39?]。重要的是，我们的报告体内表明，与媒介物治疗对照相比，易瑞沙(吉非替尼)与自噬抑制剂HCQ的组合在
抑制易瑞沙(吉非替尼)不敏感JIMT-1肿瘤生长方面比单一疗法更有效。这些数据与我们的体外结果一致，显示在存在HCQ的情况下JIM
T-1细胞对易瑞沙(吉非替尼)的敏化。虽然没有实现完全抑制JIMT-1肿瘤生长，但这可能是我们实验设计的结果，其中易瑞沙(吉非替尼
)和HCQ不以最大耐受剂量使用。相反，我们应用的剂量本身并没有产生统计学显着（p>0.05）的肿瘤体积减少，所以任何额外的组合效
果将是显而易见的。我们的结果令人鼓舞，因为在临床环境中口服给药HCQ。将需要未来的实验来证明含有较高剂量的易瑞沙(吉非替尼)和HC
Q的组合的作用。由于乳腺癌对EGFR靶向治疗的不敏感性提出了临床挑战，因此，确定易瑞沙(吉非替尼)与HCQ联合应用对易瑞沙(吉非替
尼)不敏感表型是否广泛有效是值得的。尽管如此，应该记住，HCQ的致敏效应在体内联合化疗可以从其作为自噬抑制剂[角色独立地出现43，
62?]。不过，我们的数据添加到越来越多的研究表明在组合使用HCQ与各种抗癌剂[的治疗增益29，31，43，63?]。这种方法目前
正在许多临床试验测试，包括集中于乳腺癌[研究31，32?]。值得注意的是，SKBR3和MCF7-GFPLC3细胞含有肿瘤抑制基因B
ECN1?[?64?]的单等位基因缺失，这是早期吞噬体形成的突出调节因子，在约40％的人类散发性乳腺癌中观察到[?65?]。然而，
也许最有趣的是，我们的体外数据显示，易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬的强度取决于药物浓度，并且自噬在去除药物时是可逆的（见图10）。在
患者中，药物浓度会随着时间的推移而改变，这是由药物的药代动力学驱动的。峰值浓度，随后在药物水平朝向稳定状态的降低（重复给药的期望的
目标）[?39，44?]。我们推测，在预期的早期细胞保护反应的峰值药物浓度下靶向自噬可以产生更好的细胞对自噬促进药物的敏感性。这将
需要自噬抑制剂，如HCQ，应以足以调节自噬作用药物高峰时自噬反应的浓度存在于肿瘤组织中。在我们的体外测定（20μM）中使用的浓度的
HCQ将难以在人体中实现，在重复的每日给药后在血浆中测量为1.5至3μM[?62?]。因此，开发新的有效的自噬抑制剂和利用药物递送
系统来优化这些药物在肿瘤部位的浓度应该是有益的。重复日常给药后血浆中测量5?3μM[62?]。因此，开发新的有效的自噬抑制剂和利
用药物递送系统来优化这些药物在肿瘤部位的浓度应该是有益的。重复日常给药后血浆中测量5?3μM[62?]。因此，开发新的有效的自噬
抑制剂和利用药物递送系统来优化这些药物在肿瘤部位的浓度应该是有益的。总之，这里提出的结果表明，基于易瑞沙(吉非替尼)和其他靶向药物
的治疗方案必须考虑其作为自噬调节剂的作用。虽然本研究的范围集中于由易瑞沙(吉非替尼)诱导的自噬，但预期靶向早期细胞保护反应将适用于
其他细胞保护机制和其他药物。在开发更有效的药物组合时，应在临床上考虑在乳腺癌背景下抑制这些细胞保护反应。支持信息图S1在用载体，
易瑞沙(吉非替尼)或他莫昔芬处理的SKBR3和MCF7-GFPLC3细胞中通过HCA方法定量自噬相关细胞器。（A）使用用载体或10
μM吉非他滨处理48小时的SKBR3细胞的INCell1000分析仪获得的代表性图像用溶瘤反应蛋白红（LTR）（红色）或MDC
（绿色）染色并用DRAQ5（蓝色）复染色染色。底图：载体（Veh）或易瑞沙(吉非替尼)（Gef）处理的细胞中用HCA获得的平均MD
CTOA/细胞（平均值±SD，n=6个重复孔）。（B）使用载体，20μM易瑞沙(吉非替尼)或用Hoechst33342（
蓝色）和LTR（红色）染色的10μM三苯氧胺处理48小时的MCF7-GFPLC3细胞的代表性图像。绿色标点代表GFPLC3标记的自
噬体，红色标记代表溶酶体，黄色点代表自体溶质。（TIF）图S2用易瑞沙(吉非替尼)治疗的MCF7-GFPLC3细胞中自噬相关细胞器
形成的动力学。用载体（0μM易瑞沙(吉非替尼)）处理的MCF7-GFPLC3细胞的代表性图像或用IN细胞1000获得的指示的易瑞沙
(吉非替尼)浓度.GFPLC3小组：对照细胞中的绿色背景代表弥漫性遍布细胞质的GFPLC3蛋白。随着时间的推移，GFPLC3染色变
得更加明确，并且在细胞中观察到标记自噬体膜相关LC3-II蛋白的位置的GFPLC3标记的细胞器（绿色点）。LTR面板：用Hoech
st33342（蓝核）和lysotracker红（LTR;红色点状）染色的MCF7-GFPLC3细胞的图像。MDC面板：在细胞质
中用DRAQ5（蓝色）和MDC（绿色点状突起）染色的MCF7-GFPLC3细胞的图像。（TIF）图S3通过qRT-PCR验证siR
NA介导的敲低。（A）在敲除后72小时收获的SKBR3细胞中的EGFRmRNA水平和在双重击倒后48小时收获的MCF7-GFPL
C3细胞中的EGFRmRNA水平。（B）SKBR3和MCF7-GFPLC3细胞中BECN1和ATG7mRNA水平在小鼠后72小
时收获。相对于表达为1的加扰非沉默siRNA对照，显示了（A）和（B）中每个指定基因的mRNA表达。每个数据点表示来自3个重复PC
R样品的平均值±SD。（TIF）致谢我们非常感谢DanaMasin，DitaStrutt和YoungJooYang与动物
工作和HongYan组织文化工作的帮助。我们感谢UBCBioImagingFacility的DerrickHorne准备T
EM块和获取TEM图像。资金报表这项工作由加拿大卫生研究所拨款＃106638，MOP78882和GPG102167资助。高收
入筛选设备得到了加拿大卫生研究院设备资助的支持。通过加拿大创新基金会获得的设备进行TEM成像。资助者在研究设计，数据收集和分析，决
定出版或准备稿件方面没有任何作用。文章来源：http://www.yiruishachina.com/a/news/50.htm
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